Summary

Optimisation et analyse comparative des méthodes d'enrichissement de l'ADN des plantes organiques Convient pour le séquençage de la prochaine génération

Published: July 28, 2017
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Summary

La comparaison et l'optimisation de deux méthodes d'enrichissement d'ADN organellaire végétal sont présentées: centrifugation différentielle traditionnelle et fractionnement de l'ADNc total basé sur l'état de méthylation. Nous évaluons la quantité et la qualité d'ADN qui en résultent, démontrons la performance dans le séquençage de prochaine génération de lecture courte et discutons le potentiel d'utilisation dans le séquençage à une seule molécule à longue lecture.

Abstract

Les génomes organellaires végétaux contiennent de gros éléments répétitifs qui peuvent faire l'objet d'un couplage ou d'une recombinaison pour former des structures complexes et / ou des fragments sub-génomiques. Les génomes organellés existent également dans des mélanges à l'intérieur d'une cellule ou d'un type de tissu (hétéroplasmique) donné, et une abondance de sous-types peut changer tout au long du développement ou sous stress (déplacement sous-stoechiométrique). Les technologies de séquençage de la prochaine génération (NGS) sont nécessaires pour obtenir une compréhension plus approfondie de la structure et de la fonction du génome organellaire. Les études de séquençage traditionnelles utilisent plusieurs méthodes pour obtenir l'ADN organellaire: (1) Si une grande quantité de tissu de départ est utilisée, elle est homogénéisée et soumise à une centrifugation différentielle et / ou à une purification par gradient. (2) Si une quantité plus petite de tissu est utilisée ( c'est-à-dire, si les graines, le matériau ou l'espace est limité), le même processus est effectué comme dans (1), suivi d'une amplification complète du génome pour obtenir un ADN suffisant. (3) L'analyse de bioinformatique peut être utilisée pour seqL'ADN génomique total et d'analyser les lectures organiques. Toutes ces méthodes ont des défis et des compromis inhérents. Dans (1), il peut être difficile d'obtenir une telle quantité importante de tissu de départ; Dans (2), l'amplification du génome entier pourrait introduire un biais de séquençage; Et dans (3), l'homologie entre génomes nucléaires et organellars pourrait entraver l'assemblage et l'analyse. Dans les plantes à grands génomes nucléaires, il est avantageux d'enrichir l'ADN organellaire pour réduire les coûts de séquençage et la complexité des séquences pour les analyses de bioinformatique. Ici, nous comparons une méthode de centrifugation différentielle traditionnelle avec une quatrième méthode, une approche CpG-méthyle modifiée, pour séparer l'ADN génomique total en fractions nucléaires et organellaires. Les deux méthodes produisent suffisamment d'ADN pour le NGS, l'ADN qui est très enrichi pour les séquences organellaires, mais à des rapports différents dans les mitochondries et les chloroplastes. Nous présentons l'optimisation de ces méthodes pour le tissu des feuilles de blé et discutons des avantages majeurs et dDes avantages de chaque approche dans le contexte de l'apport d'échantillon, la facilité du protocole et l'application en aval.

Introduction

Le séquençage du génome est un outil puissant pour disséquer la base génétique sous-jacente des traits importants de la plante. La plupart des études de séquençage génomique se concentrent sur le contenu du génome nucléaire, car la majorité des gènes sont situés dans le noyau. Cependant, les génomes organellars, y compris les mitochondries (à travers les eucaryotes) et les plastides (dans les plantes, la forme spécialisée, le chloroplaste, les travaux de la photosynthèse) apportent des informations génétiques importantes essentielles au développement de l'organisme, à la réponse au stress et à la condition physique globale 1 . Les génomes organellaires sont généralement inclus dans les extractions totales d'ADN destinées au séquençage du génome nucléaire, bien que des méthodes pour réduire les nombres d'organelles avant l'extraction de l'ADN soient également utilisées 2 . De nombreuses études ont utilisé les résultats de séquençage des extractions totales d'ADNg pour assembler les génomes organellaires 3 , 4 , 5 ,Xref "> 6 , 7. Cependant, lorsque la cible de l'étude est de se concentrer sur les génomes organellars, l'utilisation de l'ADNc total augmente les coûts de séquençage car de nombreuses lectures sont" perdues "pour les séquences d'ADN nucléaire, en particulier dans les plantes à grands génomes nucléaires De plus, en raison de la duplication et du transfert de séquences organellaires dans le génome nucléaire et entre les organites, résoudre la position de cartographie correcte des lectures de séquençage au génome approprié est un défi bioinformatique 2 , 8. La purification des génomes organellaires du génome nucléaire est une Stratégie pour réduire ces problèmes. D'autres stratégies de bioinformatique peuvent être utilisées pour séparer la carte à des régions d'homologie entre les mitochondries et les chloroplastes.

Alors que les génomes organellaires provenant de nombreuses espèces de plantes ont été séquencés, on sait peu à peu l'ampleur de la diversité du génome organellaireDisponible dans les populations sauvages ou dans les piscicultures cultivées. Les génomes organellés sont également connus pour être des molécules dynamiques qui subissent un réaménagement structurel important en raison de la recombinaison entre les séquences répétées 9 . En outre, plusieurs copies du génome organellaire sont contenues dans chaque organelle, et des organites multiples sont contenues dans chaque cellule. Toutes les copies de ces génomes ne sont pas identiques, ce qui est connu sous le nom d'hétéroplasme. Contrairement à l'image canonique des «cercles maîtres», il existe maintenant une preuve croissante d'une image plus complexe des structures du génome organellaire, y compris les cercles sub-génomiques, les chromosomes linéaires, les concatémas linéaires et les structures ramifiées 10 . L'assemblage des génomes organellaires végétaux est encore plus compliqué par leurs dimensions relativement importantes et leurs répétitions inversées et directes importantes.

Protocoles traditionnels pour l'isolement organellaire, la purification de l'ADN et la génomique subséquente Le séquençage est souvent encombrant et nécessite de gros volumes d'entrée de tissus, avec plusieurs grammes à plus de centaines de grammes de tissu de feuilles jeunes nécessaires comme point de départ 11 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17 . Cela rend le séquençage du génome organellaire inaccessible lorsque le tissu est limité. Dans certaines situations, les quantités de semences sont limitées, par exemple lorsqu'elles doivent s'effectuer sur une base générationnelle ou sur des lignes stériles masculines qui doivent être maintenues par passage. Dans ces situations, l'ADN organellaire peut être purifié puis soumis à une amplification complète du génome. Cependant, l'amplification du génome complet peut introduire un biais significatif de séquençage, ce qui est un problème particulier lors de l'évaluation de la variation structurelle, des structures sous-génomiques et des niveaux d'hétéroplasmie> 18. Les progrès récents dans la préparation de la bibliothèque pour les technologies de séquençage à lecture courte ont permis de surmonter les obstacles à faible intrusion pour éviter l'amplification du génome entier. Par exemple, le kit de préparation de la bibliothèque Illumina Nextera XT permet d'utiliser aussi peu que 1 ng d'ADN comme entrée 19 . Cependant, les préparations de bibliothèques standard pour les applications de séquençage à lecture prolongée, telles que les technologies de séquençage PacBio ou Oxford Nanopore, nécessitent encore une quantité relativement élevée d'ADN d'entrée, ce qui peut constituer un défi pour le séquençage du génome organellaire. Récemment, de nouveaux protocoles de séquençage conçus par l'utilisateur et à lecture longue ont été développés pour réduire les quantités d'intrants et aider à faciliter le séquençage du génome dans les échantillons où l'obtention de microgrammes d'ADN est difficile 20 , 21 . Cependant, l'obtention de fractions organellaires pures et de masse moléculaire élevée pour alimenter ces préparations de bibliothèque reste un défi.

Nous avons cherchéO Comparer et optimiser les méthodes organiques d'enrichissement et d'isolement de l'ADN appropriées pour les NGS sans besoin d'amplification du génome entier. Plus précisément, notre objectif était de déterminer les meilleures pratiques pour enrichir l'ADN organellaire de masse moléculaire élevée à partir de matériaux de départ limités, comme un sous-échantillon de feuille. Ce travail présente une analyse comparative des méthodes à enrichir pour l'ADN organellaire: (1) un protocole de centrifugation différentielle traditionnel modifié par rapport à (2) un protocole de fractionnement de l'ADN basé sur l'utilisation d'une méthode de transfert de protéines de domaine CpG-liaison au méthyle d'ADN disponible dans le commerce 22 appliqué au tissu végétal 23 . Nous recommandons les meilleures pratiques pour l'isolement de l'ADN organellaire à partir de feuilles de blé, ce qui peut être facilement étendu à d'autres plantes et types de tissus.

Protocol

1. Génération de matériaux végétaux pour l'isolement organellaire et l'extraction d'ADN Croissance standard des semis de blé Plantez des graines dans de la vermiculite dans de petites casseroles carrées avec 4 à 6 graines par coin. Transférer dans une serre ou une chambre de croissance avec un cycle léger de 16 h, 23 ºC jour / 18 ºC de nuit. Eau les plantes chaque jour. Fertiliser les plantes avec ¼ c. À thé d'engrais granulés 20-20-20 NPK ap…

Representative Results

Les protocoles présentés dans ce manuscrit décrivent deux méthodes distinctes pour enrichir l'ADN organellaire du tissu végétal. Les conditions présentées ici reflètent l'optimisation du tissu de blé. Une comparaison des étapes clés dans les protocoles, l'apport de tissus requis et la sortie d'ADN sont décrites à la figure 1 . Les étapes du protocole DC testé suivent des conditions similaires à celles décrites précédemment…

Discussion

À ce jour, la plupart des études de séquençage organellaire se concentrent sur les méthodes DC traditionnelles pour enrichir l'ADN spécifique. Des méthodes pour isoler des organites de diverses plantes ont été décrites, y compris la mousse 40 ; Monocoques telles que le blé 15 et l'avoine 11 ; Et des dicotylédones comme l'arabidopsis 11 , le tournesol 17 et le colza <sup class="x…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Nous souhaitons remercier le ministère du Service d'agriculture et de recherche agricole de l'Amérique du Nord et de la National Science Foundation (IOS 1025881 et IOS 1361554). Nous remercions R. Caspers pour la maintenance des serres et les soins des plantes. Nous remercions également le Centre de génomique de l'Université du Minnesota, où les préparations et le séquençage de la bibliothèque Illumina ont été réalisés. Nous sommes également reconnaissants pour les commentaires des éditeurs de journaux et de quatre examinateurs anonymes qui ont renforcé notre manuscrit. Nous remercions également l'OCDE pour une bourse à SK pour intégrer ces protocoles pour des projets collaboratifs avec des collègues au Japon.

Materials

2-mercaptoethanol (beta-mercaptoethanol; BME) Sigma Aldrich M3148-100ml
2-propanol (Isopropyl alcohol/isopropanol), bioreagent Sigma Aldrich I9516
agarose, Bio-Rad Cetified Megabase agarose Bio-Rad 1613108
analytical balance Mettler Toledo AB54-S
balance Mettler Toledo PB1502-S
bovine serum albumin (BSA) Sigma Aldrich B4287-25G
Ceramic grinding cylinders, 3/8in x 7/8in SPEX SamplePrep 2183
Cryogenic Blocks compatible with tissue homogenizer for holding 50 ml tubes SPEX SamplePrep 2664
DNaseI Sigma DN25
ethanol, absolute Decon Laboratories 2716
Ethylenediamine Tetraacetic Acid (EDTA), 0.5M Solution, pH8.0 Fisher BP2482-500
gel imaging system
gel stain Such as GelRed or Ethidium Bromide
grinding pestle, wide tip for 2 ml conical tubes
Guanidine-HCl, 8M solution ThermoFisher 24115
LightCycler 480 SYBR Green I Master Roche 4707516001
liquid nitrogen
Lysing enzymes from Trichoderma harzianum Sigma L1412
Magnesium Chloride G Bioscience 24115
magnetic rack ThermoFisher A13346
microcentrifuge tubes, LoBind 1.5 ml  Eppendorf 22431021
microcentrifuge tubes, standard nuclease-free 1.5 ml Eppendorf
microcentrifuge, refrigerated Sorvall  Legend X1R Or equivalent product, must be capable of reaching at least 18,000 x g with rotors for 50 ml tubes, Oak Ridge tubes, and 1.5 ml tubes
microcentrifuge, room temperature Eppendorf 5424 Or equivalent product, must be capable of reaching at least 18,000 x g with rotor for 1.5 ml and 2 ml microcentrifuge tubes
Microcon DNA Fast Flow Centrifugal Filter Units EMD Millipore MRCFOR100
Miracloth, 1 square per sample cut to fit funnel EMD Millipore 475855
NEBNext Microbiome DNA Enrichment Kit New England Biolabs E2612L
parafilm Parafilm M PM992
plastic pots and trays
polyvinylpyrrolidone (PVP) Fisher BP431-100
Proteinase K Qiagen 19131
Pulsed-Field Gel Electrophoresis rig (e.g. CHEF DR III) Bio-Rad 1703697
purification beads, Agencourt AMpureXP beads Beckman Coulter A63881
QIAamp DNA Mini Kit Qiagen 51304
Qiagen 20/g Genomic Tip DNA Extraction Kit Qiagen 10223
Qiagen Buffer EB (elution buffer) Qiagen 19086
Qiagen DNA Extraction Buffer Set Qiagen 19060
QiaRack Qiagen 19015
qPCR machine (e.g. Roche Light Cycler 480) Roche
qPCR plate sealing film Roche 4729757001
qPCR plate, 96 well plate Roche 4729692001
Qubit assay tubes Life Technologies Q32856
Qubit Broad Spectrum assay kit Life Technologies Q32850
Qubit High Sensitivity assay kit Life Technologies Q32851
RNaseA Qiagen 19101
Serological pipettes (20 ml) and pipet-aid Fisher 13-678-11
Small funnels, 1 per sample
Sodium Chloride Ambion AM9759
Soft paintbrush, 2 per sample
SPEX SamplePrep 2010 Geno/Grinder or another type of tissue homogenizer SPEX SamplePrep Or another comparable tissue homogenizer. If you do not have access to a tissue homogenizer, then grinding in a pre-chilled mortar and pestle will suffice (see protocol for details). However, a homogenizer will give more consistent results and total homogenization time is reduced.
Sucrose Omnipure 8550
TBE
thermomixer
Tris Sigma T2819-100ml
Triton X-100 Promega H5142
tube rotater
tubes, 50 mL conical polypropylene Corning 352070
tubes, 50 ml high-speed polypropylene  ThermoScientific/Nalgene 3119-0050 e.g. Nalgene Oakridge tubes or equivalent
vermiculite
water bath
water, sterile and certified Nuclease-free  Fisher 1481
water, sterile milliQ

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Miller, M. E., Liberatore, K. L., Kianian, S. F. Optimization and Comparative Analysis of Plant Organellar DNA Enrichment Methods Suitable for Next-generation Sequencing. J. Vis. Exp. (125), e55528, doi:10.3791/55528 (2017).

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