차세대 시퀀싱에 적합한 식물성 세포질 DNA 농축 방법의 최적화 및 비교 분석
Summary
2 가지 plant organellar DNA 농축 방법의 비교 및 최적화가 제시됩니다 : 전통적인 차동 원심 분리 및 메틸화 상태에 기초한 총 gDNA 분획. 우리는 결과로 나오는 DNA 양과 품질을 평가하고, 짧은 읽기 차세대 시퀀싱에서의 성능을 시연하며, 장시간 읽기 단일 분자 시퀀싱에서의 사용 가능성에 대해 논의합니다.
Abstract
식물 세포 소기관 게놈은 복잡한 구조 및 / 또는 서브 게놈 조각을 형성하기 위해 페어링 또는 재조합을 거칠 수있는 크고 반복적 인 요소를 포함합니다. Organellar 게놈은 또한 주어진 세포 또는 조직 유형 (heteroplasmy) 내의 혼합물에 존재하며, 아형의 다량은 발육 기간 동안 또는 스트레스하에있을 때 (부분 화학량 론적 이동) 변화 할 수있다. 세포 기관 게놈 구조와 기능에 대한 더 깊은 이해를 위해서는 차세대 시퀀싱 (NGS) 기술이 필요합니다. 전통적인 sequencing 연구는 organellar DNA를 얻기 위해 몇 가지 방법을 사용합니다 : (1) 대량의 시작 조직이 사용되면 균질화되고 차등 원심 분리 및 / 또는 기울기 정화가 이루어집니다. (종자, 재료 또는 공간이 한정되어있는 경우, 즉) (2) 조직의 작은 양이 사용된다면, 동일한 프로세스는 (1) 충분한 DNA를 얻기 위해 전체 게놈 증폭 다음과 같이 수행된다. (3) 생물 정보학 분석은 seq전체 게놈 DNA를 분석하고 세포 기관 판독을 분석합니다. 이러한 모든 방법에는 고유 한 문제점과 단점이 있습니다. (1)에서 이와 같이 많은 양의 시작 조직을 얻는 것이 어려울 수 있습니다. (2)에서, 전체 게놈 증폭은 시퀀싱 바이어스를 도입 할 수있다; (3)에서 핵과 세포 내 게놈 간의 상동 성은 집합과 분석을 방해 할 수있다. 거대한 핵 게놈을 가진 식물에서, organellar DNA를 풍부하게하여 생물 정보학 분석을위한 서열화 비용 및 서열 복잡성을 줄이는 것이 유리하다. 여기에서 전통적인 차동 원심 분리 방법과 네 번째 방법 인 CpG- 메틸 풀다운 방식을 비교하여 총 게놈 DNA를 핵 및 세포 내 분획으로 분리합니다. 두 가지 방법 모두 미토콘드리아와 엽록체의 비율이 다르긴하지만 세포 내 소기관 서열에 대해 고도로 농축 된 DNA 인 NGS에 충분한 양의 DNA를 생산합니다. 우리는 밀 잎 조직을위한 이러한 방법의 최적화를 제시하고 주요 이점과 d샘플 입력, 프로토콜 용이성 및 다운 스트림 응용 프로그램의 맥락에서 각 접근법의 단점.
Introduction
게놈 시퀀싱은 중요한 식물 형질의 기본 유전 적 기초를 분석하는 강력한 도구입니다. 대부분의 게놈 시퀀싱 연구는 대부분의 유전자가 핵에 위치하므로 핵 게놈 내용에 초점을 맞 춥니 다. 그러나, (진핵 생물에서) 미토콘드리아와 색소체 포함 organellar 게놈 (식물, 전문화 된 형태로, 엽록체, 광합성에서 작동)는 생명체의 개발, 스트레스 반응 및 전반적인 체력 1에 필수적인 중요한 유전 정보를 기여한다. Organellar 게놈은 일반적으로 핵 게놈 시퀀싱을위한 총 DNA 추출에 포함되지만 DNA 추출 이전에 세포 소기관 수를 줄이는 방법도 사용됩니다 2 . 많은 연구에서 전체 gDNA 추출물의 sequencing 결과를 사용하여 organellar 게놈 3 , 4 , 5 ,xref "> 6 , 7. 그러나 연구 대상이 세포 소기관 게놈에 초점을 맞추고있을 때 많은 gDNA가 핵산 염기 서열에"손실 "되어 있기 때문에 전체 핵산을 사용하면 시퀀싱 비용이 증가합니다. 적당한 게놈, bioinformatically 8 도전 2에 관한 것이다. 또한, 염기 서열의 정확한지도 위치를 해결 중복 핵 게놈 내로 소기관 사이 organellar 서열의 전사에 의한 읽기. 핵 게놈 organellar 게놈의 정제 하나이다 전략을 사용하여 미토콘드리아와 엽록체 사이의 상 동성 영역으로 매핑되는 판독을 분리 할 수 있습니다.
많은 식물 종의 세포 소기관 게놈이 서열화되어 있지만, 소기관 게놈 다양성의 폭은 거의 알려져 있지 않습니다야생 개체군 또는 경작 된 육종 풀에서 이용 가능하다. Organellar 게놈은 또한 반복 서열 9 사이의 재조합으로 인해 중요한 구조적 재 배열을 거친 동적 분자로 알려져있다. 또한, 세포 소기관 게놈의 여러 사본이 각 세포 소기관에 포함되어 있으며, 여러 세포 소기관이 각 세포 내에 포함되어 있습니다. 이 게놈의 모든 사본이 동일하다는 것은 이질균이라고 알려져 있습니다. "마스터 서클"의 정경과는 달리 하위 게놈 서클, 선형 염색체, 선형 concatamers 및 가지 형 구조 10을 포함하여 organellar 게놈 구조의 더 복잡한 그림에 대한 증거가 증가하고 있습니다. 식물 세포 소기관 게놈의 조립은 상대적으로 큰 크기와 상당한 거꾸로 된 직접 반복에 의해 더욱 복잡해진다.
세포 기관 분리, DNA 정제 및 후속 유전체에 대한 기존의 프로토콜 전자 시퀀싱은 종종 성가 시며 많은 양의 조직을 필요로하며 수백 g의 어린 잎 조직을 출발점 11 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17로 필요로 합니다. 이렇게하면 조직이 제한되어있을 때 세포 내 게놈 시퀀싱을 사용할 수 없게됩니다. 어떤 상황에서는, 세대 간 (through generational basis) 또는 교차점을 통해 유지되어야하는 수컷 멸균 계통에서 필요할 때와 같이, 종자의 양은 제한적이다. 이러한 상황에서 세포 내 소기관 DNA를 정제 한 다음 전체 게놈 증폭을 수행 할 수 있습니다. 그러나 전체 게놈 증폭은 구조적 변이, 하위 게놈 구조 및 이종성 수준을 평가할 때 특히 중요한 문제인 시퀀싱 바이어스를 도입 할 수 있습니다> 18. 짧은 읽기 시퀀싱 기술에 대한 라이브러리 준비의 최근 발전은 전체 게놈 증폭을 피하기 위해 낮은 입력 장벽을 극복했습니다. 예를 들어, Illumina Nextera XT 라이브러리 준비 키트는 1 ng의 적은 DNA를 입력으로 사용할 수 있습니다 19 . 그러나 PacBio 또는 Oxford Nanopore 시퀀싱 기술과 같은 장시간 시퀀싱 응용 프로그램을위한 표준 라이브러리 준비에는 여전히 많은 양의 입력 DNA가 필요하며 이는 세포 내 게놈 시퀀싱에 대한 도전이 될 수 있습니다. 최근에, 입력량을 줄이고 마이크로 그램 – 양의 DNA를 얻기가 어려운 시료에서 게놈 시퀀싱을 용이하게하기 위해 사용자가 작성한 긴 판독 시퀀싱 프로토콜이 개발되었습니다 20 , 21 . 그러나, 고 분자량의 순수한 세포 내 소 분획을 이들 라이브러리 제제에 공급하는 것은 여전히 어려운 과제이다.
우리는o 전체 게놈 증폭없이 NGS에 적합한 세포 내 DNA 농축 및 분리 방법을 비교 및 최적화합니다. 구체적으로, 우리의 목표는 잎의 하위 샘플과 같이 제한된 출발 물질로부터 고 분자량 세포 기관 DNA를 풍부하게하는 우수 사례를 결정하는 것이 었습니다. 이 연구는 organellar DNA를 풍부하게하는 방법의 비교 분석을 제시한다 : (1) 상업적으로 이용 가능한 DNA CpG- 메틸 결합 도메인 단백질 풀다운 접근의 사용에 기초한 DNA 분획 프로토콜 (2) 수정 된 전통적인 분별 원심 분리 프로토콜 22 식물 조직에 적용 23 . 우리는 다른 식물 및 조직 유형으로 쉽게 확장 될 수있는 밀엽 조직으로부터 세포 기관 DNA를 분리하는 최상의 방법을 권장합니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
지금까지 대부분의 organellar sequencing 연구는 특정 DC를 풍부하게하는 전통적인 DC 방법에 초점을두고 있습니다. 모스 ( 40)를 포함하여 다양한 식물로부터 세포 소기관을 분리하는 방법이 설명되었다. 밀 15 및 귀리 11 과 같은 단핵구; 아라비돕시스 11 , 해바라기 17 , 유채 14 등의 족자입니다. ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
우리는 미국 농무부 농업 연구청과 국립 과학 재단 (IOS 1025881 및 IOS 1361554)으로부터 자금을 지원하고 싶습니다. 우리는 R. Caspers에게 온실 유지 관리 및 식물 관리에 감사드립니다. 우리는 Illumina 라이브러리 준비 및 시퀀싱이 수행 된 Minnesota Genomics Center 대학에도 감사드립니다. 저널 편집자와 4 명의 익명의 평론가가 우리 원고를 더욱 강화시킨 것에 대해 감사드립니다. 우리는 또한 OECD가 일본의 동료들과 협력 프로젝트를 위해 이러한 프로토콜을 통합하는 SK와의 협력에 감사한다.
Materials
| 2-mercaptoethanol (beta-mercaptoethanol; BME) | Sigma Aldrich | M3148-100ml | |
| 2-propanol (Isopropyl alcohol/isopropanol), bioreagent | Sigma Aldrich | I9516 | |
| agarose, Bio-Rad Cetified Megabase agarose | Bio-Rad | 1613108 | |
| analytical balance | Mettler Toledo | AB54-S | |
| balance | Mettler Toledo | PB1502-S | |
| bovine serum albumin (BSA) | Sigma Aldrich | B4287-25G | |
| Ceramic grinding cylinders, 3/8in x 7/8in | SPEX SamplePrep | 2183 | |
| Cryogenic Blocks compatible with tissue homogenizer for holding 50 ml tubes | SPEX SamplePrep | 2664 | |
| DNaseI | Sigma | DN25 | |
| ethanol, absolute | Decon Laboratories | 2716 | |
| Ethylenediamine Tetraacetic Acid (EDTA), 0.5M Solution, pH8.0 | Fisher | BP2482-500 | |
| gel imaging system | |||
| gel stain | Such as GelRed or Ethidium Bromide | ||
| grinding pestle, wide tip for 2 ml conical tubes | |||
| Guanidine-HCl, 8M solution | ThermoFisher | 24115 | |
| LightCycler 480 SYBR Green I Master | Roche | 4707516001 | |
| liquid nitrogen | |||
| Lysing enzymes from Trichoderma harzianum | Sigma | L1412 | |
| Magnesium Chloride | G Bioscience | 24115 | |
| magnetic rack | ThermoFisher | A13346 | |
| microcentrifuge tubes, LoBind 1.5 ml | Eppendorf | 22431021 | |
| microcentrifuge tubes, standard nuclease-free 1.5 ml | Eppendorf | ||
| microcentrifuge, refrigerated | Sorvall | Legend X1R | Or equivalent product, must be capable of reaching at least 18,000 x g with rotors for 50 ml tubes, Oak Ridge tubes, and 1.5 ml tubes |
| microcentrifuge, room temperature | Eppendorf | 5424 | Or equivalent product, must be capable of reaching at least 18,000 x g with rotor for 1.5 ml and 2 ml microcentrifuge tubes |
| Microcon DNA Fast Flow Centrifugal Filter Units | EMD Millipore | MRCFOR100 | |
| Miracloth, 1 square per sample cut to fit funnel | EMD Millipore | 475855 | |
| NEBNext Microbiome DNA Enrichment Kit | New England Biolabs | E2612L | |
| parafilm | Parafilm M | PM992 | |
| plastic pots and trays | |||
| polyvinylpyrrolidone (PVP) | Fisher | BP431-100 | |
| Proteinase K | Qiagen | 19131 | |
| Pulsed-Field Gel Electrophoresis rig (e.g. CHEF DR III) | Bio-Rad | 1703697 | |
| purification beads, Agencourt AMpureXP beads | Beckman Coulter | A63881 | |
| QIAamp DNA Mini Kit | Qiagen | 51304 | |
| Qiagen 20/g Genomic Tip DNA Extraction Kit | Qiagen | 10223 | |
| Qiagen Buffer EB (elution buffer) | Qiagen | 19086 | |
| Qiagen DNA Extraction Buffer Set | Qiagen | 19060 | |
| QiaRack | Qiagen | 19015 | |
| qPCR machine (e.g. Roche Light Cycler 480) | Roche | ||
| qPCR plate sealing film | Roche | 4729757001 | |
| qPCR plate, 96 well plate | Roche | 4729692001 | |
| Qubit assay tubes | Life Technologies | Q32856 | |
| Qubit Broad Spectrum assay kit | Life Technologies | Q32850 | |
| Qubit High Sensitivity assay kit | Life Technologies | Q32851 | |
| RNaseA | Qiagen | 19101 | |
| Serological pipettes (20 ml) and pipet-aid | Fisher | 13-678-11 | |
| Small funnels, 1 per sample | |||
| Sodium Chloride | Ambion | AM9759 | |
| Soft paintbrush, 2 per sample | |||
| SPEX SamplePrep 2010 Geno/Grinder or another type of tissue homogenizer | SPEX SamplePrep | Or another comparable tissue homogenizer. If you do not have access to a tissue homogenizer, then grinding in a pre-chilled mortar and pestle will suffice (see protocol for details). However, a homogenizer will give more consistent results and total homogenization time is reduced. | |
| Sucrose | Omnipure | 8550 | |
| TBE | |||
| thermomixer | |||
| Tris | Sigma | T2819-100ml | |
| Triton X-100 | Promega | H5142 | |
| tube rotater | |||
| tubes, 50 mL conical polypropylene | Corning | 352070 | |
| tubes, 50 ml high-speed polypropylene | ThermoScientific/Nalgene | 3119-0050 | e.g. Nalgene Oakridge tubes or equivalent |
| vermiculite | |||
| water bath | |||
| water, sterile and certified Nuclease-free | Fisher | 1481 | |
| water, sterile milliQ |
References
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