Optimización y Análisis Comparativo de Métodos de Enriquecimiento de ADN de Organelos Vegetales Adecuados para Secuenciación de Próxima Generación
Summary
Se presentan la comparación y optimización de dos métodos de enriquecimiento de ADN organelar de plantas: centrifugación diferencial tradicional y fraccionamiento del gDNA total basado en el estado de metilación. Evaluamos la cantidad y calidad de ADN resultante, demostramos el rendimiento en secuenciación de próxima generación de lectura corta y discutimos el potencial de uso en la secuenciación de una molécula de larga lectura.
Abstract
Los genomas organelares de las plantas contienen grandes elementos repetitivos que pueden someterse a apareamiento o recombinación para formar estructuras complejas y / o fragmentos sub-genómicos. Los genomas organelas también existen en mezclas dentro de una célula o tipo de tejido dado (heteroplasmia), y una abundancia de subtipos puede cambiar durante el desarrollo o cuando está bajo tensión (desplazamiento subestequiométrico). Se requieren tecnologías de secuenciación de próxima generación (NGS) para obtener una comprensión más profunda de la estructura y la función del genoma organelar. Los estudios de secuenciación tradicionales utilizan varios métodos para obtener ADN organelar: (1) Si se utiliza una gran cantidad de tejido de partida, se homogeneiza y se somete a centrifugación diferencial y / o gradiente de purificación. (2) Si se utiliza una cantidad menor de tejido ( es decir, si las semillas, el material o el espacio son limitados), se realiza el mismo proceso que en (1), seguido por amplificación del genoma completo para obtener suficiente ADN. (3) El análisis bioinformático puede ser usado para buscarEl ADN genómico total y analizar las lecturas organelas. Todos estos métodos tienen desafíos inherentes y compensaciones. En (1), puede ser difícil obtener una cantidad tan grande de tejido de partida; En (2), la amplificación de todo el genoma podría introducir un sesgo de secuenciación; Y en (3), la homología entre los genomas nucleares y organelas podría interferir con el montaje y el análisis. En plantas con genomas nucleares grandes, es ventajoso enriquecer el ADN organelar para reducir los costos de secuenciación y la complejidad de la secuencia para los análisis bioinformáticos. Aquí, comparamos un método de centrifugación diferencial tradicional con un cuarto método, un enfoque adaptado CpG-metil pulldown, para separar el ADN genómico total en fracciones nucleares y organelares. Ambos métodos producen suficiente ADN para NGS, el ADN que está altamente enriquecido para las secuencias organelares, aunque en diferentes proporciones en las mitocondrias y los cloroplastos. Se presenta la optimización de estos métodos para el tejido foliar de trigo y se discuten las principales ventajas ydLas ventajas de cada enfoque en el contexto de la entrada de la muestra, la facilidad del protocolo, y la aplicación descendente.
Introduction
La secuenciación del genoma es una poderosa herramienta para disecar la base genética subyacente de rasgos importantes de las plantas. La mayoría de los estudios de secuenciación del genoma se centran en el contenido del genoma nuclear, ya que la mayoría de los genes se encuentran en el núcleo. Sin embargo, los genomas organelos, incluyendo las mitocondrias (a través de eucariotas) y plastidios (en las plantas, la forma especializada, el cloroplasto, trabaja en fotosíntesis) aportan información genética significativa esencial para el desarrollo de organismos, la respuesta al estrés y la aptitud general 1 . Genomas organelas se incluyen normalmente en el total de extracciones de ADN destinados a la secuenciación del genoma nuclear, aunque los métodos para reducir el número de organelos antes de la extracción de ADN también se emplean [ 2] . Muchos estudios han utilizado resultados de secuenciación de las extracciones totales de gDNA para ensamblar genomas organelos 3 , 4 , 5 ,Xref "> 6 , 7. Sin embargo, cuando el objetivo del estudio es centrarse en los genomas organelares, el uso del gDNA total incrementa los costos de secuenciación debido a que muchas lecturas están" perdidas "en las secuencias de ADN nuclear, particularmente en plantas con genomas nucleares grandes Además, debido a la duplicación y transferencia de secuencias organelares en el genoma nuclear y entre orgánulos, la resolución de la posición correcta de la cartografía de secuenciación lee al genoma adecuado es bioinformatically desafiante 2 , 8. La purificación de los genomas organelares del genoma nuclear es uno Estrategia para reducir estos problemas.Más estrategias bioinformáticas se pueden utilizar para separar las lecturas que mapa a las regiones de homología entre las mitocondrias y los cloroplastos.
Mientras que los genomas organelares de muchas especies de plantas han sido secuenciados, poco se sabe acerca de la amplitud de la diversidad de genomas organelosDisponible en poblaciones silvestres o en piscinas de cría cultivadas. También se sabe que los genomas organelares son moléculas dinámicas que experimentan un reordenamiento estructural significativo debido a la recombinación entre secuencias repetidas 9 . Además, múltiples copias del genoma organelo están contenidas dentro de cada orgánulo, y múltiples organelos están contenidos dentro de cada célula. No todas las copias de estos genomas son idénticos, que se conoce como heteroplasmia. En contraste con el cuadro canónico de "círculos maestros", ahora hay evidencia creciente de una imagen más compleja de las estructuras del genoma organelar, incluidos los círculos sub-genómica, cromosomas lineales, concatamers lineales y estructuras ramificadas [ 10] . El ensamblaje de los genomas organelares de las plantas se complica aún más por sus tamaños relativamente grandes y sus sustanciales repeticiones invertidas y directas.
Los protocolos tradicionales para el aislamiento organelar, la purificación del ADN y el subsiguiente genoma La secuenciación a menudo es engorrosa y requiere grandes volúmenes de entrada de tejido, con varios gramos a más de cientos de gramos de tejido de hoja joven necesarios como punto de partida 11 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17 . Esto hace inaccesible la secuenciación del genoma organelo cuando el tejido es limitado. En algunas situaciones, las cantidades de semillas son limitadas, como cuando es necesario secuenciar sobre una base generacional o en líneas masculinas estériles que tienen que ser mantenidas por cruce. En estas situaciones, el ADN organelar puede purificarse y luego someterse a amplificación de todo el genoma. Sin embargo, la amplificación del genoma completo puede introducir sesgo de secuenciación significativo, que es un problema particular al evaluar la variación estructural, las estructuras sub-genómicas y los niveles de heteroplasmia> 18. Los avances recientes en la preparación de bibliotecas para tecnologías de secuenciación de lectura corta han superado barreras de entrada baja para evitar la amplificación del genoma completo. Por ejemplo, el kit de preparación de biblioteca de Illumina Nextera XT permite que se utilice tan poco como 1 ng de ADN como entrada 19 . Sin embargo, las preparaciones de bibliotecas estándar para aplicaciones de secuenciación de larga lectura, como las tecnologías de secuenciación PacBio o Oxford Nanopore, todavía requieren una cantidad relativamente alta de ADN de entrada, lo que puede representar un reto para la secuenciación del genoma organelo. Recientemente, se han desarrollado nuevos protocolos de secuenciación de larga lectura para reducir las cantidades de entrada y ayudar a facilitar la secuenciación del genoma en muestras en las que es difícil obtener cantidades de microgramos de ADN 20 , 21 . Sin embargo, la obtención de fracciones orgánicas puras de alto peso molecular para alimentar estas preparaciones de biblioteca sigue siendo un desafío.
BuscamosO comparar y optimizar los métodos de enriquecimiento y aislamiento de ADN organelar adecuados para NGS sin necesidad de amplificación de todo el genoma. Específicamente, nuestro objetivo era determinar las mejores prácticas para enriquecer el ADN organelar de alto peso molecular a partir de materiales de partida limitados, como una submuestra de una hoja. Este trabajo presenta un análisis comparativo de los métodos para enriquecer el ADN organelar: (1) un protocolo de centrifugación diferencial tradicional modificado versus (2) un protocolo de fraccionamiento de ADN basado en el uso de un ADN comercialmente disponible CpG-metil-binding domain protein pulldown approach 22 aplicado al tejido vegetal 23 . Recomendamos las mejores prácticas para el aislamiento de ADN organelar de tejido de hoja de trigo, que puede ser fácilmente extendido a otras plantas y tipos de tejidos.
Protocol
Representative Results
Discussion
Hasta la fecha, la mayoría de los estudios de secuenciación organelar se centran en los métodos tradicionales de CC para enriquecer el ADN específico. Métodos para aislar orgánulos de diversas plantas se han descrito, incluyendo el musgo 40 ; Monocotiledóneas tales como trigo 15 y avena 11 ; Y dicotiledóneas tales como arabidopsis 11 , girasol 17 , y colza 14 . La mayor?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nos gustaría agradecer el financiamiento del Departamento de Agricultura de Estados Unidos – Servicio de Investigación Agrícola y de la National Science Foundation (IOS 1025881 e IOS 1361554). Damos las gracias a R. Caspers por el mantenimiento de invernaderos y el cuidado de las plantas. También damos las gracias al Centro de Genómica de la Universidad de Minnesota, donde se realizaron los preparativos de la biblioteca de Illumina y la secuenciación. También estamos agradecidos por los comentarios de los editores de la revista y cuatro revisores anónimos que fortalecieron aún más nuestro manuscrito. También agradecemos a la OCDE por una beca a SK para integrar estos protocolos para proyectos colaborativos con colegas en Japón.
Materials
| 2-mercaptoethanol (beta-mercaptoethanol; BME) | Sigma Aldrich | M3148-100ml | |
| 2-propanol (Isopropyl alcohol/isopropanol), bioreagent | Sigma Aldrich | I9516 | |
| agarose, Bio-Rad Cetified Megabase agarose | Bio-Rad | 1613108 | |
| analytical balance | Mettler Toledo | AB54-S | |
| balance | Mettler Toledo | PB1502-S | |
| bovine serum albumin (BSA) | Sigma Aldrich | B4287-25G | |
| Ceramic grinding cylinders, 3/8in x 7/8in | SPEX SamplePrep | 2183 | |
| Cryogenic Blocks compatible with tissue homogenizer for holding 50 ml tubes | SPEX SamplePrep | 2664 | |
| DNaseI | Sigma | DN25 | |
| ethanol, absolute | Decon Laboratories | 2716 | |
| Ethylenediamine Tetraacetic Acid (EDTA), 0.5M Solution, pH8.0 | Fisher | BP2482-500 | |
| gel imaging system | |||
| gel stain | Such as GelRed or Ethidium Bromide | ||
| grinding pestle, wide tip for 2 ml conical tubes | |||
| Guanidine-HCl, 8M solution | ThermoFisher | 24115 | |
| LightCycler 480 SYBR Green I Master | Roche | 4707516001 | |
| liquid nitrogen | |||
| Lysing enzymes from Trichoderma harzianum | Sigma | L1412 | |
| Magnesium Chloride | G Bioscience | 24115 | |
| magnetic rack | ThermoFisher | A13346 | |
| microcentrifuge tubes, LoBind 1.5 ml | Eppendorf | 22431021 | |
| microcentrifuge tubes, standard nuclease-free 1.5 ml | Eppendorf | ||
| microcentrifuge, refrigerated | Sorvall | Legend X1R | Or equivalent product, must be capable of reaching at least 18,000 x g with rotors for 50 ml tubes, Oak Ridge tubes, and 1.5 ml tubes |
| microcentrifuge, room temperature | Eppendorf | 5424 | Or equivalent product, must be capable of reaching at least 18,000 x g with rotor for 1.5 ml and 2 ml microcentrifuge tubes |
| Microcon DNA Fast Flow Centrifugal Filter Units | EMD Millipore | MRCFOR100 | |
| Miracloth, 1 square per sample cut to fit funnel | EMD Millipore | 475855 | |
| NEBNext Microbiome DNA Enrichment Kit | New England Biolabs | E2612L | |
| parafilm | Parafilm M | PM992 | |
| plastic pots and trays | |||
| polyvinylpyrrolidone (PVP) | Fisher | BP431-100 | |
| Proteinase K | Qiagen | 19131 | |
| Pulsed-Field Gel Electrophoresis rig (e.g. CHEF DR III) | Bio-Rad | 1703697 | |
| purification beads, Agencourt AMpureXP beads | Beckman Coulter | A63881 | |
| QIAamp DNA Mini Kit | Qiagen | 51304 | |
| Qiagen 20/g Genomic Tip DNA Extraction Kit | Qiagen | 10223 | |
| Qiagen Buffer EB (elution buffer) | Qiagen | 19086 | |
| Qiagen DNA Extraction Buffer Set | Qiagen | 19060 | |
| QiaRack | Qiagen | 19015 | |
| qPCR machine (e.g. Roche Light Cycler 480) | Roche | ||
| qPCR plate sealing film | Roche | 4729757001 | |
| qPCR plate, 96 well plate | Roche | 4729692001 | |
| Qubit assay tubes | Life Technologies | Q32856 | |
| Qubit Broad Spectrum assay kit | Life Technologies | Q32850 | |
| Qubit High Sensitivity assay kit | Life Technologies | Q32851 | |
| RNaseA | Qiagen | 19101 | |
| Serological pipettes (20 ml) and pipet-aid | Fisher | 13-678-11 | |
| Small funnels, 1 per sample | |||
| Sodium Chloride | Ambion | AM9759 | |
| Soft paintbrush, 2 per sample | |||
| SPEX SamplePrep 2010 Geno/Grinder or another type of tissue homogenizer | SPEX SamplePrep | Or another comparable tissue homogenizer. If you do not have access to a tissue homogenizer, then grinding in a pre-chilled mortar and pestle will suffice (see protocol for details). However, a homogenizer will give more consistent results and total homogenization time is reduced. | |
| Sucrose | Omnipure | 8550 | |
| TBE | |||
| thermomixer | |||
| Tris | Sigma | T2819-100ml | |
| Triton X-100 | Promega | H5142 | |
| tube rotater | |||
| tubes, 50 mL conical polypropylene | Corning | 352070 | |
| tubes, 50 ml high-speed polypropylene | ThermoScientific/Nalgene | 3119-0050 | e.g. Nalgene Oakridge tubes or equivalent |
| vermiculite | |||
| water bath | |||
| water, sterile and certified Nuclease-free | Fisher | 1481 | |
| water, sterile milliQ |
References
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