Abstract
Gener med vigtige roller i udvikling har ofte rumligt og / eller tidsmæssigt begrænsede ekspressionsmønstre. Ofte er disse gentranskripter bliver ikke fundet eller er ikke identificeret som differentielt udtrykt (DE) i transkriptomisk analyser af hele planten organer. Laser mikrodissektions RNA-Seq (LM-RNA-Seq) er et kraftfuldt værktøj til at identificere gener, der er DE i bestemte udviklingsmæssige domæner. Men valget af cellulære domæner microdissect og sammenligne, og nøjagtigheden af de microdissections er afgørende for succes i forsøgene. Her to eksempler illustrerer design overvejelser for transcriptomics eksperimenter; en LM RNA-seq analyse for at identificere gener, der er DE langs majs blad proximal-distal akse, og et andet eksperiment for at identificere gener, der er DE i liguleless1-R (LG1-R) mutanter sammenlignet med vildtype. Centrale elementer, som bidrog til succes for disse eksperimenter blev detaljeret histologiske og i situ-hybridisering analyser af regionen, der skal analyseres, udvælgelse af blad primordier ved ækvivalente udviklingsstadier, anvendelse af morfologiske landmærker at vælge regioner for mikrodissektion, og mikrodissektion af netop målte domæner. Dette dokument indeholder en detaljeret protokol til analyse af udviklingsmæssige domæner ved LM RNA-Seq. De data, der præsenteres her illustrerer, hvordan den er valgt til mikrodissektion region vil påvirke de opnåede resultater.
Introduction
Majs blad er en ideel model til at studere dannelsen af udviklingsmæssige felter under morfogenese, da det har en tydelig grænse mellem bladet og hylsteret, der er modtagelig for genetisk dissektion (figur 1A). I de tidlige stadier af blad udvikling, en lineær bånd af mindre celler, den preligule bånd (PLB), opdeler bladet primordium i præ-bladet og præ-kappe domæner. En frynse-lignende Skedehinden og trekantede bladflige udvikler fra PLB (figur 1A, C, D). Genetiske skærme har identificeret mutationer, der forstyrrer blad-kappe grænsen. For eksempel recessiv liguleless1 (LG1) mutationer slette Skedehinden og bladflige 1, 2, 3, 4 (figur 1 B). In situ hybridisering afslørede, at LG1 transkript akkumuleres på PLB og nye Skedehinden, hvilket gør den til en fremragende markør for Skedehinden udvikling 5, 6 (figur 1E).
Figur 1: Vildtype og liguleless1-R majsblade. (A) Blade-kappe grænseområde af modent blad vildtype viser Skedehinden og øremuslingen strukturer. (B) Blade-kappe grænseområde af modent liguleless1-R blad viser fravær af skedehinde og øremuslingen strukturer. Blade i A og B er blevet skåret i halve langs midtribbe. (C) Længdesnit gennem vildtype blad primordium. Prøve er blevet behandlet og farvet for histologisk analyse. Den initierende Skedehinden fremgår som en bule rager frem fra planet af bladet (pilespids). (D) Langsgående sektion gennem vildtype blad primordium. Prøve er blevet forarbejdet til LM som beskrevet i teksten. Arrowhead indikerer indlede Skedehinden. (E) LG1 in situ hybridisering af skudspidsen laterale langsgående sektion. Stjerner angiver LG1 transkript akkumuleres mindst PLB af P6 blad primordium. Pile angiver base af P6 primordium. Bar indikerer måling fra bunden af primordium til PLB. Scale barer i A og B = 20 mm. Scale barer i CE = 100 um. Dette tal har været ændret siden henvisning 6 (Copyright American Society of Plant Biologer). Klik her for at se en større version af dette tal.
I denne undersøgelse blev LM RNA-Seq anvendes til at identificere en suite af gener, som udtrykkes forskelligt (DE) på blad-skede grænse i forhold til andre dele af bladet primordium og til IDE ntify gener, som er DE i LG1-R-mutanter i forhold til vildtype-søskende. LM RNA-Seq er en fremgangsmåde til kvantificering transkript akkumulering i specifikke celler eller cellulære domæner 7. LM systemer kombinerer en laser og et mikroskop med et digitalt kamera. Sektioneret væv er monteret på objektglas og set gennem mikroskopet. LM software omfatter typisk tegning værktøjer, der giver brugeren mulighed for at skitsere nogen valgte område for mikrodissektion. De laser skærer langs linjen, og den valgte væv slynget væk fra dias og ind i et rør ophængt over dias. LM tillader brugeren at microdissect præcise domæner, herunder specifikke cellelag og endda enkeltceller 8, 9. RNA kan derefter ekstraheres fra mikrodissekeret væv. Efterfølgende RNA-Seq komponent anvender næste generations sekventering til sekventering cDNA-biblioteker genereret fra det ekstraherede RNA 10,= "xref"> 11.
Vigtige fordele ved LM RNA-seq er evnen til at kvantificere transkript akkumulering i præcist definerede domæner og kapaciteten til at profilere hele transkriptom samtidigt 7. Teknikken er særligt velegnet til sondering tidlige udviklingsmæssige begivenheder, hvor området af interesse er ofte mikroskopisk. Tidligere undersøgelser har anvendt LM kombineret med microarray teknologi til at studere udviklingsprocesser i planter 9, 12, 13. RNA-Seq har den fordel, at kvantificere transkripter over et bredt dynamisk område, herunder lav-udtrykte gener, og forud sekvensinformation er ikke påkrævet 10, 11. Desuden LM RNA-Seq har potentiale til at fremhæve udviklingsmæssigt vigtige gener, der kan være savnet i mutagenese-skærme skyldes genetiske redundans eller for dødelighed af tabet-of-funktion mutant.
Udviklingsmæssigt vigtige gener, såsom snævre sheath1 (NS1) og skålformet cotyledon2 (CUC2), har ofte specifikke ekspressionsmønstre af blot én eller nogle få celler 17, 18, 19, 20. Mange udtrykkes kun i de tidlige udviklingsstadier og ikke i det modne organ. Når hele organer eller store domæner analyseres, er disse celle-specifikke udskrifter fortyndet og kan ikke påvises i mere traditionelle analyser. Ved at tillade analyser af præcist definerede domæner, LM-RNA-Seq muliggør disse vævsspecifikke gener kan identificeres og kvantificeres.
Afgørende faktorer i succes eksperimenterne beskrevet her var en grundig histologisk analyse, der guidede Valget af den passende udviklingsstadiet og domæne til analyse, og præcis overvånt af celle-væv domæner for LM. For at sikre, at tilsvarende domæner blev udtaget for alle replikater, blev væv opsamlet fra blad primordier på samme udviklingstrin og Mikrodissekterede domæner blev målt i forhold til morfologiske vartegn såsom den nye Skedehinden (figur 2). Det er kendt, at nogle gener udtrykkes i en gradient fra spidsen til bunden af bladet. Ved at måle præcise domæner, variation som følge af prøvetagning fra forskellige steder langs bladet proksimale-distal akse blev holdt på et minimum (figur 3A). Ved microdissecting domæner af samme størrelse, at variation som følge differentiel fortynding af cellespecifikke transkripter blev også reduceret (figur 3B). Laterale langsgående sektioner af skudspidsen blev anvendt til alle microdissections. Disse er sektioner, der er vinkelret på midtribbe-margin akse (figur 4). Brug kun dele, der omfatter SAM sikrer, at tilsvarende laterale regionerleaf primordier analyseres.
I prøver behandles og sektioneret for LM, den første morfologiske tegn på Skedehinden udvækst er et bump på adaxial side grundet periclinal celledelinger i adaxial epidermis (Figur 1D, figur 2). Det blev fastslået, at den spirende Skedehinden kunne identificeres pålideligt ved plastochron 7 trin blad primordier. Vi var interesserede i gener udtrykt i hele Skedehinden regionen, herunder den nye Skedehinden og cellerne umiddelbart distale, der vil danne ydre øre. For at sikre, at ækvivalente væv markeringer blev foretaget, blev Skedehinden bump anvendes som en morfologisk milepæl og et 100 um rektangel centreret på Skedehinden bump blev udvalgt til LM (figur 2A, 2B). Ækvivalente mellemstore rektangler af pre-bladet og præ-skede blev udvalgt fra de samme blade primordier.
Analyser af liguleless mutantplanter præsenteret en anden ChalleNSÆ; LG1-R-mutanter ikke danner en Skedehinden, derfor denne morfologiske træk kunne ikke anvendes til at vælge det område for LM. I stedet blev domænet for LG1 transkript akkumulering i vildtype blad primordier bestemt, og en region, der skulle omfatte dette domæne blev defineret. Disse foreløbige analyser blev udført på frøplanter fra samme plantning som blev anvendt ved den endelige analyse, da tidligere arbejde har vist, at placeringen af PLB varierer afhængigt af vækstbetingelserne. In situ hybridisering er angivet, at LG1 transkripter ophobes i PLB af P6 blad primordier (figur 1E). Vi valgte et domæne 400-900 um fra bunden af bladet primordier der omfattede domænet af LG1 ekspression (lilla rektangler, figur 2A) og fanget disse ækvivalente regioner fra vildtype og LG1-R planter. For at minimere variation i genetiske baggrund og vækstbetingelser, når man sammenligner transcript akkumulering i LG1-R og vildtype-planter, segregerende familier af mutanter og vildtype-søskende blev anvendt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
BEMÆRK: Fix væv til histologisk analyse på samme tid, at væv fastsættes for LM. Undersøg farvede sektioner for morfologiske træk, som vil guide senere LM. Når man sammenligner mutant med vildtype-, udføre in situ hybridisering eller immunlokalisering at definere det domæne, hvor genet af interesse udtrykkes (i dette tilfælde LG1).
1. Tissue Fiksering og Behandling
- Grow lejligheder på majs kimplanter til to uger gamle under standardbetingelser 6.
- Dissekere skyde spidser til laterale sektioner (Figur 4).
- Excise kimplante lige under jorden linje.
- Brug af et barberblad, fjerne tynde skiver fra bunden af stilken (snit 1, figur 4A), indtil en oval af culm omkranset af en eller to modne blade er synlig (figur 4B).
- Foretag en anden cut ca. 10 mm over bunden (afskårne 2, figur 4A).Denne 10 mm segment vil indeholde SAM og unge blade primordier.
- Drej 10 mm segment, så bunden vender opad. Gøre to snit parallelt med den laterale akse, således at et udsnit af væv 2-3 mm tykt opnås (udskæringer 3 og 4, figur 4B). Kassér de yderste to portioner og fastholde den centrale skive for fiksering og forankring.
BEMÆRK: Ydre blade kan trimmes og kasseres.
- Fix væv og proces til indlejring.
- Sikre, at alle materialer, der skal anvendes i efterfølgende trin er RNase-frit. Behandl løsninger med diethylpyrocarbonat (DEPC) (1 ml DEPC per liter opløsning. Inkuber natten over under lejlighedsvis omrystning, og autoklaven). Bage glasvarer i en ovn ved 200 ° C eller højere i mindst 6 timer og behandle plast ware med RNase dekontaminering opløsning.
- Dag 1: Fordyb vævssnit i ~ 10 ml landbrugerens fix (3: 1 Ethanol: Eddikesyre) i hætteglas på is. Når alle prøver er dissekeret, gælder vacuum for at fjerne luftbobler og penetration hjælp af fiksativ. Hold under vakuum i 10 minutter og derefter frigive vakuum langsomt. Erstat fiksativ og inkuberes ved 4 ° C natten over med forsigtig omrystning.
- Dag 2: Der inkuberes i følgende serie af opløsninger, ~ 10 ml hver, 1 time hver, alle med forsigtig omrystning; 85% ethanol ved 4 ° C, 95% ethanol ved 4 ° C, 100% ethanol ved 4 ° C, 100% ethanol ved 4 ° C, 100% ethanol ved 4 ° C, 1: 1 ethanol: xylener ved stuetemperatur, 100% xylener ved stuetemperatur, 100% xylener ved stuetemperatur.
BEMÆRK: Xylener er giftig ved kontakt og indånding. Arbejde i et stinkskab og bruge egnede handsker. - Tilføj paraffin væv indlejringsmedium pellets til ca. halvt volumen xylener og inkuberes natten over ved stuetemperatur under forsigtig omrystning.
- Dag 3: Overfør hætteglasset til 60 ° C varm ovn, indtil de pellets smelte. Hæld opløsningen og erstatte med frisk smeltet væv indlejring medium. Skift medium to gange merei løbet af dagen.
- Dag 4: Skift væv indlejring medium gang om morgenen. Retur til 60 ° C ovn, indtil eftermiddag.
- Cast blokke
- Placer indlejring forme på varmeplade af væv indlejring station. Brug pincet til at overføre vævsprøver til indlejring forme med skærefladen nedad. Fyld formen med smeltet paraffin og anbring indlejring ringen på ovenpå formen. Overførsel til en kold plade indtil paraffin er størknet. Opbevar paraffinblokke ved 4 ° C i en lufttæt beholder med silicagel.
2. Skæring og Slide Forberedelse
- Skær 10 um snit på en mikrotom 25.
- Undersøg bånd og vælg median sektioner. Median sektioner er dem, der omfatter SAM, der vises som en kuppel af celler omgivet af blade primordier.
- Mount afsnittene om dias.
- Placer dias, der er egnet til LM (enten RNase gratis ellerbagt) på 42 ° C slide varmere og anvende nogle dråber 50% ethanol løsning til at dække dias.
- Float afsnit om ethanolopløsning indtil sektionerne har udvidet.
BEMÆRK: Flydende sektioner på ethanol løsning i stedet for vand holder RNA i en udfældet tilstand reducere RNA-nedbrydning. - Vip dias og fjerne overskydende ethanol løsning ved aspiration med en disponibel overførsel pipette. Brug fnugfri klude til at væge væk yderligere ethanol løsning.
- Tørre objektglas ved 42 ° C i flere timer eller natten over. Store glider ved 4 ° C i en lufttæt beholder med silicagel.
- Afparaffiniser glider på dagen for brug.
- Forbered tre glas Coplin-skåle, der indeholder; 100% xylener (xylener I), 100% xylener (xylener II) og 100% ethanol (~ 50 ml af hver opløsning).
- Brug af rene pincet til at overføre objektglas, nedsænke objektglassene i xylener I i 2 min, xylener II i 2 minutter, og 100% ethanol i 1 minut.
- Drain gledes på fnugfri klude og lufttørre ved stuetemperatur.
3. mikrodissektion af Blade, skedehinde og kappe Prøver fra Plastochron 7 Leaf Primordia
- Fastgør objektglassene på scenen af LM mikroskop. Brug fem eller seks dias for hver gentagelse, udnytte fem sektioner pr dias.
BEMÆRK: Væv samle for en enkelt replikat er illustreret i figur 5. - Undersøg dias og identificere de fem mest median sektioner på hver dias, ved hjælp af SAM apex som det centrale referencepunkt.
BEMÆRK: Dette kan gøres ved lav forstørrelse, normalt en 5X målsætning er tilstrækkelig. - Brug 10X eller 20X objektiv, identificere placeringen af skedehinde på plastochron 7 blad primordium af hvert afsnit. Skedehinden vil være synlig som en bule rager ud fra adaxial overflade af bladet primordium. Markér denne position ved hjælp af tegning værktøj af LM software; vælge ikonet blyant, flytte markøren til den relevante positipå og klik og træk med musen for at tegne.
BEMÆRK: En 10X eller 20X er hensigtsmæssig for dette og efterfølgende trin. Ved brug af laterale afsnit vil de to sider af hvert blad primordium være til stede i hvert afsnit (figur 2A). - Brug linealen værktøjet og rektangulære tegneværktøj, måler 100 um høje rektangler centreret om Skedehinden af hvert afsnit (røde rektangler, figur 2a, 2b). Disse vil være den "Skedehinden" prøve.
- For at bruge lineal værktøj; vælge ikonet hersker, flytte markøren til den ene ende af det objekt, der skal måles, skal du klikke og trække for at måle objektet. Længden af linealen vises på skærmen.
- For at tegne et rektangel; vælge ikonet rektangel, flytte markøren til et punkt, som vil være et hjørne af rektanglet, klikke og trække for at tegne et rektangel i den rigtige størrelse. Alternativt kan du vælge den rette linje tegneværktøj og tegne fire rette linier.
- Mål 100 um rektangler anbragt 50 um over og under "Skedehinden" rektangel.
BEMÆRK: Disse vil være "Blade" og "kappe" prøver, henholdsvis (grøn og blå rektangler, figur 2a, 2b). Baseret på vores histologiske data, en 100 um rektangel omfatter hele Skedehinden regionen. Ækvivalente mellemstore portioner af klinge og skede blev valgt for at sikre, at tilsvarende mængder af væv blev indsamlet for hver. Afstandsstykker på 50 um blev brugt til at sikre, at ingen Skedehinden region væv uforvarende er inkluderet i bladet eller kappe microdissections.
- Microdissect målte rektangler (figur 2D - 2F) 7, 8, 9, indsamling skedehinde, Blade og kappe prøver i separate rør. Brug laserskårne funktionen til at skære gennem sektionen væv langs omridset af den valgte domæne. Brug catapult funktion til at fremdrive rektanglet af væv fra objektglasset og ind i låget af røret (figur 2D - 2F).
4. mikrodissektion af Blade, skedehinde og Skede Adaxial Epidermale Prøver fra Plastochron 7 Leaf Primordia
- Vælg sektioner og bruge lineal værktøj til at måle 100 um høje segmenter centreret om plastochron 7 Skedehinden, som beskrevet i afsnit 3 (ovenfor).
- Vælg kun de adaxial epidermale celler af hver 100 um høj "Blade" og "Skede" segment (grøn og blå markeringer, figur 2C) ved at skitsere med tegningen værktøj. Epidermis er den ydre cellelag; den adaxial side er den tættest på SAM.
- For "Skedehinden" prøve, kun vælge cellerne i spirende Skedehinden bump som beskrevet i afsnit 3.3 (rød markering, figur 2C).
- Microdissect udvalgte regioner, indsamling Blade, Skedehinden og Sheath epidermis prøver i separate rør, som beskrevet i afsnit 3.5.
5. mikrodissektion af Plastochron 6 Leaf Primordia fra LG1-R og Wild-type Søskende
- Grow segregerende familier af mutant (LG1-R) og vildtype-planter.
- Fix og proces skyde spidser til LM, som beskrevet i afsnit 1.2-1.4. Fix vildtype og mutant skyde toppunkter i separate hætteglas for at holde dem adskilt. Prøver fra samme plantning bør fastsættes og behandles for in situ hybridisering.
- Bestem hvor LG1 transkriberes i vildtype-søskende, ved at udføre LG1 in situ hybridisering 6, 26, 27. Mål stilling LG1 udskrift ophobning fra bunden af blade primordium i flere prøver (figur 1E).
- Baseret på situ hybridisering dataene i, vælge portion blad primordium som omfatter det område, hvor LG1 transkriberes. I dette tilfælde, 400-900 um fra bunden af plastochron 6 blad primordier (lilla rektangler, figur 2A).
- Microdissect valgte del af blad primordier, som beskrevet i afsnit 3.5, indsamle LG1-R og vildtype prøver i separate rør.
6. Anvend RNA Extraction Buffer
- Påfør 50 pi RNA-ekstraktion buffer til mikrodissekeret væv og fortsætte med RNA-ekstraktion. Fortsæt med RNA-ekstraktion, RNA-amplifikation, bibliotekskonstruktion, sekventering og bioinformatik analyse som beskrevet i reference 6.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Brug af LM ordning skitseret i figur 2, ca. 1,000,000-1,500,000 um 2 af væv blev indsamlet for hver replikere i alle-celle-lag LM (figur 5), og 200.000 um 2 per replikere for adaxial epidermis LM. Ca. 2.500.000 pm2 af væv blev indsamlet for hver replikere i LM af LG1-R og vildtype-leaf primordier. To runder af lineær RNA amplifikation gav mikrogram mængder af RNA til hver gentagelse. Mængden af RNA opnået fra en given mikrodissektion vil afhænge af cellestørrelse og transkriptionel aktivitet, såvel som mængden af væv fanget. Integriteten af RNA vil påvirke effektiviteten af RNA-amplifikation.
Udskrift ophobning blev analyseret i alle cellelag af bladet, skedehinde og kappe regioner og i alt 2359 DE genes blev fundet, med en falsk opdagelse sats (FDR) på <0,05 (figur 6A). Specifikt 1,714 gener var DE mellem Skedehinden og klinge, 1.044 gener var DE mellem Skedehinden og skede, og 657 gener var DE mellem kniven og kappe (nogle gener er DE i mere end én sammenligning). Gener blev klassificeret som opreguleres i Skedehinden region ved signifikant blev opreguleret i både Skedehinden forhold til bladet og Skedehinden forhold til skeden. I alle cellelag LM, blev 373 gener betydeligt opreguleret i den Skedehinden region.
Udskrift ophobning blev analyseret i de adaxial epidermis klinge, Skedehinden og kappe regioner og i alt 3.128 DE gener blev fundet; 1.971 gener var DE mellem Skedehinden og klinge, 2.032 gener var DE mellem Skedehinden og kappe, og 871 gener var DE mellem klinge og skede (figur 6B). 287 gener blev signifikant opreguleret i Skedehinden forhold til kniven og kappe epidermis.
Data for udvalgte gener, der opreguleres i Skedehinden region er vist i tabel 1 og figur 7. En indledende in situ hybridiseringsanalyse indikerede, at LG1 transkripter ophobes specifikt i PLB og det nye skedehinde af vildtype-blad primordier, og at LG1 er mere stærkt transkriberes i epidermis end i interne cellelag (figur 6C). LM RNA-seq data, der blev opnået, er i overensstemmelse med dette resultat; LG1 transkript akkumulation er signifikant højere i Skedehinden end i både blad- eller skede i både epidermale LM og LM af alle cellelag (tabel 1, figur 7A). LG1 har en højere CPM i den epidermale analyse end i analysen af alle cellelag, svarende til scenariet illustreret i fig 8C.
NS1 blev signifikant opreguleret i Skedehinden region i både alle cellelag LM og adaxial epidermis LM (tabel 1, figur 7B). Dette resultat blev bekræftet ved in situ hybridisering, som viser, at NS1 transkript akkumulerer specifikt i spidsen af spirende skedehinde (figur 6D). NS1 har en meget højere læse tælle i epidermis kun LM analyse end i LM af alle cellelag (19,6 CPM og 2,7 CPM, henholdsvis) på grund af fortynding af transkriptet i alle lag LM. Denne fortynding effekt er illustreret i figur 8A. Tilsvarende GRMZM2G101682, et gen med ukendt funktion, havde en højere gennemsnitlig læse tælle i Skedehinden epidermale LM end i alle lag LM (tabel 1, figur 7C). In situ hybridisering afslørede, at dette gen transkript også akkumuleres stærkest i epidermale celler (figur 6E). Zm PIN1a var ikke signifikant DE i analysen af alle cellelag, men var signifikant opreguleret i Skedehinden i epidermis kun for analyse (tabel 1, figur 7D). Dette er mest sandsynligt, fordi Zm PIN1a er stærkt udtrykt i vaskulære væv og dette L2-afledte vaskulær udtryk forvirrer forskelle i Zm PIN1a ophobning i epidermis, når alle cellelag er indsamlet (figur 6F). Et lignende scenario er afbildet i figur 8B.
At identificere gener, der er DE i LG1-R-mutanter, blev transkript akkumulering sammenlignet i en defineret region af vildtype og LG1-R P6 leaf primordier. Ninety-seks gener var DE i LG1-R (FDR <0,05); 59 blev nedreguleret i LG1-R-mutanter, og 37 blev opreguleret. Data for udvalgte gener, som er DE i <em> LG1-R-mutanter er præsenteret i tabel 2. bel14 er en af 34 gener, der både opreguleres i Skedehinden region i vildtype-blad primordier og nedreguleret i LG1-R-mutanter. In situ bekræftede hybridisering at bel14 udskrifter ophobes i preligule-regionen i vilde planter, men ikke i den tilsvarende region i LG1-R blad primordier 6.
Figur 2: Ordning for laser mikrodissektion af blad primordiale domæner. (A) Lateral længdesnit af majs skudspidsen forarbejdet til LM. Bokse angiver regioner udvalgt til mikrodissektion. Skedehinde region væv (rød boks) blev mikrodissekeres fra 100 um høje rektangler, centreret om PLB. Pre-blad (grøn) og præ-kappe (blå) væv blev taget fra 100 umrektangler 50 um over og under udvælgelsen preligule henholdsvis. Til sammenligning af vildtype og LG1-R transcriptomes, væv mellem 400-900 um fra bunden af P6 blad primordier blev mikrodissekeres fra laterale sektioner (lilla stiplet linie). (B) Close-up af P7 primordium og regioner udvalgt til mikrodissektion af alle cellelag. (C) Close-up af P7 primordium og regioner udvalgt til mikrodissektion af adaxial epidermis. (D) Preligule region P7 primordium før mikrodissektion. Arrowhead angiver position for at indlede skedehinde. (E) Rød linje angiver region valgt til mikrodissektion. Laseren vil skære langs denne linje. Cirkler angiver punkter, hvor laserimpulser vil katapult væv. (F) primordium efter mikrodissektion. Cirkler angiver punkter, hvor laserpulser har slynget væv. SAM = skyde apikal meristem. P angiver plastochron nummer. Scale barer = 100 &# 181; m. Dette tal har været ændret siden henvisning 6 (Copyright American Society of Plant Biologer). Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: Den valgte for LM region påvirker læste tællinger for gener, der er DE langs bladet primordium. (A) Præcis positionering af den udvalgte for LM forhold til morfologiske landmærker region reducerer variation for gener udtrykt i en gradient langs bladet akse. I gentagelser 1-3 på venstre, er markeringer centreret om den spirende Skedehinden resulterer i lav variation. I gentagelser 1-3 på højre, positionering af regionen udvalgt til LM er ikke konsekvent resulterer i øget variation. (B) Microdissecting et konsekvent størrelse svalg reducerer variation (replikater 1-3 på venstre) sammenlignet med microdissecting forskellige størrelser markeringer (replikater 1-3 til højre) for gener med Skedehinden-specifikke ekspressionsmønstre. Transkripter mere fortyndet i større udvalg, hvilket resulterer i en lavere læse Stillingen og mere koncentreret i mindre udvalg, hvilket resulterer i en højere læse tæller. Tegnefilm repræsenterer langsgående snit gennem blad primordier i Skedehinden region. Arrowhead indikerer indlede Skedehinden. CPM = tællinger pr million. SD = standardafvigelse. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: Dissektion af majs kimplante for laterale sektioner. (A) To uger gamle majs sætteplante fjernet ved roden-shoot krydset. Fjern tynde skiver from basen af skuddet (1), indtil en lille oval af culm er synlig på basen af skuddet. Sørg tværgående snit ca. 10 mm over bunden (2) og fastholde denne cylinder. (B) Cylinder af væv orienteret således basen vender opad. Bemærk oval af culm omkranset af blade. Lav to langsgående snit parallelt med den tværgående akse (3 og 4). Fastholde og løse centrale skive væv, vil denne del omfatter SAM og unge blade primordier. (C) Cartoon illustrerer plan lateral sektion (grøn stiplet linje) gennem skudspidsen. Rød cirkel angiver midtribbe, rød pilespids angiver margener af grå blad primordium. Blå stiplede linje: midtribbe-margin akse. Scale bar = 1 mm. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5: Cartoon illustrerer sammenlægning af laser mikrodissekeres væv til en gengivelse af Skedehinden region. Væv mikrodissekeres fra fem til seks dias er samlet for hver gentagelse. Fem median snit fra hver slide anvendes og to markeringer (røde rektangler) er fremstillet af hvert afsnit. Hvert rektangel er cirka 20.000 um 2. Væv til hver gentagelse opsamles i et separat rør (blå ovale). Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 6: Antal DE gener i parvise sammenligninger mellem blad regioner og in situ hybridisering af udvalgte DE gener. (A) Antal DE gener i parvise sammenligning mellemklinge, skedehinde og kappe regioner, LM af alle cellelag. (B) Antal DE gener i parvise sammenligning mellem klinge, Skedehinden og kappe regioner, LM på kun adaxial epidermis. (C) LG1 in situ hybridisering. (D) NS1 in situ hybridisering. (E) GRMZM2G101682 in situ hybridisering. (F) ZmPIN1a in situ hybridisering. DE: differentielt udtrykt. Op i L: op i Skedehinden, op i B: op i bladet. Op i S: op i skeden. Pilehoveder i CF angiver spirende Skedehinden. Pilen i F angiver transkript akkumulering i vaskulære væv. Scale barer = 100 um. Dette tal har været ændret siden henvisning 6 (Copyright American Society of Plant Biologer). Klik her for at se en større version af dette tal.
t = "Figur 7" src = "/ files / ftp_upload / 55.004 / 55004fig7.jpg" />
Figur 7: Grafisk fremstilling af data for udvalgte DE gener. Figur illustrerer data præsenteret i tabel 1, og in situ hybridisering resultater. Tegnefilm repræsenterer længdesnit gennem blade primordier. Mørkeblå indikerer transkript akkumulering for et bestemt gen. Grøn, rød og blå felter angiver region udvalgt til mikrodissektion for klinge, Skedehinden og kappe prøver. Tegnefilm til venstre illustrerer LM af alle cellelag. Tegnefilm til højre illustrerer LM på kun adaxial epidermis. Ad: adaxial epidermis, Ab: abaxial epidermis, CPM: tællinger per million, stjerne angiver signifikant forskel mellem to domæner. Klik her for at se en større version af dette tal.
"Src =" / files / ftp_upload / 55.004 / 55004fig8.jpg "/>
Figur 8: Cartoon illustrerer hvordan læse tæller for hypotetiske DE gener varierer afhængigt af de præcise områder udvalgt til mikrodissektion. (A) Gene med Skedehinden-specifikke udtryk. (B) Gene udtrykt i Skedehinden og i vaskulære væv. (C) Gene udtrykt specifikt i Skedehinden region i alle cellelag men med højere ekspression i epidermis. (D) Gene udtrykt i Skedehinden region, L2-afledte cellelag kun. Tegnefilm repræsenterer længdesnit gennem blade primordier. Mørkeblå indikerer transkript akkumulering for et bestemt gen. Grøn, rød og blå felter angiver region udvalgt til mikrodissektion for klinge, Skedehinden og kappe prøver. Tegnefilm til venstre illustrerer LM af alle cellelag. Tegnefilm til højre illustrerer LM på kun adaxial epidermis. Ad: adaxial epidermis, Ab: abaxial epidermis, CPM: COU NTS per million. Klik her for at se en større version af dette tal.
Tabel 1: Udvalgte gener opreguleret i den oprindelige Skedehinden. Counts per million: tællinger per million totale udskrifter, gennemsnit af tre gentagelser, logFC = log base 2 Fold Change, FDR.BH: falsk opdagelse sats ifølge Benjamini og Hochberg metode. Alle lag: LM af alle cellelag. Epidermis: LM af kun adaxial epidermis. Dette tal har været ændret siden henvisning 6 (Copyright American Society of Plant Biologer). Klik her for at se en større version af denne tabel.
e 2 "src =" / files / ftp_upload / 55.004 / 55004tbl2.jpg "/>
Tabel 2: Udvalgte gener DE i LG1-R-mutanter. Counts per million: tællinger per million totale udskrifter, gennemsnit af tre gentagelser, logFC = log base 2 Fold Change, FDR.BH: falsk opdagelse sats ifølge Benjamini og Hochberg metode. Dette tal har været ændret siden henvisning 6 (Copyright American Society of Plant Biologer). Klik her for at se en større version af denne tabel.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Eksperimentel design er en kritisk faktor i RNA-seq eksperimenter. Vigtige hensyn er den præcise domæne (r) og udviklingsstadiet (er), der skal analyseres, og hvilke sammenligninger vil blive foretaget. Det er afgørende at tænke i sammenligninger, da produktionen er typisk en liste af gener, der er DE mellem to eller flere betingelser. Som med alle eksperimenter, er det vigtigt at ændre kun én variabel ad gangen. For eksempel, når man sammenligner forskellige blade domæner, blade af samme alder og udviklingsstadiet, dyrket under de samme betingelser bør sammenlignes.
Formålet med disse forsøg var at identificere gener, der er specifikt op- eller nedreguleret i Skedehinden region af vildtype-blad primordier og identificere gener, som er DE i LG1-R-mutanter sammenlignet med vildtype. Vi først studerede morfologi udvikle blade primordier og mønstret for LG1 udskrift akkumulation. Disse morfologiske og molekylære vartegn were bruges til at vælge præcise domæner for LM 14, 15, 16. I det første forsøg blev afskrift ophobning i Skedehinden region i forhold til andre regioner i samme blad primordier dermed at fjerne forskelle på grund af vækstbetingelser, genetisk baggrund, udviklingsstadiet og anlæg-til-plante variation. At sammenligne mutant med vildtype, er det nødvendigt at bestemme, hvor og hvornår genet af interesse udtrykkes. Vi anbefaler analysere ekspressionsmønsteret ved enten in situ-hybridisering eller immunlokalisering og vælge en region for LM, der omfatter det domæne af genekspression. Det er vigtigt, at ækvivalente domæner sammenlignes, og at den genetiske baggrund er den samme for både mutante og vildtype.
Nøjagtigheden af microdissections kan kontrolleres ved at kontrollere læst tæller for gener, som udtrykkes specifikt i det domæne af interesse, hvis such gener er kendte. Dette kan også gøres ved at udføre RT-PCR på RNA ekstraheret fra LM væv inden du gør biblioteker til sekventering. I eksperimenterne beskrevet her, LG1 tjente som kontrol for LM af Skedehinden region, eftersom in situ hybridiseringsanalyser havde vist, at LG1 udtryk er specifik for PLB og nye Skedehinden 5, 6.
I modsætning fremgangsmåder, såsom RT-qPCR, hvor kandidat-gen (er) skal være kendt, RNA-seq kvantificerer akkumulering af alle transkripter i en given vævsprøve. Således LM RNA-seq er en nyttig metode til at identificere kandidatgener. Et eksempel fra denne undersøgelse er GRMZM2G101682, et gen med ukendt funktion, der har en slående skedehinde-specifik ekspression mønster (figur 6E). Denne undersøgelse identificerede også gener, som er DE i LG1-R, såsom bel14, som ikke tidligere har været impliceret som handler nedstrøms LG1. I this eksempel sammenligning af flere datasæt (opreguleret i vildtype-Skedehinden region og DE i LG1-R) var især informativ. Det er vigtigt at bemærke, at ekspressionsmønsteret af et gen ikke godtgør sin funktion: efterfølgende genetiske og / eller biokemiske analyser skal opstille genfunktion.
Transkriptom analyser, der er fokuseret på små, diskrete udviklingsmæssige domæner, som er forskelligt tydelig og let afgrænset, er den mest succesfulde. LM-RNA-seq er en velegnet metode til sådanne analyser og har potentialet til at blive anvendt på mange udviklingsmæssige fænomener. Det er særligt egnede til at identificere differentiel genekspression i mutanter af gener, der rumligt begrænsede ekspressionsmønstre, eller mutanter, der påvirker udviklingen af specifikke strukturer. Den kan også anvendes til processer, der foregår i specifikke og identificerbare celler eller væv, såsom epidermis eller vaskulatur, og har været anvendt ien transkriptom analyse af majs skyde apikal meristem (SAM) ontogenese 16. Det er mindre hensigtsmæssigt at studere funktionen af gener, som udtrykkes ubikvitært eller processer, der foregår i alle celler. De metoder, der præsenteres her, har med held været anvendt til en række plantearter (majs, sorghum, Ocimum, Mentha og Antirrhinum) og strukturer (blad primordier, meristemer, jordstængler og trichomes).
LM er ikke påkrævet, når en analyse indebærer relativt store domæner. Faktisk har RNA-Seq på hånd-dissekeret eller hele organer blevet anvendt med succes til at identificere DE gener i planter 14, 15. Denne fremgangsmåde har den fordel at være mindre arbejdskrævende og ingen erfaring med histologiske teknikker er påkrævet. Der er imidlertid begrænsninger for præcision af hånd dissektioner, hvilket betyder, at hånden dissektion er mindre egnet til at studere tidlig developmental processer.
For vellykkede LM RNA-Seq analyser af udviklingsmæssige fænomener, skal den udviklingsmæssige kontekst være godt karakteriseret. Vi anbefaler, at foretage en grundig histologisk undersøgelse af processen eller domæne af interesse før planlægningen et eksperiment. Den histologi af prøver behandles til LM er generelt dårlig, da væv er uplettet og er ikke monteret med dækglas, der giver dybde-of-field. Derfor er det nyttigt at fastsætte særskilte prøver til farvning og observation på samme tid som LM Prøverne fikseres (fig 1C og D).
RNA opnået fra LM materiale er generelt fragmenteret og det samlede udbytte er lavt 8. En forstærkning trin er nødvendigt for at generere tilstrækkelig RNA til biblioteket forberedelse 28. RNA-fragment længde bør vurderes efter amplifikation og før biblioteket generation. En gennemsnitlig fragment længde seVeral hundrede basepar anses generelt god, 500 basepar er fremragende. Dårlig RNA udbytte kan forekomme, hvis væv er ikke godt fast, hvis der opstår nedbrydning på grund af RNase kontaminering, eller hvis paraffinblokke er ukorrekt lagret. Det er nyttigt at teste kvaliteten af fikseret væv ved at foretage en afprøvning LM af et relativt stort areal inden afsætte en masse tid til microdissecting meget små domæner. Fordi den er fremstillet af LM celler RNA er fragmenteret og amplifikation under anvendelse af en oligo dT primer indfører en stærk 3'bias, denne metode er ikke egnet til detektering alternative transskripter, såsom splejsningsvarianter. Ej heller er LM egner sig til påvisning små RNA'er.
En alternativ fremgangsmåde til at kvantificere transkript akkumulering i specifikke væv eller cellulære domæner er RNA-seq af celler adskilt ved fluorescensaktiveret cellesortering (FACS) 21. Denne fremgangsmåde kræver generelt identificering af et egnet markørgen for regionen af interesse,frembringelsen af transgene planter, der udtrykker en fluorescerende-mærket protein og protoplasting. FACS kombineret med microarray er blevet anvendt til at generere et udtryk kort over Arabidopsis rod ved at adskille celler, der udtrykker celletype-specifikke promotorer i roden 22, 23. FACS af shoot væv er mere udfordrende end root væv på grund af klorofyl autofluorescens 24. En begrænsning af LM er, at domænet for interesse skal kunne identificeres i histologiske snit. FACS kan være en mere hensigtsmæssig metode i tilfælde, hvor en egnet markør gen er til rådighed. Valget af celler eller væv til at isolere og sammenligne er en vigtig overvejelse i transkriptomisk analyser, der bruger enten FACS eller LM.
De data, der præsenteres her illustrerer, at der vil opnås forskellige resultater afhængigt af de præcise domæner udvalgt til LM (Figur 3, Figur 8). Transkripter af gener, som udtrykkes i en eller enkelte celler, såsom NS1, vil blive fortyndet, når store væv domæner analyseres. Det er sandsynligt, at hvis hele blade primordier blev udtaget, ikke ville blive detekteret NS1 transkript. ZmPIN1a væsentligt opreguleres i Skedehinden forhold til bladet og kappe epidermis men denne forskel er beskæmmet af vaskulær udtryk, når alle cellelag samples. Omvendt vil gener, som kun udtrykkes i L2-afledte cellelag ikke påvises, når kun epidermis samples (figur 8D). Denne undersøgelse viser, at mens LM RNA-Seq er et stærkt værktøj til detektering forskelle i genekspression under morfogenese, de valgte til analyse domæner er afgørende for succes af forsøget.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Forfatterne takker S. Hake for løbende samarbejde og stimulerende diskussioner om Skedehinden udvikling. Dette arbejde er støttet af National Science Foundation Grants MCB 1052051 og IOS-1.848.478.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Diethyl pyrocarbonate | Sigma-Aldrich | 159220 | Used for RNase treatment of solutions |
| Razor blades | Electron Microscopy Sciences | 72000 | |
| RNase Zap | Sigma-Aldrich | R2020-250ML | RNase decontamination solution |
| Ethanol absolute 200 proof | Fisher Scientific | BP28184 | |
| Acetic acid, glacial | Sigma-Aldrich | A6283 | |
| Glass vials - 22 ml | VWR | 470206-384 | |
| Xylenes, histological grade | Sigma-Aldrich | 534056-4L | |
| Paraplast plus | Sigma-Aldrich | P3683-1KG | |
| Disposable base molds, 15 mm x 15 mm x 5 mm | VWR | 15154-072 | |
| Embedding rings | VWR | 15154-303 | |
| Silica gel packets | Electron Microscopy Sciences | 71206-01 | Desiccant for storage of paraffin blocks |
| Oven | Fisher Scientific | 15-103-0503 | Oven must maintain temperature of 60 °C |
| Paraffin embedding station | Leica | EG1160 | |
| Microtome | Leica | RM2235 | |
| Slide warmer | Electron Microscopy Sciences | 71317-10 | |
| Coplin jars | Electron Microscopy Sciences | 70316-02 | |
| Laser microdissector | Zeiss | ||
| KIMWIPES™ Delicate Task Wipers | Kimberly-Clark Professional | 34120 | Lint-free wipes for wicking excess solutions from microscope slides |
| Membrane Slide 1.0 PEN | Zeiss | 415190-9041-000 | Slides for laser microdissection |
| Adhesive Cap 200 opaque | Zeiss | 415190-9181-000 | Tubes for laser microdissection |
| PicoPure RNA Isolation Kit | ThermoFisher Scientific | KIT0204 |
References
- Becraft, P. W., Bongard-Pierce, D. K., Sylvester, A. W., Poethig, R. S., Freeling, M. The liguleless-1 gene acts tissue specifically in maize leaf development. Dev Biol. 141 (1), 220-232 (1990).
- Sylvester, A. W., Cande, W. Z., Freeling, M. Division and differentiation during normal and liguleless-1 maize leaf development. Development. 110 (3), 985-1000 (1990).
- Moreno, M. A., Harper, L. C., Krueger, R. W., Dellaporta, S. L., Freeling, M. liguleless1 encodes a nuclear-localized protein required for induction of ligules and auricles during maize leaf organogenesis. Genes Dev. 11 (5), 616-628 (1997).
- Emerson, R. A. The inheritance of the ligule and auricle of corn leaves. Neb. Agr. Exp. Sta. An. Rep. 25, 81-85 (1912).
- Moon, J., Candela, H., Hake, S. The Liguleless narrow mutation affects proximal-distal signaling and leaf growth. Development. 140 (2), 405-412 (2013).
- Johnston, R., et al. Transcriptomic Analyses Indicate That Maize Ligule Development Recapitulates Gene Expression Patterns That Occur during Lateral Organ Initiation. Plant Cell. 26 (12), 4718-4732 (2014).
- Schmid, M. W., et al. A powerful method for transcriptional profiling of specific cell types in eukaryotes: laser-assisted microdissection and RNA sequencing. PLoS One. 7 (1), e29685 (2012).
- Kerk, N. M., Ceserani, T., Tausta, S. L., Sussex, I. M., Nelson, T. M. Laser capture microdissection of cells from plant tissues. Plant Physiol. 132 (1), 27-35 (2003).
- Nakazono, M., Qiu, F., Borsuk, L. A., Schnable, P. S. Laser-capture microdissection, a tool for the global analysis of gene expression in specific plant cell types: identification of genes expressed differentially in epidermal cells or vascular tissues of maize. Plant Cell. 15 (3), 583-596 (2003).
- Marioni, J. C., Mason, C. E., Mane, S. M., Stephens, M., Gilad, Y. RNA-seq: an assessment of technical reproducibility and comparison with gene expression arrays. Genome Res. 18 (9), 1509-1517 (2008).
- Wang, Z., Gerstein, M., Snyder, M. RNA-Seq: a revolutionary tool for transcriptomics. Nat Rev Genet. 10 (1), 57-63 (2009).
- Brooks, L., et al. Microdissection of shoot meristem functional domains. PLoS Genet. 5 (5), e1000476 (2009).
- Cai, S., Lashbrook, C. C. Stamen abscission zone transcriptome profiling reveals new candidates for abscission control: enhanced retention of floral organs in transgenic plants overexpressing Arabidopsis ZINC FINGER PROTEIN2. Plant Physiol. 146 (3), 1305-1321 (2008).
- Li, P., et al. The developmental dynamics of the maize leaf transcriptome. Nat Genet. 42 (12), 1060-1067 (2010).
- Eveland, A. L., et al. Regulatory modules controlling maize inflorescence architecture. Genome Res. 24 (3), 431-443 (2014).
- Takacs, E. M., et al. Ontogeny of the maize shoot apical meristem. Plant Cell. 24 (8), 3219-3234 (2012).
- Aida, M., Ishida, T., Tasaka, M. Shoot apical meristem and cotyledon formation during Arabidopsis embryogenesis: interaction among the CUP-SHAPED COTYLEDON and SHOOT MERISTEMLESS genes. Development. 126 (8), 1563-1570 (1999).
- Ishida, T., Aida, M., Takada, S., Tasaka, M. Involvement of CUP-SHAPED COTYLEDON genes in gynoecium and ovule development in Arabidopsis thaliana. Plant Cell Physiol. 41 (1), 60-67 (2000).
- Takada, S., Hibara, K., Ishida, T., Tasaka, M. The CUP-SHAPED COTYLEDON1 gene of Arabidopsis regulates shoot apical meristem formation. Development. 128 (7), 1127-1135 (2001).
- Nardmann, J., Ji, J., Werr, W., Scanlon, M. J. The maize duplicate genes narrow sheath1 and narrow sheath2 encode a conserved homeobox gene function in a lateral domain of shoot apical meristems. Development. 131 (12), 2827-2839 (2004).
- Bonner, W. A., Hulett, H. R., Sweet, R. G., Herzenberg, L. A.
- Birnbaum, K., et al. A gene expression map of the Arabidopsis root. Science. 302 (5652), 1956-1960 (2003).
- Brady, S. M., et al. A high-resolution root spatiotemporal map reveals dominant expression patterns. Science. 318 (5851), 801-806 (2007).
- Carter, A. D., Bonyadi, R., Gifford, M. L. The use of fluorescence-activated cell sorting in studying plant development and environmental responses. Int J Dev Biol. 57 (6-8), 545-552 (2013).
- Ruzin, S. E. Plant microtechnique and microscopy. , Oxford University Press. New York; Oxford. (1999).
- Jackson, D., Veit, B., Hake, S. Expression of maize KNOTTED1 related homeobox genes in the shoot apical meristem predicts patterns of morphogenesis in the vegetative shoot. Development. 120, 405-413 (1994).
- Javelle, M., Marco, C. F., Timmermans, M. In situ hybridization for the precise localization of transcripts in plants. J Vis Exp. (57), e3328 (2011).
- Day, R. C., McNoe, L., Macknight, R. C. Evaluation of global RNA amplification and its use for high-throughput transcript analysis of laser-microdissected endosperm. Int J Plant Genomics. , 61028 (2007).
