דגם פגם עצם הירך קריטית בגודל פשוט בעכברים

Summary

Animal models are frequently employed to mimic serious bone injury in biomedical research. Due to their small size, establishment of stabilized bone lesions in mice are beyond the capabilities of most research groups. Herein, we describe a simple method for establishing and analyzing experimental femoral defects in mice.

Abstract

While bone has a remarkable capacity for regeneration, serious bone trauma often results in damage that does not properly heal. In fact, one tenth of all limb bone fractures fail to heal completely due to the extent of the trauma, disease, or age of the patient. Our ability to improve bone regenerative strategies is critically dependent on the ability to mimic serious bone trauma in test animals, but the generation and stabilization of large bone lesions is technically challenging. In most cases, serious long bone trauma is mimicked experimentally by establishing a defect that will not naturally heal. This is achieved by complete removal of a bone segment that is larger than 1.5 times the diameter of the bone cross-section. The bone is then stabilized with a metal implant to maintain proper orientation of the fracture edges and allow for mobility.

Due to their small size and the fragility of their long bones, establishment of such lesions in mice are beyond the capabilities of most research groups. As such, long bone defect models are confined to rats and larger animals. Nevertheless, mice afford significant research advantages in that they can be genetically modified and bred as immune-compromised strains that do not reject human cells and tissue.

Herein, we demonstrate a technique that facilitates the generation of a segmental defect in mouse femora using standard laboratory and veterinary equipment. With practice, fabrication of the fixation device and surgical implantation is feasible for the majority of trained veterinarians and animal research personnel. Using example data, we also provide methodologies for the quantitative analysis of bone healing for the model.

Introduction

הערכה היא כי מחצית מאוכלוסיית ארה"ב חווה שבר בגיל 65 ^1. עבור אותם מטופלים עם שברים שטופלו בניתוח, 500,000 הליכים כרוכים בשימוש בשתל עצם ² ומספר זה צפוי לעלות עם הזדקנות אוכלוסייה יותר ויותר ³ . למרות שעצם הוא אחד מכמה איברים שיש את היכולת לרפא לחלוטין ללא צלקות, יש מקרים שבם התהליך נכשל ^3,4. בהתאם לנסיבות ולאיכות טיפול, 2-30% משברים בעצמות ארוכות ייכשלו, וכתוצאה מכך ^3,5 שאינו איגוד. אמנם יש עדיין ויכוח על ההגדרה, pseudoarthrosis, פציעות עצם הקריטיות בגודל או אי-איחוד בדרך כלל מתייחס לפגיעה שאינה נרפא במשך החיים הטבעיים של הנושא ^6. למטרות ניסוי, משך זה מתקצר לזמן הממוצע שנדרש להחלמה של פציעה עצם בגודל ממוצעת מלאה. נגעי עצם ללא איחוד להתרחש numסיבות erous, אך גורמים עיקריים כוללות טראומה קיצונית וכתוצאה מכך פער קריטי בגודל, זיהום, אנגיוגנזה עניה, שימוש בטבק, או יכולת osteoregenerative עכבות עקב מחלה או גיל ^7. גם אם מטופלים אינם איגודים בהצלחה, זה יכול לעלות בעודף של 60,000 $ להליך, בהתאם לסוג פציעה והגישות המועסקות ^8.

במקרים מתונים, השתלת עצם אוטולוגית מועסקת. אסטרטגיה זו כרוכה בהחלמה של עצם מאתר תורם והשתלה באתר של פציעה. בעוד גישה זו היא מאוד יעילה, הנפח של עצם תורם נגזרות זמין מוגבל וההליך כרוך ניתוח נוסף, שתוצאתו כאב מתמשך בחולים רבים ^9,10. בנוסף, היעילות של שתל עצם אוטולוגית תלויה של בריאותו של המטופל. תחליפי עצם עשויים מחומרים סינטטיים או עצם מגופות מעובד זמינים ^11-13 בשפע, אבל הם חהve מגבלות משמעותיות, כוללים נכסים עניים הידבקות מארח תאים, osteoconductivity המופחת, והפוטנציאל לדחייה חיסונית ^14. אין אפוא צורך דחוף בטכנולוגיות התחדשות עצם שבטוחות, יעילים וזמינות לציבור רחב.

היכולת שלנו לשפר את אסטרטגיות משובי עצם תלויה באופן קריטי על היכולת לחקות טראומת עצם חמורה בבעלי חיים בדיקה, אבל הדור והייצוב של נגעי עצם גדולים הוא מאתגר מבחינה טכנית. ברוב המקרים, טראומת עצם ארוך רצינית חיקתה בניסוי על ידי הקמת פגם שלא באופן טבעי לרפא. למרות שזה יכול להשתנות עם מינים ^15, זו מושגת על ידי הסרת קטע עצם שהוא גדול יותר מ -1.5 פעמים הקוטר של עצם החתך ¹⁶ מלאה. העצם מכן התייצב עם שתל מתכת כדי לשמור על כיוון נכון של קצות שבר ולאפשר לניידות. בשל גודלם הקטן והשברירי שלהעצמות הארוכות שלהם, הקמת כזה נגעים בעכברים הן מעבר ליכולות של רוב קבוצות מחקר. ככזה, מודלים פגם עצם ארוך מוגבלים לחולדות ובעלי חיים גדולים יותר. עם זאת, עכברים יעניקו יתרונות משמעותיים במחקר שהם יכולים להיות מהונדסים גנטיים וגדלו כזנים שנפרץ חיסון שלא לדחות תאים ורקמות אנושיים.

עבור יישומים מבוססי תאים אנושיים, עכברים שנפרץ חיסון הם אטרקטיביים לעבוד איתו כי הם מבחינה פיזיולוגית מאופיינים היטב, קל לבית, חסכוני, בקלות ובנתח radiologically והיסטולוגיה. חשיבות עליונה הוא שעכברים שנפרץ חיסון לא דוחים תאים ממינים שונים כולל בני אדם. גודלם הקטן מאפשר גם הבדיקה של מספרים קטנים מאוד של תאים או כרכים של פיגומים ניסיוניים ביישומים אורטופדיים. כמה מודלים עכבריים אורתופדים כבר דיווחו כי להרשות לעצמו דרגות שונות של יציבות עצם ^17,18. תוכנה לאלהms המוביל לרמות גבוהות מאוד של יציבות, כגון תופסנים חיצוניים וצלחות נעילה בעיקר לרפא על ידי התאבנות intramembranous למרות ריפוי endochondral דווח ^19. בניגוד לכך, אלה המאפשרים כמה מיקרו ו / או מקרו-תנועה, כגון אלה המעסיקים סיכות לשדיות מבולבלות או חלקי-קבועות, בדרך כלל לרפא עם דומיננטיות של התאבנות endochondral ^20,21. איגוד מושהה או פגמים שאינם איחוד של עצם ארוך הם קשה במיוחד להשגה בעכברים עקב הרמה נוספת של ייצוב הנדרשת. עם זאת, מספר גישות כבר דיווחו, כולל סיכות לשדיות עם ציפורני לובים, צלחות נעילה ותופסנים חיצוניים ^22. מערכות אלה בדרך כלל עובדים היטב, אבל בהתחשב בעיצוב המסובך שלהם הם יכולים להיות מאתגרים מבחינה טכנית להתקנה. לדוגמא, גרסיה et al. ²³ המציא מערכת סיכה שלובים אלגנטית לשימוש בעכברים, אבל ההליך כרוך חתכים בשני אתר נפרדים ושינוי נרחב של עצם הירך כדי להכיל את הסיכות. נהלים אלה בוצעו תחת מיקרוסקופ לנתח.

במסמך זה, אנו מתארים סיכה לשדית הירך פשוטה עם צווארון מרכזי שנועד למנוע סגירת גירעון עצם 3 מ"מ וגם להתוות את הקצוות המקוריים של הפגם. בעוד הסיכה לא הייתה קבועה לעצם עצמו, לשינוי גודל מדויק של קוטר הסיכה וreaming של תוצאות החלל הלשדיות בהתערבות מספיקה כדי למזער תנועת torsional (איור 1). עם בחירה זהירה של גיל טהור, מגדר ועכברים בהתאמה מתח, התוצאה היא שאינו uniondefect hypertrophic מאוד לשחזור ²² ניתן יהיה להעריך בקלות radiologically. יתר על כן אזורים של עניין יכולים להיות מוגדרים reproducibly לאחר טומוגרפיה-מחושב מיקרו (μCT) למדידת דה נובו היווצרות עצם ופרמטרי histomorphological. הסיכות היו prototyped במעבדה שלנו תוך שימוש בכלים זמינים.

איור 1: עיקרון ניסויי סיכום תרשים של מודל הפגם המגזרי.. קטע 3 מ"מ המרכזי של עצם ירך עכברית 9-10 מ"מ הוא נכרת בניתוח (משמאל). צינור פלדה כירורגית ארוך 3 מ"מ, 19 מד הוא חלף על פני מ"מ ארוך 9, 22 צינור הנירוסטה G וקבוע עם דבק במרכז המדויק (מימין). סיכת התוצאה היא מצויד לתוך התעלות הלשדיות של החלקים הפרוקסימלית ודיסטלי הנותרים של עצם הירך עם 19 צווארון G החלפת קטע 3 מ"מ של עצם (להלן, במרכז).

Protocol

הערה: פרוטוקול זה מיועד לעכברי עירום נשיים (נו / J) (18-25 גרם, 6 שבועות) שנרכשו ממעבדות ג'קסון. מאחר שזנים של עכברים להשתנות מעט במונחים של אנטומיה וקצב צמיחה, אנו ממליצים כי הייצור של סיכות הוא מותאם לזן, המין והגיל של המקבלים לפני השתלה לנושאים חיים. אם הזנים מותאמים בקפ…

Representative Results

עכברים בדרך כלל להתאושש תודעה ואחורית-איבר ניידות 5-10 דקות לאחר הנסיגה של הרדמה. במהלך 5 הימים הראשונים, רצוי לבית עכברים בנפרד ולהציג את ההעשרה סביבתית כדי למנוע שימוש יתר בגפיים. לצורך כך, קיני איגלו הסוג להפחית את הצורך בבניית קן ולעודד מנוחה. יש לנו גם ציינו כי אספק?…

Discussion

בזאת, אנו מתארים שיטה פשוטה כדי ליצור פגם-התייצב סיכה קריטית בגודל של עצם הירך העכברית באמצעות מעבדה סטנדרטית וציוד וטרינרים. בעוד ההרכבה של הסיכות וההליך הכירורגי עצמו דורש תרגול, זה גם בתוך את היכולות של מדען מאומן היטב ביו-רפואי או מחקר וטרינר.

<p class="jove_content" style=";t…

Materials

Name of Equipment/Material*	Company	Catalog or model	Notes
Pin Assembly
Dremel rotary tool	Dremel	8220	or equivalent
Heavy duty cut off wheel	Dremel	420
Surgical tubing 19G	Small Parts (Amazon)	B000FMZ8LY	OD 1.07mm, ID 0.889mm
Surgical tubing 21G	Small Parts (Amazon)	B000FMZ8YQ	OD 0.82mm, ID 0.635mm
Surgical tubing 22G	Small Parts (Amazon)	B000FMYLZS	OD 0.719mm, ID 0.502mm
Surgical tubing 23G	Small Parts (Amazon)	B000FN0SY0	OD 0.643mm, ID 0.444mm
Cyanoacrylate adhesive	Loctite	1365882
Emery disc	Dremel	413
Rubber polishing point	Dremel	462
Felt polishing disc	Dremel	414
Gelatin sponge	Surgifoam/Ethicon	1974
Punch biopsy cutter	Miltex	33-34
Surgery/post-operative
Warm pad and circulator pump	Stryker/Thermocare	TP700, TP700C, TPP722
Coverage quaternary spray	Steris	1429-77
Bead sterilizer	Germinator/CellPoint Scentific	Germinator 500
Anesthesia system	VetEquip Inc	901806 or 901807/901809
Isofluorane anesthetic	VETone/MWI	501017, 502017
Surgical disinfectant	Chloraprep/CareFusion	260449
Surgical tools	Fine Science Tools	various	recommend German made
Face protection	Splash Shield	4505
Rechargable high speed drill	Fine Science Tools	18000-17
Diamond cutting wheel	Strauss Diaiond	361.514.080HP
Absorbable sutures	Covidien	UM-213
Outer sutures	Ethicon	668G	or equivalent
Vetbond	3M	1469SB	or equivalent
Hydration gel	Clear H2O	70-01-1082
Diet gel	Clear H2O	72-01-1062
Buprenorphine	Reckitt and Benckser	12496-0757-01	controlled substance
Mouse igloos	Bio Serv	K3328, 3570,3327
Euthanasia cocktail	Euthasol/Virbac	710101	controlled substance
Analysis
Live animal imager	Orthoscan	FD Pulse	or equivalent
Micro-CT unit and software	Bruker	Skyscan1174	or equivalent
Sealing film/Parafilm M	VWR or Fisher	100501-338, S37441
*Generic sources are suitable for all other items such as gause, drapes, protective clothing, animal care equipment.