מיטוב וניתוח השוואתי של הצמח DNA Organnelar העשרה שיטות מתאים עבור הדור הבא רצף
Summary
ההשוואה ואופטימיזציה של שתי שיטות העשרה DNA DNA organellar צמח מוצגים: צנטריפוגה ההפרש הדיפרנציאלי ואת החלוקה של gDNA הכולל מבוסס על מצב מתילציה. אנו מעריכים את כמות הדנ"א וכתוצאה מכך, מדגימים ביצועים ברצף של הדור הבא, וקוראים את הפוטנציאל לשימוש ברצף המולקולה החד-פעמית.
Abstract
גנומים צמחיים מכילים רכיבים גדולים וחוזרים על עצמם, שעשויים לעבור זיווג או רקומבינציה ליצירת מבנים מורכבים ו / או קטעים גנומיים. גנומים של Organellar קיימים גם בתוספות בתוך תא נתון או סוג רקמות (heteroplasmy), ושפע של תת-סוגים עשויים להשתנות במהלך הפיתוח או כאשר נמצאים תחת לחץ (תת-סטויצ'יומטרי). הדור הבא רצף (NGS) טכנולוגיות נדרשים כדי להשיג הבנה עמוקה יותר של מבנה הגנום organellar ותפקוד. מחקרי רצף מסורתיים משתמשים במספר שיטות כדי להשיג DNA DNA: (1) אם נעשה שימוש בכמות גדולה של רקמה מתחילה, הוא הומוגני ונתון לצנטריפוגה דיפרנציאלית ו / או לטיהור הדרגתי. (2) אם נעשה שימוש בכמות קטנה יותר של רקמות ( כלומר, אם הזרעים, החומר או החלל מוגבלים), אותו תהליך מבוצע כמו (1), ולאחר מכן הגברה של הגנום כולו כדי להשיג מספיק DNA. (3) ניתוח ביואינפורמטיקה ניתן להשתמש כדי seqאת הדנ"א הגנומי הכולל ולנתח את הקריאה. לכל השיטות הללו יש אתגרים ופריצות. ב (1), זה יכול להיות קשה להשיג כזה כמות גדולה של רקמת החל; ב (2), הגברה הגנום כולו יכול להציג הטיה רצף; (3), הומולוגיה בין גנומים גרעיניים ו organellar יכול להפריע הרכבה וניתוח. במפעלים עם גנומים גרעיניים גדולים, זה יתרון להעשיר עבור DNA organellar כדי להפחית את עלויות הרצף ואת המורכבות רצף עבור ניתוחים ביואינפורמטיקה. כאן, אנו משווים שיטת צנטריפוגה דיפרנציאלית מסורתית בשיטה הרביעית, שיטה מתואמת CpG-methyl הנפתחת, כדי להפריד בין ה- DNA הגנומי הכולל לשברים גרעיניים ואורגניים. שתי השיטות מניבות די-אן-אי מספיק ל- NGS, DNA המועשר מאוד עבור רצפים אורגניים, אם כי ביחסים שונים במיטוכונדריה ובצ'לורופלסטים. אנו מציגים את האופטימיזציה של שיטות אלה עבור רקמות עלה חיטה ולדון היתרונות העיקריים דחסרונות של כל גישה בהקשר של קלט המדגם, קלות הפרוטוקול, ואת היישום במורד הזרם.
Introduction
רצף הגנום הוא כלי רב עוצמה לנתח את הבסיס הגנטי הבסיסי של תכונות המפעל חשוב. רוב מחקרי הגנום-רצף מתמקדים בתוכן הגנום הגרעיני, שכן רוב הגנים נמצאים בגרעין. עם זאת, גנומים אורגנואר, כולל המיטוכונדריה (על פני eukaryotes) ופלסטידים (בצמחים, הצורה המקצועית, הכלורופלסט, עובד בפוטוסינתזה) לתרום מידע גנטי משמעותי חיוני לפיתוח אורגניזמים, תגובת מתח, ואת הכושר הכללי 1 . גנומים של Organellar כלולים בדרך כלל בחריצות דנ"א הכוללות רצף גנומי גרעיני, למרות ששיטות להפחתת מספר האורגנים לפני החילוץ של דנ"א מועסקים גם 2 . מחקרים רבים השתמשו תוצאות רצף מתוך סך gDNA חילוץ להרכיב genelles organellar 3 , 4 , 5 ,Xref "> 6 , 7. עם זאת, כאשר המטרה של המחקר היא להתמקד genomes organellar, באמצעות gDNA הכולל מגדילה את עלויות רצף כי רבים קורא" אבודים "רצפי DNA גרעיני, במיוחד צמחים עם גנומים גרעיניים גדולים יתר על כן, בשל שכפול והעברת רצפים organellar לתוך הגנום הגרעיני בין האברונים, פתרון המיקום הנכון מיפוי של רצף קורא לגנום הנכון הוא מאתגר ביואינפורמטית 2 , 8. טיהור genomes organellar מן הגנום הגרעיני הוא אחד אסטרטגיות ביואינפורמטיקה נוספות ניתן להשתמש כדי להפריד קורא את המפה לאזורים של הומולוגיה בין המיטוכונדריה ו chloroplasts.
בעוד גנומים organellar ממין צמחים רבים כבר רצף, מעט ידוע על רוחב של מגוון גנום organellarזמין באוכלוסיות בר או בבריכות גידול מעובדות. גנומים Organellar ידועים גם להיות מולקולות דינמיות שעוברות סידור מבניים משמעותי עקב רקומבינציה בין רצפים חוזרים 9 . יתר על כן, עותקים מרובים של הגנום organellar כלולים בתוך כל אברון, ואת האברונים מרובים נמצאים בתוך כל תא. לא כל העותקים של גנומים אלה זהים, הידועה בשם הטרופלסמי. בניגוד לתמונה הקאנונית של "חוגי אב", יש כיום ראיות גוברות לתמונה מורכבת יותר של מבני גנום, כולל חוגים תת-גנומיים, כרומוזומים ליניאריים, קונקאמרים לינאריים ומבנים מסועפים 10 . ההרכבה של הגנום צמח organellar הוא מסובך עוד יותר על ידי גדלים גדולים יחסית שלהם חוזר משמעותי הפוך ישיר.
פרוטוקולים מסורתיים לבידוד organellar, טיהור דנ"א, ואת הגנום הבאים רצף דואר הם לעתים קרובות מסורבל ודורשים כמויות גדולות של קלט רקמות, עם כמה גרם כלפי מעלה של מאות גרם של רקמת עלה צעיר צורך כנקודת התחלה 11 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17 . זה עושה רצף הגנום organellar נגיש כאשר הרקמה מוגבלת. במצבים מסוימים, כמויות זרע מוגבלות, כגון כאשר יש צורך רצף על בסיס דורי או בקווים סטריליים זכרים כי צריך להישמר דרך חציית. במצבים אלה, DNA יכול להיות מטוהרים ולאחר מכן חשוף הגברה של הגנום כולו. עם זאת, הגברה שלמה הגנום יכול להציג הטיה רציף רצף, אשר היא בעיה מסוימת בעת הערכת וריאציה מבנית, מבנים גנומיים, ורמות heteroplasmy22 ההתקדמות האחרונה בהכנה לספריה לטווחים קצרים לקריאה של טכנולוגיות יש להתגבר על חסמי כניסה נמוכים כדי למנוע הגברה של הגנום כולו. לדוגמה, ערכת הכנה של ספריית NXTERA XT של Illumina XT מאפשרת מעט כמו 1 ng של DNA שישמש כקלט 19 . עם זאת, ההכנות הספריות סטנדרטיים עבור יישומים רצף לקרוא ארוך, כגון PacBio או אוקספורד Nanopore טכנולוגיות רצף, עדיין דורשים כמות גבוהה יחסית של ה- DNA קלט, אשר יכול להוות אתגר עבור רצף הגנום organellar. לאחרונה, חדש שפותח על ידי המשתמש, ארוך לקרוא פרוטוקולי רצף פותחו כדי להפחית את כמויות קלט כדי לעזור להקל על רצף הגנום בדגימות שבו קבלת מיקרוגרם כמויות של DNA קשה 20 , 21 . עם זאת, קבלת משקל מולקולרי גבוה, שברים organellar טהור להאכיל את ההכנות הספרייה הזאת נותרה אתגר.
חיפשנו לאO להשוות לייעל DNA העשרה organelar ושיטות בידוד מתאים NGS ללא צורך הגברה של הגנום כולו. באופן ספציפי, המטרה שלנו היתה לקבוע את שיטות העבודה המומלצות להעשרת עבור DNA גבוהה מולקולרית משקל organellar מחומרים החל מוגבל, כגון תת המדגם של עלה. עבודה זו מציגה ניתוח השוואתי של שיטות להעשיר עבור DNA organellar: (1) פרוטוקול צנטריפוגה דיפרנציאלית מסורתית שונה לעומת (2) פרוטוקול חלוקה DNA מבוסס על השימוש של דנ"א זמין מסחרית CpG-methyl- מחייב תחום גישה הנפתח חלבון 22 הוחל על רקמת הצמח 23 . אנו ממליצים על שיטות עבודה מומלצות לבידוד דנ"א אורגני מחיידק עלה חיטה, אשר ניתן להרחיב בקלות צמחים אחרים ורקמות סוגים.
Protocol
Representative Results
Discussion
עד כה, רוב מחקרים ברצף organellar מרכז בשיטות DC המסורתית להעשיר עבור DNA ספציפיים. שיטות לבודד אורגנים ממגוון צמחים תוארו, כולל מוס 40 ; מונוקולטים כגון חיטה 15 ו שיבולת שועל 11 ; ו dicots כגון arabidopsis 11 , חמניות 17 , ו rapes…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ברצוננו להודות במימון של מחלקת החקלאות של ארצות הברית – החקלאות שירות המחקר ו מן הקרן הלאומית למדע (IOS 1025881 ו IOS 1361554). אנו מודים ר 'Caspers עבור תחזוקת החממה טיפול הצמח. אנו מודים גם על אוניברסיטת מינסוטה גנומיקה מרכז, שם ההכנות הספרייה Illumina ורצף בוצעו. אנו גם אסירי תודה על הערות עורכי היומן וארבעה מבקרים אנונימיים שחיזקו עוד יותר את כתב היד שלנו. אנו גם מודים ל- OECD על מלגה ל- SK לשלב פרוטוקולים אלה לפרויקטים משותפים עם עמיתים ביפן.
Materials
| 2-mercaptoethanol (beta-mercaptoethanol; BME) | Sigma Aldrich | M3148-100ml | |
| 2-propanol (Isopropyl alcohol/isopropanol), bioreagent | Sigma Aldrich | I9516 | |
| agarose, Bio-Rad Cetified Megabase agarose | Bio-Rad | 1613108 | |
| analytical balance | Mettler Toledo | AB54-S | |
| balance | Mettler Toledo | PB1502-S | |
| bovine serum albumin (BSA) | Sigma Aldrich | B4287-25G | |
| Ceramic grinding cylinders, 3/8in x 7/8in | SPEX SamplePrep | 2183 | |
| Cryogenic Blocks compatible with tissue homogenizer for holding 50 ml tubes | SPEX SamplePrep | 2664 | |
| DNaseI | Sigma | DN25 | |
| ethanol, absolute | Decon Laboratories | 2716 | |
| Ethylenediamine Tetraacetic Acid (EDTA), 0.5M Solution, pH8.0 | Fisher | BP2482-500 | |
| gel imaging system | |||
| gel stain | Such as GelRed or Ethidium Bromide | ||
| grinding pestle, wide tip for 2 ml conical tubes | |||
| Guanidine-HCl, 8M solution | ThermoFisher | 24115 | |
| LightCycler 480 SYBR Green I Master | Roche | 4707516001 | |
| liquid nitrogen | |||
| Lysing enzymes from Trichoderma harzianum | Sigma | L1412 | |
| Magnesium Chloride | G Bioscience | 24115 | |
| magnetic rack | ThermoFisher | A13346 | |
| microcentrifuge tubes, LoBind 1.5 ml | Eppendorf | 22431021 | |
| microcentrifuge tubes, standard nuclease-free 1.5 ml | Eppendorf | ||
| microcentrifuge, refrigerated | Sorvall | Legend X1R | Or equivalent product, must be capable of reaching at least 18,000 x g with rotors for 50 ml tubes, Oak Ridge tubes, and 1.5 ml tubes |
| microcentrifuge, room temperature | Eppendorf | 5424 | Or equivalent product, must be capable of reaching at least 18,000 x g with rotor for 1.5 ml and 2 ml microcentrifuge tubes |
| Microcon DNA Fast Flow Centrifugal Filter Units | EMD Millipore | MRCFOR100 | |
| Miracloth, 1 square per sample cut to fit funnel | EMD Millipore | 475855 | |
| NEBNext Microbiome DNA Enrichment Kit | New England Biolabs | E2612L | |
| parafilm | Parafilm M | PM992 | |
| plastic pots and trays | |||
| polyvinylpyrrolidone (PVP) | Fisher | BP431-100 | |
| Proteinase K | Qiagen | 19131 | |
| Pulsed-Field Gel Electrophoresis rig (e.g. CHEF DR III) | Bio-Rad | 1703697 | |
| purification beads, Agencourt AMpureXP beads | Beckman Coulter | A63881 | |
| QIAamp DNA Mini Kit | Qiagen | 51304 | |
| Qiagen 20/g Genomic Tip DNA Extraction Kit | Qiagen | 10223 | |
| Qiagen Buffer EB (elution buffer) | Qiagen | 19086 | |
| Qiagen DNA Extraction Buffer Set | Qiagen | 19060 | |
| QiaRack | Qiagen | 19015 | |
| qPCR machine (e.g. Roche Light Cycler 480) | Roche | ||
| qPCR plate sealing film | Roche | 4729757001 | |
| qPCR plate, 96 well plate | Roche | 4729692001 | |
| Qubit assay tubes | Life Technologies | Q32856 | |
| Qubit Broad Spectrum assay kit | Life Technologies | Q32850 | |
| Qubit High Sensitivity assay kit | Life Technologies | Q32851 | |
| RNaseA | Qiagen | 19101 | |
| Serological pipettes (20 ml) and pipet-aid | Fisher | 13-678-11 | |
| Small funnels, 1 per sample | |||
| Sodium Chloride | Ambion | AM9759 | |
| Soft paintbrush, 2 per sample | |||
| SPEX SamplePrep 2010 Geno/Grinder or another type of tissue homogenizer | SPEX SamplePrep | Or another comparable tissue homogenizer. If you do not have access to a tissue homogenizer, then grinding in a pre-chilled mortar and pestle will suffice (see protocol for details). However, a homogenizer will give more consistent results and total homogenization time is reduced. | |
| Sucrose | Omnipure | 8550 | |
| TBE | |||
| thermomixer | |||
| Tris | Sigma | T2819-100ml | |
| Triton X-100 | Promega | H5142 | |
| tube rotater | |||
| tubes, 50 mL conical polypropylene | Corning | 352070 | |
| tubes, 50 ml high-speed polypropylene | ThermoScientific/Nalgene | 3119-0050 | e.g. Nalgene Oakridge tubes or equivalent |
| vermiculite | |||
| water bath | |||
| water, sterile and certified Nuclease-free | Fisher | 1481 | |
| water, sterile milliQ |
References
- Liberatore, K. L., Dukowic-Schulze, S., Miller, M. E., Chen, C., Kianian, S. F. The role of mitochondria in plant development and stress tolerance. Free Radic Biol Med. 100, 238-256 (2016).
- Samaniego Castruita, J. A., Zepeda Mendoza, M. L., Barnett, R., Wales, N., Gilbert, M. T. Odintifier–A computational method for identifying insertions of organellar origin from modern and ancient high-throughput sequencing data based on haplotype phasing. BMC Bioinformatics. 16 (232), 1-13 (2015).
- Zhang, T., Zhang, X., Hu, S., Yu, J. An efficient procedure for plant organellar genome assembly, based on whole genome data from the 454 GS FLX sequencing platform. Plant Methods. 7 (38), 1-8 (2011).
- Wambugu, P. W., Brozynska, M., Furtado, A., Waters, D. L., Henry, R. J. Relationships of wild and domesticated rices (Oryza AA genome species) based upon whole chloroplast genome sequences. Sci Rep. 5 (13957), 1-9 (2015).
- Iorizzo, M., et al. De novo assembly of the carrot mitochondrial genome using next generation sequencing of whole genomic DNA provides first evidence of DNA transfer into an angiosperm plastid genome. BMC Plant Biol. 12 (61), 1-17 (2012).
- Park, S., et al. Complete sequences of organelle genomes from the medicinal plant Rhazya stricta (Apocynaceae) and contrasting patterns of mitochondrial genome evolution across asterids. BMC Genomics. 15 (405), 1-18 (2014).
- Skippington, E., Barkman, T. J., Rice, D. W., Palmer, J. D. Miniaturized mitogenome of the parasitic plant Viscum scurruloideum is extremely divergent and dynamic and has lost all nad genes. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (27), E3515-E3524 (2015).
- Wicke, S., Schneeweiss, G. M., Hörandl, E., Appelhans, M. Chapter 1. Next Generation Sequencing in Plant Systematics. , (2015).
- Sloan, D. B. One ring to rule them all? Genome sequencing provides new insights into the ‘master circle’ model of plant mitochondrial DNA structure. New Phytol. 200 (4), 978-985 (2013).
- Woloszynska, M. Heteroplasmy and stoichiometric complexity of plant mitochondrial genomes–though this be madness, yet there’s method in’t. J Exp Bot. 61 (3), 657-671 (2010).
- Ahmed, Z., Fu, Y. B. An improved method with a wider applicability to isolate plant mitochondria for mtDNA extraction. Plant Methods. 11 (56), 1-11 (2015).
- Ejaz, M., et al. Comparison of small scale methods for the rapid and efficient extraction of mitochondrial DNA from wheat crop suitable for down-stream processes. Genet Mol Res. 13 (4), 10320-10331 (2014).
- Eubel, H., Heazlewood, J. L., Millar, A. H. Isolation and subfractionation of plant mitochondria for proteomic analysis. Methods Mol Biol. 355, 49-62 (2007).
- Hao, W., Fan, S., Hua, W., Wang, H. Effective extraction and assembly methods for simultaneously obtaining plastid and mitochondrial genomes. PLoS One. 9 (9), e108291 (2014).
- Pomeroy, M. K. Studies on the respiratory properties of mitochondria isolated from developing winter wheat seedlings. Plant Physiol. 53 (4), 653-657 (1974).
- Taylor, N. L., Stroher, E., Millar, A. H. Arabidopsis organelle isolation and characterization. Methods Mol Biol. 1062, 551-572 (2014).
- Triboush, S. O., Danilenko, N. G., Davydenko, O. G. A method for isolation of chloroplast DNA and mitochondrial DNA from Sunflower. Plant Mol Biol Rep. 16 (2), 183-189 (1998).
- Pinard, R., et al. Assessment of whole genome amplification-induced bias through high-throughput, massively parallel whole genome sequencing. BMC Genomics. 7 (216), 1-21 (2006).
- Lamble, S., et al. Improved workflows for high throughput library preparation using the transposome-based Nextera system. BMC Biotechnol. 13 (104), 1-10 (2013).
- Raley, C., et al. Preparation of next-generation DNA sequencing libraries from ultra-low amounts of input DNA: Application to single-molecule, real-time (SMRT) sequencing on the Pacific Biosciences RS II. bioRxiv. , (2014).
- Tsai, Y. C., et al. Resolving the Complexity of Human Skin Metagenomes Using Single-Molecule Sequencing. MBio. 7 (1), e01948 (2016).
- Feehery, G. R., et al. A method for selectively enriching microbial DNA from contaminating vertebrate host DNA. PLoS One. 8 (10), e76096 (2013).
- Yigit, E., Hernandez, D. I., Trujillo, J. T., Dimalanta, E., Bailey, C. D. Genome and metagenome sequencing: Using the human methyl-binding domain to partition genomic DNA derived from plant tissues. Appl Plant Sci. 2 (11), 1-6 (2014).
- Noyszewski, A. K., et al. Accelerated evolution of the mitochondrial genome in an alloplasmic line of durum wheat. BMC Genomics. 15 (67), 1-16 (2014).
- . QIAamp DNA Mini and Blood Mini Handbook Available from: https://www.qiagen.com/ch/resources/ (2016)
- . User developed protocol: Isolation of genomic DNA from plants and filamentous fungi using the QIAGEN Genomic-tip – (EN) Available from: https://www.qiagen.com/ch/resources/ (2001)
- . QIAGEN Genomic DNA Handbook Available from: https://www.qiagen.com/ch/resources/ (2012)
- Bolger, A. M., Lohse, M., Usadel, B. Trimmomatic: a flexible trimmer for Illumina sequence data. Bioinformatics. 30 (15), 2114-2120 (2014).
- Ogihara, Y., et al. Structural dynamics of cereal mitochondrial genomes as revealed by complete nucleotide sequencing of the wheat mitochondrial genome. Nucleic Acids Res. 33 (19), 6235-6250 (2005).
- Ogihara, Y., et al. Structural features of a wheat plastome as revealed by complete sequencing of chloroplast DNA. Mol Genet Genomics. 266 (5), 740-746 (2002).
- International Wheat Genome Sequencing Consortium (IWGSC). A chromosome-based draft sequence of the hexaploid bread wheat (Triticum aestivum) genome. Science. 345 (6194), (2014).
- Langmead, B., Salzberg, S. L. Fast gapped-read alignment with Bowtie 2. Nat Methods. 9 (4), 357-359 (2012).
- Bendich, A. J. Why do chloroplasts and mitochondria contain so many copies of their genome?. Bioessays. 6 (6), 279-282 (1987).
- Kumar, R. A., Oldenburg, D. J., Bendich, A. J. Changes in DNA damage, molecular integrity, and copy number for plastid DNA and mitochondrial DNA during maize development. J Exp Bot. 65 (22), 6425-6439 (2014).
- Ma, J., Li, X. Q. Organellar genome copy number variation and integrity during moderate maturation of roots and leaves of maize seedlings. Curr Genet. 61 (4), 591-600 (2015).
- Lang, E. G., et al. Simultaneous isolation of pure and intact chloroplasts and mitochondria from moss as the basis for sub-cellular proteomics. Plant Cell Rep. 30 (2), 205-215 (2011).
- Tobin, A. K. Subcellular fractionation of plant tissues. Isolation of chloroplasts and mitochondria from leaves. Methods Mol Biol. 59, 57-68 (1996).
