Optimalisatie en Vergelijkende Analyse van Plant Organellaire DNA Verrijkingsmethoden Geschikt voor Volgend Sequencing
Summary
De vergelijking en optimalisatie van twee organellaire DNA-verrijkingsmethoden worden voorgesteld: traditionele differentiële centrifugatie en fractionering van het totale gDNA op basis van methyleringsstatus. We beoordelen de resulterende DNA-hoeveelheid en kwaliteit, tonen de prestaties aan bij korte-leesvolgorde-sequencing, en bespreken het potentieel voor gebruik bij langlezen single-molecule sequencing.
Abstract
Plant organellaire genen bevatten grote, herhalende elementen die paren of recombinatie kunnen ondergaan om complexe structuren en / of sub-genomische fragmenten te vormen. Organellaire genen bestaan ook in mengsels binnen een gegeven cel of weefsel type (heteroplasmie), en een overvloed aan subtypen kunnen tijdens de ontwikkeling veranderen of wanneer onder stress (substochiometrische verschuiving). Next-generation sequencing (NGS) technologieën zijn nodig om diepgaand begrip van organellaire genoomstructuur en -functie te verkrijgen. Traditionele sequencing studies gebruiken verschillende methoden om organellair DNA te verkrijgen: (1) Als een grote hoeveelheid startweefsel wordt gebruikt, wordt het gehomogeniseerd en onderworpen aan differentiële centrifugatie en / of gradiëntzuivering. (2) Als een kleiner hoeveelheid weefsel wordt gebruikt ( dwz als zaden, materiaal of ruimte beperkt zijn), wordt hetzelfde proces uitgevoerd als in (1), gevolgd door gehele genoom amplificatie om voldoende DNA te verkrijgen. (3) Bioinformatica analyse kan gebruikt worden om te zoekenHet totale genomische DNA en het analyseren van organellair leest. Al deze methoden hebben inherente uitdagingen en afwijkingen. In (1) kan het moeilijk zijn om zo'n grote hoeveelheid startweefsel te verkrijgen; In (2), zou de volledige genoom amplificatie een sequencing bias kunnen introduceren; En in (3) kan homologie tussen nucleaire en organellaire genen interfereren met assemblage en analyse. Bij planten met grote nucleaire genen is het voordelig om te verrijken voor organellair DNA om sequentiekosten en sequentiekomplexiteit voor bioinformatica analyses te verminderen. Hiermee vergelijken we een traditionele differentiële centrifugatiemethode met een vierde methode, een aangepaste CpG-methyl pulldown-benadering, om het totale genomische DNA in kern- en organellaire fracties te scheiden. Beide methoden leveren voldoende DNA voor NGS, DNA dat sterk verrijkt is voor organellaire sequenties, alhoewel bij verschillende verhoudingen in mitochondriën en chloroplasten. We presenteren de optimalisatie van deze methoden voor tarwebladweefsel en bespreken belangrijke voordelen en dNadelen van elke aanpak in het kader van sample input, protocol gemak en downstream applicatie.
Introduction
Genoom sequencing is een krachtig instrument om de onderliggende genetische basis van belangrijke planteigenschappen te ontleden. De meeste genoom-sequencing studies richten zich op het nucleaire genoomgehalte, aangezien de meerderheid van de genen zich in de kern bevinden. Organellaire genen, waaronder de mitochondriën (over eukaryoten) en plastiden (in planten, de gespecialiseerde vorm, de chloroplast, werken in fotosynthese) dragen echter belangrijke genetische informatie die essentieel is voor organisme-ontwikkeling, stressrespons en algemene fitness 1 . Organellaire genen zijn typisch opgenomen in totale DNA-extracties die bestemd zijn voor nucleaire genoom sequencing, hoewel methoden om organelle getallen te verminderen voorafgaand aan DNA-extractie ook 2 gebruikt worden . Veel studies hebben sequentieresultaten gebruikt van totale gDNA-extracties om organellaire genen te combineren 3 , 4 , 5 ,Xref "> 6 , 7. Maar wanneer het doel van de studie zich richt op organellaire genen, verhoogt het gebruik van het totale gDNA de sequencing kosten, omdat veel lezingen" verloren "zijn aan de nucleaire DNA sequenties, met name in planten met grote nucleaire genen Bovendien, door de duplicatie en overdracht van organellaire sequenties in het nucleaire genoom en tussen organellen, is het oplossen van de juiste mapping positie van sequentiebepaling leest op het juiste genoom bioinformatisch uitdagend 2 , 8. De zuivering van organellaire genen uit het nucleaire genoom is bovendien een Strategie om deze problemen te verminderen. Verdere bioinformatica strategieën kunnen worden gebruikt om te scheiden, die kaart leest naar gebieden van homologie tussen de mitochondria en chloroplasten.
Terwijl de organellaire genen van veel plantensoorten zijn gesorteerd, is weinig bekend over de breedte van organellaire genoom diversiteitVerkrijgbaar in wilde populaties of in gekweekte broedplaatsen. Organellaire genen zijn ook bekend als dynamische moleculen die significante structurele herrangschikking ondergaan als gevolg van recombinatie tussen herhaalsequenties 9 . Bovendien bevinden zich meerdere kopieën van het organellaire genoom binnen elke organel, en meerdere organellen bevinden zich in elke cel. Niet alle kopieën van deze genen zijn identiek, die bekend staat als heteroplasmie. In tegenstelling tot het kanonieke beeld van 'mastercircles', is er nu bewijs voor een complexere beeld van organellaire genoomstructuren, waaronder sub-genomische cirkels, lineaire chromosomen, lineaire concatamers en vertakte structuren 10 . De montage van plantorganellaire genen wordt verder gecompliceerd door hun relatief grote maten en substantiële omgekeerde en directe herhalingen.
Traditionele protocollen voor organellaire isolatie, DNA-zuivering en daaropvolgende genen E-sequencing zijn vaak omslachtig en vereisen grote hoeveelheden weefselinvoer, met een aantal gram tot en met honderden grams jong bladweefsel dat nodig is als uitgangspunt 11 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17 . Dit maakt het sequentieren van het organellair genoom ontoegankelijk wanneer het weefsel beperkt is. In sommige situaties zijn zaadhoeveelheden beperkt, zoals wanneer het nodig is om op generatie of mannelijke steriele lijnen te sequentie die via kruising moet worden gehandhaafd. In deze situaties kan organellair DNA worden gezuiverd en vervolgens onderworpen aan gehele genoom amplificatie. Hele genoom amplificatie kan echter significante sequencing bias introduceren, wat een bijzonder probleem is bij het beoordelen van structurele variatie, sub-genomische structuren en heteroplasmiveaus> 18. Recente vooruitgang in de voorbereiding van de bibliotheek voor korte-lezen sequencing technologieën hebben de laag-input barrières overwonnen om de volledige genoom amplificatie te vermijden. Bijvoorbeeld, de Illumina Nextera XT bibliotheekbereidingskit maakt het mogelijk om zo weinig als 1 ng DNA te gebruiken als ingang 19 . Echter, standaard bibliotheekpreparaten voor langlose sequencing toepassingen, zoals PacBio of Oxford Nanopore sequencing technologieën, vereisen nog steeds een relatief hoge hoeveelheid input DNA, die een uitdaging kan vormen voor organellair genoom sequencing. Recentelijk zijn nieuwe gebruikersgemaakte, langlezen sequentieprotocollen ontwikkeld om de invoerhoeveelheden te verminderen en om genoomsequencing in monsters te helpen vergemakkelijken, waarbij het verkrijgen van microgram-hoeveelheden DNA moeilijk is 20 , 21 . Het verkrijgen van hoogmoleculair gewicht, pure organellaire fracties om in deze bibliotheekpreparaten te voeden blijft echter een uitdaging.
We zochten tO vergelijken en optimaliseren van organellaire DNA-verrijking en isolatiemethoden die geschikt zijn voor NGS zonder de noodzaak van gehele genoom amplificatie. Specifiek, ons doel was om de beste praktijken te bepalen om te verrijken voor organellair DNA met een hoge molecuulgewicht uit beperkte uitgangsmaterialen, zoals een subsample van een blad. Dit werk presenteert een vergelijkende analyse van methoden om te verrijken voor organellair DNA: (1) een gemodificeerd, traditioneel differentiaalcentrifugatie protocol versus (2) een DNA fractioneringsprotocol gebaseerd op het gebruik van een commercieel verkrijgbare DNA-CpG-methyl-bindende domeinproteïne-uitrolmethode 22 toegepast op plantweefsel 23 . Wij adviseren beste praktijken voor het isoleren van organellair DNA uit tarwebladweefsel, dat gemakkelijk kan worden uitgebreid tot andere planten en weefselsoorten.
Protocol
Representative Results
Discussion
Tot op heden hebben de meeste organellaire sequencing studies een centrum voor traditionele DC-methoden om te verrijken voor specifiek DNA. Methoden om organellen van diverse planten te isoleren zijn beschreven, waaronder mos 40 ; Monocots zoals tarwe 15 en haver 11 ; En dicots zoals arabidopsis 11 , zonnebloem 17 en raapzaad 14 . De meeste protocollen richten zich op bladweefse…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We zouden graag financiering willen ontvangen van het ministerie van Landbouw en Landbouwonderzoek van de Verenigde Staten en van de National Science Foundation (IOS 1025881 en IOS 1361554). Wij danken R. Caspers voor het onderhoud van kassen en plantenzorg. We danken ook het University of Minnesota Genomics Center, waar de Illumina bibliotheek voorbereidingen en sequencing werden uitgevoerd. We zijn ook dankbaar voor de opmerkingen van de tijdschriftenredacteurs en vier anonieme reviewers die ons manuscript verder versterken. We danken OECD ook voor een schenking aan SK om deze protocollen te integreren voor samenwerkingsprojecten met collega's in Japan.
Materials
| 2-mercaptoethanol (beta-mercaptoethanol; BME) | Sigma Aldrich | M3148-100ml | |
| 2-propanol (Isopropyl alcohol/isopropanol), bioreagent | Sigma Aldrich | I9516 | |
| agarose, Bio-Rad Cetified Megabase agarose | Bio-Rad | 1613108 | |
| analytical balance | Mettler Toledo | AB54-S | |
| balance | Mettler Toledo | PB1502-S | |
| bovine serum albumin (BSA) | Sigma Aldrich | B4287-25G | |
| Ceramic grinding cylinders, 3/8in x 7/8in | SPEX SamplePrep | 2183 | |
| Cryogenic Blocks compatible with tissue homogenizer for holding 50 ml tubes | SPEX SamplePrep | 2664 | |
| DNaseI | Sigma | DN25 | |
| ethanol, absolute | Decon Laboratories | 2716 | |
| Ethylenediamine Tetraacetic Acid (EDTA), 0.5M Solution, pH8.0 | Fisher | BP2482-500 | |
| gel imaging system | |||
| gel stain | Such as GelRed or Ethidium Bromide | ||
| grinding pestle, wide tip for 2 ml conical tubes | |||
| Guanidine-HCl, 8M solution | ThermoFisher | 24115 | |
| LightCycler 480 SYBR Green I Master | Roche | 4707516001 | |
| liquid nitrogen | |||
| Lysing enzymes from Trichoderma harzianum | Sigma | L1412 | |
| Magnesium Chloride | G Bioscience | 24115 | |
| magnetic rack | ThermoFisher | A13346 | |
| microcentrifuge tubes, LoBind 1.5 ml | Eppendorf | 22431021 | |
| microcentrifuge tubes, standard nuclease-free 1.5 ml | Eppendorf | ||
| microcentrifuge, refrigerated | Sorvall | Legend X1R | Or equivalent product, must be capable of reaching at least 18,000 x g with rotors for 50 ml tubes, Oak Ridge tubes, and 1.5 ml tubes |
| microcentrifuge, room temperature | Eppendorf | 5424 | Or equivalent product, must be capable of reaching at least 18,000 x g with rotor for 1.5 ml and 2 ml microcentrifuge tubes |
| Microcon DNA Fast Flow Centrifugal Filter Units | EMD Millipore | MRCFOR100 | |
| Miracloth, 1 square per sample cut to fit funnel | EMD Millipore | 475855 | |
| NEBNext Microbiome DNA Enrichment Kit | New England Biolabs | E2612L | |
| parafilm | Parafilm M | PM992 | |
| plastic pots and trays | |||
| polyvinylpyrrolidone (PVP) | Fisher | BP431-100 | |
| Proteinase K | Qiagen | 19131 | |
| Pulsed-Field Gel Electrophoresis rig (e.g. CHEF DR III) | Bio-Rad | 1703697 | |
| purification beads, Agencourt AMpureXP beads | Beckman Coulter | A63881 | |
| QIAamp DNA Mini Kit | Qiagen | 51304 | |
| Qiagen 20/g Genomic Tip DNA Extraction Kit | Qiagen | 10223 | |
| Qiagen Buffer EB (elution buffer) | Qiagen | 19086 | |
| Qiagen DNA Extraction Buffer Set | Qiagen | 19060 | |
| QiaRack | Qiagen | 19015 | |
| qPCR machine (e.g. Roche Light Cycler 480) | Roche | ||
| qPCR plate sealing film | Roche | 4729757001 | |
| qPCR plate, 96 well plate | Roche | 4729692001 | |
| Qubit assay tubes | Life Technologies | Q32856 | |
| Qubit Broad Spectrum assay kit | Life Technologies | Q32850 | |
| Qubit High Sensitivity assay kit | Life Technologies | Q32851 | |
| RNaseA | Qiagen | 19101 | |
| Serological pipettes (20 ml) and pipet-aid | Fisher | 13-678-11 | |
| Small funnels, 1 per sample | |||
| Sodium Chloride | Ambion | AM9759 | |
| Soft paintbrush, 2 per sample | |||
| SPEX SamplePrep 2010 Geno/Grinder or another type of tissue homogenizer | SPEX SamplePrep | Or another comparable tissue homogenizer. If you do not have access to a tissue homogenizer, then grinding in a pre-chilled mortar and pestle will suffice (see protocol for details). However, a homogenizer will give more consistent results and total homogenization time is reduced. | |
| Sucrose | Omnipure | 8550 | |
| TBE | |||
| thermomixer | |||
| Tris | Sigma | T2819-100ml | |
| Triton X-100 | Promega | H5142 | |
| tube rotater | |||
| tubes, 50 mL conical polypropylene | Corning | 352070 | |
| tubes, 50 ml high-speed polypropylene | ThermoScientific/Nalgene | 3119-0050 | e.g. Nalgene Oakridge tubes or equivalent |
| vermiculite | |||
| water bath | |||
| water, sterile and certified Nuclease-free | Fisher | 1481 | |
| water, sterile milliQ |
References
- Liberatore, K. L., Dukowic-Schulze, S., Miller, M. E., Chen, C., Kianian, S. F. The role of mitochondria in plant development and stress tolerance. Free Radic Biol Med. 100, 238-256 (2016).
- Samaniego Castruita, J. A., Zepeda Mendoza, M. L., Barnett, R., Wales, N., Gilbert, M. T. Odintifier–A computational method for identifying insertions of organellar origin from modern and ancient high-throughput sequencing data based on haplotype phasing. BMC Bioinformatics. 16 (232), 1-13 (2015).
- Zhang, T., Zhang, X., Hu, S., Yu, J. An efficient procedure for plant organellar genome assembly, based on whole genome data from the 454 GS FLX sequencing platform. Plant Methods. 7 (38), 1-8 (2011).
- Wambugu, P. W., Brozynska, M., Furtado, A., Waters, D. L., Henry, R. J. Relationships of wild and domesticated rices (Oryza AA genome species) based upon whole chloroplast genome sequences. Sci Rep. 5 (13957), 1-9 (2015).
- Iorizzo, M., et al. De novo assembly of the carrot mitochondrial genome using next generation sequencing of whole genomic DNA provides first evidence of DNA transfer into an angiosperm plastid genome. BMC Plant Biol. 12 (61), 1-17 (2012).
- Park, S., et al. Complete sequences of organelle genomes from the medicinal plant Rhazya stricta (Apocynaceae) and contrasting patterns of mitochondrial genome evolution across asterids. BMC Genomics. 15 (405), 1-18 (2014).
- Skippington, E., Barkman, T. J., Rice, D. W., Palmer, J. D. Miniaturized mitogenome of the parasitic plant Viscum scurruloideum is extremely divergent and dynamic and has lost all nad genes. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (27), E3515-E3524 (2015).
- Wicke, S., Schneeweiss, G. M., Hörandl, E., Appelhans, M. Chapter 1. Next Generation Sequencing in Plant Systematics. , (2015).
- Sloan, D. B. One ring to rule them all? Genome sequencing provides new insights into the ‘master circle’ model of plant mitochondrial DNA structure. New Phytol. 200 (4), 978-985 (2013).
- Woloszynska, M. Heteroplasmy and stoichiometric complexity of plant mitochondrial genomes–though this be madness, yet there’s method in’t. J Exp Bot. 61 (3), 657-671 (2010).
- Ahmed, Z., Fu, Y. B. An improved method with a wider applicability to isolate plant mitochondria for mtDNA extraction. Plant Methods. 11 (56), 1-11 (2015).
- Ejaz, M., et al. Comparison of small scale methods for the rapid and efficient extraction of mitochondrial DNA from wheat crop suitable for down-stream processes. Genet Mol Res. 13 (4), 10320-10331 (2014).
- Eubel, H., Heazlewood, J. L., Millar, A. H. Isolation and subfractionation of plant mitochondria for proteomic analysis. Methods Mol Biol. 355, 49-62 (2007).
- Hao, W., Fan, S., Hua, W., Wang, H. Effective extraction and assembly methods for simultaneously obtaining plastid and mitochondrial genomes. PLoS One. 9 (9), e108291 (2014).
- Pomeroy, M. K. Studies on the respiratory properties of mitochondria isolated from developing winter wheat seedlings. Plant Physiol. 53 (4), 653-657 (1974).
- Taylor, N. L., Stroher, E., Millar, A. H. Arabidopsis organelle isolation and characterization. Methods Mol Biol. 1062, 551-572 (2014).
- Triboush, S. O., Danilenko, N. G., Davydenko, O. G. A method for isolation of chloroplast DNA and mitochondrial DNA from Sunflower. Plant Mol Biol Rep. 16 (2), 183-189 (1998).
- Pinard, R., et al. Assessment of whole genome amplification-induced bias through high-throughput, massively parallel whole genome sequencing. BMC Genomics. 7 (216), 1-21 (2006).
- Lamble, S., et al. Improved workflows for high throughput library preparation using the transposome-based Nextera system. BMC Biotechnol. 13 (104), 1-10 (2013).
- Raley, C., et al. Preparation of next-generation DNA sequencing libraries from ultra-low amounts of input DNA: Application to single-molecule, real-time (SMRT) sequencing on the Pacific Biosciences RS II. bioRxiv. , (2014).
- Tsai, Y. C., et al. Resolving the Complexity of Human Skin Metagenomes Using Single-Molecule Sequencing. MBio. 7 (1), e01948 (2016).
- Feehery, G. R., et al. A method for selectively enriching microbial DNA from contaminating vertebrate host DNA. PLoS One. 8 (10), e76096 (2013).
- Yigit, E., Hernandez, D. I., Trujillo, J. T., Dimalanta, E., Bailey, C. D. Genome and metagenome sequencing: Using the human methyl-binding domain to partition genomic DNA derived from plant tissues. Appl Plant Sci. 2 (11), 1-6 (2014).
- Noyszewski, A. K., et al. Accelerated evolution of the mitochondrial genome in an alloplasmic line of durum wheat. BMC Genomics. 15 (67), 1-16 (2014).
- . QIAamp DNA Mini and Blood Mini Handbook Available from: https://www.qiagen.com/ch/resources/ (2016)
- . User developed protocol: Isolation of genomic DNA from plants and filamentous fungi using the QIAGEN Genomic-tip – (EN) Available from: https://www.qiagen.com/ch/resources/ (2001)
- . QIAGEN Genomic DNA Handbook Available from: https://www.qiagen.com/ch/resources/ (2012)
- Bolger, A. M., Lohse, M., Usadel, B. Trimmomatic: a flexible trimmer for Illumina sequence data. Bioinformatics. 30 (15), 2114-2120 (2014).
- Ogihara, Y., et al. Structural dynamics of cereal mitochondrial genomes as revealed by complete nucleotide sequencing of the wheat mitochondrial genome. Nucleic Acids Res. 33 (19), 6235-6250 (2005).
- Ogihara, Y., et al. Structural features of a wheat plastome as revealed by complete sequencing of chloroplast DNA. Mol Genet Genomics. 266 (5), 740-746 (2002).
- International Wheat Genome Sequencing Consortium (IWGSC). A chromosome-based draft sequence of the hexaploid bread wheat (Triticum aestivum) genome. Science. 345 (6194), (2014).
- Langmead, B., Salzberg, S. L. Fast gapped-read alignment with Bowtie 2. Nat Methods. 9 (4), 357-359 (2012).
- Bendich, A. J. Why do chloroplasts and mitochondria contain so many copies of their genome?. Bioessays. 6 (6), 279-282 (1987).
- Kumar, R. A., Oldenburg, D. J., Bendich, A. J. Changes in DNA damage, molecular integrity, and copy number for plastid DNA and mitochondrial DNA during maize development. J Exp Bot. 65 (22), 6425-6439 (2014).
- Ma, J., Li, X. Q. Organellar genome copy number variation and integrity during moderate maturation of roots and leaves of maize seedlings. Curr Genet. 61 (4), 591-600 (2015).
- Lang, E. G., et al. Simultaneous isolation of pure and intact chloroplasts and mitochondria from moss as the basis for sub-cellular proteomics. Plant Cell Rep. 30 (2), 205-215 (2011).
- Tobin, A. K. Subcellular fractionation of plant tissues. Isolation of chloroplasts and mitochondria from leaves. Methods Mol Biol. 59, 57-68 (1996).
