Ottimizzazione e analisi comparativa dei metodi di arricchimento del DNA organologico vegetale adatti per la sequenziazione di nuova generazione

Summary

Viene presentato il confronto e l'ottimizzazione di due metodi di arricchimento organellare del DNA vegetale: centrifugazione differenziale tradizionale e frazionamento del gDNA totale sulla base dello stato di metilazione. Valutiamo la quantità e la qualità del DNA risultanti, dimostriamo le prestazioni in sequenza di prossima generazione e discutiamo il potenziale di utilizzo in sequenza a lunga lettura di singole molecole.

Abstract

I genomi organellari delle piante contengono grandi elementi ripetitivi che possono subire un accoppiamento o una ricombinazione per formare strutture complesse e / o frammenti subgenomici. Anche i genomi organistici esistono in aggiunte all'interno di una determinata cellula o tipo di tessuto (eteroplasma) e un'abbondanza di sottotipi può cambiare durante lo sviluppo o quando è sotto lo stress (spostamento sotto-stechiometrico). Sono necessarie tecnologie di sequenziamento di nuova generazione (NGS) per ottenere una comprensione più approfondita della struttura e della funzione del genoma organellare. Gli studi di sequenziamento tradizionali utilizzano diversi metodi per ottenere DNA organellare: (1) Se viene utilizzata una grande quantità di tessuto di partenza, viene omogeneizzata e sottoposta a centrifugazione differenziale e / o depurazione gradiente. (2) Se si utilizza una quantità minore di tessuti ( cioè, se i semi, il materiale o lo spazio sono limitati), lo stesso processo viene eseguito come in (1), seguito da un'amplificazione del genoma completa per ottenere un DNA sufficiente. (3) L'analisi di bioinformatica può essere usata per seqIl DNA totale genomico e per analizzare le letture organellari. Tutti questi metodi hanno sfide intrinseche e compromessi. In (1), può essere difficile ottenere una così grande quantità di tessuto di partenza; In (2), l'amplificazione del genoma intero potrebbe introdurre una bias di sequenziamento; E in (3), l'omologia tra genomi nucleari e organellari potrebbe interferire con l'assemblaggio e l'analisi. Nelle piante con grandi genomi nucleari è vantaggioso arricchire il DNA organellare per ridurre i costi di sequenza e la complessità delle sequenze per le analisi di bioinformatica. Qui confrontiamo un tradizionale metodo di centrifugazione differenziale con un quarto metodo, un approccio adattato CpG-metile, per separare il DNA genomico totale in frazioni nucleari e organellari. Entrambi i metodi forniscono un sufficiente DNA per NGS, DNA che è altamente arricchito per sequenze organellari, anche se a diversi rapporti nei mitocondri e nei cloroplasti. Presentiamo l'ottimizzazione di questi metodi per i fogli di frumento e discutere di importanti vantaggi e dI vantaggi di ogni approccio nel contesto dell'input di campionamento, della facilità di protocollo e dell'applicazione a valle.

Introduction

Il sequenziamento del genoma è un potente strumento per disseccare la base genetica sottostante di importanti tratti vegetali. La maggior parte degli studi di sequenziamento genomico si concentra sul contenuto del genoma nucleare, in quanto la maggioranza dei geni si trova nel nucleo. Tuttavia, i genomi organellari, inclusi i mitocondri (attraverso eucarioti) e plastidi (in piante, la forma specializzata, il cloroplasto, funzionano in fotosintesi) contribuiscono a fornire notevoli informazioni genetiche fondamentali per lo sviluppo organico, la risposta allo stress e la forma ^fisica1 . I genomi organellari sono tipicamente inclusi nelle estrazioni totali del DNA destinate al sequenziamento del genoma nucleare, anche se vengono impiegati anche metodi per ridurre i numeri degli organeli prima dell'estrazione del DNA ² . Molti studi hanno utilizzato risultati di sequenziamento delle estrazioni totali di gDNA per assemblare genomi organistici ^{3 , 4 , 5 ,}xref "> ^{6, 7.} Tuttavia, quando l'obiettivo dello studio è di concentrarsi su genomi organellari, utilizzando il totale gDNA aumenta i costi di sequenziamento perché molti letture sono 'perso' per le sequenze di DNA nucleare, in particolare in impianti di grandi genomi nucleari Inoltre, a causa della duplicazione e del trasferimento di sequenze organellari nel genoma nucleare e tra gli organelli, risolvendo la corretta posizione di mappatura del sequenziamento legale al genoma corretto è bioinformatica impegnativa ^{2 , 8.} La purificazione dei genomi organellari dal genoma nucleare è una Strategia per ridurre questi problemi.Per ulteriori strategie di bioinformatics possono essere utilizzati per separare le letture che mappano alle regioni di omologia tra i mitocondri ei cloroplasti.

Mentre i genomi organellari da molte specie vegetali sono stati sequenziati, poco si sa sulla larghezza della diversità genomica organellareDisponibile in popolazioni selvatiche o in piscine coltivate. I genomi organellari sono noti anche per essere molecole dinamiche che subiscono un significativo riarrangiamento strutturale a causa della ricombinazione tra sequenze di ripetizione ⁹ . Inoltre, molte copie del genoma organellare sono contenute all'interno di ciascuna organella e sono presenti più organelli all'interno di ciascuna cellula. Non tutte le copie di questi genomi sono identiche, che è conosciuto come eteroplasma. Contrariamente all'immagine canonica di "cerchi master", ora si registra una crescente evidenza per un quadro più complesso di strutture del genoma organellare, compresi cerchi subgenomiali, cromosomi lineari, concatamers lineari e strutture ramificate ¹⁰ . L'assemblaggio di genomi organellari vegetali è ulteriormente complicato dalle loro dimensioni relativamente grandi e dalle sostanziali ripetizioni invertite e dirette.

Protocolli tradizionali per l'isolamento organellare, la purificazione del DNA e il genoma successivo I sequenziamenti sono spesso ingombranti e richiedono grandi volumi di input tissutale, con diversi grammi in aumento di centinaia di grammi di tessuti fogliari giovani necessari come punto di partenza ^{11 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17} . Questo rende il sequenziamento del genoma organellare inaccessibile quando il tessuto è limitato. In alcune situazioni, gli importi dei semi sono limitati, ad esempio quando è necessario sequenziare su base generazionale o in linee sterili maschili che devono essere mantenute attraverso l'attraversamento. In queste situazioni, il DNA organellare può essere purificato e quindi sottoposto ad amplificazione del genoma intero. Tuttavia, l'amplificazione del genoma intero può introdurre significative bias di sequenziamento, che costituisce un problema particolare nella valutazione della variazione strutturale, delle strutture subgenomiche e dei livelli di eteroplasmi> 18. I recenti progressi nella preparazione della biblioteca per le tecnologie di sequenza brevettate hanno superato le barriere a basso input per evitare l'amplificazione del genoma intero. Ad esempio, il kit di preparazione alla libreria Illumina Nextera XT consente di utilizzare fino a 1 ng di DNA come input ¹⁹ . Tuttavia, le preparazioni standard di libreria per applicazioni di sequenziamento a lungo lette, come le tecnologie di sequenziamento PacBio o Oxford Nanopore, richiedono ancora una quantità relativamente elevata di DNA di input, che può rappresentare una sfida per il sequenziamento del genoma organellare. Recentemente, sono stati sviluppati nuovi protocolli di sequencing realizzati a livello manuale per ridurre gli importi e contribuire a facilitare il sequenziamento dei genomi nei campioni in cui è difficile ottenere quantità di DNA di microgrammi ^{20 , 21} . Tuttavia, ottenendo frazioni organolari puri ad alto peso molecolare per alimentare questi preparati alla libreria rimane una sfida.

Abbiamo cercato tO confrontare e ottimizzare i metodi di arricchimento e isolamento del DNA organellare adatti a NGS senza la necessità di amplificazione del genoma intero. In particolare, il nostro obiettivo era quello di determinare le migliori pratiche per arricchire il DNA organellare a peso molecolare dai materiali di partenza limitati, ad esempio un sottoinsieme di foglia. Questo lavoro presenta un'analisi comparativa dei metodi da arricchire per il DNA organellare: (1) un protocollo di centrifugazione differenziale tradizionale modificato rispetto a (2) un protocollo di frazionamento del DNA basato sull'uso di un approccio pulldown di proteine ​​del dominio di DNA di CpG ²² applicato al tessuto vegetale ²³ . Raccomandiamo le migliori pratiche per l'isolamento del DNA organellare da tessuti di foglie di grano, che possono essere facilmente estesi ad altre piante e tipi di tessuti.

Protocol

1. Generazione di materiali vegetali per l'isolamento organico e l'estrazione del DNA Crescita standard dei semenzali di frumento Sementi vegetali in vermiculite in piccoli vasi quadrati con 4 – 6 semi per angolo. Trasferire in serra o in camera di crescita con un ciclo leggero da 16 h, 23 ºC giorno / 18 ºC notte. Acqua le piante ogni giorno. Fertilizzare le piante con ¼ di cucchiaino di fertilizzante granulare 20-20-20 NPK alla germinazione ea 7 giorni dopo la g…

Representative Results

I protocolli presentati in questo manoscritto descrivono due metodi distinti per arricchire il DNA organellare dai tessuti vegetali. Le condizioni qui presentate riflettono l'ottimizzazione del tessuto di grano. Un confronto tra i passaggi chiave nei protocolli, l'input richiesto e l'output del DNA sono descritti in Figura 1 . Le fasi del protocollo DC che abbiamo testato seguono condizioni simili a quelle descritte in precedenza ( <strong class=…

Discussion

Ad oggi, la maggior parte degli studi organizzativi di sequenziamento si concentra sui metodi DC tradizionali per arricchire il DNA specifico. Sono stati descritti metodi per isolare gli organelli da diverse piante, tra cui il muschio ⁴⁰ ; Monocots come il grano ¹⁵ e l'avena ¹¹ ; E dicoti come arabidopsis ¹¹ , girasole ¹⁷ e colza ¹⁴ . La maggior parte dei protocolli si conce…

Materials

2-mercaptoethanol (beta-mercaptoethanol; BME)	Sigma Aldrich	M3148-100ml
2-propanol (Isopropyl alcohol/isopropanol), bioreagent	Sigma Aldrich	I9516
agarose, Bio-Rad Cetified Megabase agarose	Bio-Rad	1613108
analytical balance	Mettler Toledo	AB54-S
balance	Mettler Toledo	PB1502-S
bovine serum albumin (BSA)	Sigma Aldrich	B4287-25G
Ceramic grinding cylinders, 3/8in x 7/8in	SPEX SamplePrep	2183
Cryogenic Blocks compatible with tissue homogenizer for holding 50 ml tubes	SPEX SamplePrep	2664
DNaseI	Sigma	DN25
ethanol, absolute	Decon Laboratories	2716
Ethylenediamine Tetraacetic Acid (EDTA), 0.5M Solution, pH8.0	Fisher	BP2482-500
gel imaging system
gel stain			Such as GelRed or Ethidium Bromide
grinding pestle, wide tip for 2 ml conical tubes
Guanidine-HCl, 8M solution	ThermoFisher	24115
LightCycler 480 SYBR Green I Master	Roche	4707516001
liquid nitrogen
Lysing enzymes from Trichoderma harzianum	Sigma	L1412
Magnesium Chloride	G Bioscience	24115
magnetic rack	ThermoFisher	A13346
microcentrifuge tubes, LoBind 1.5 ml	Eppendorf	22431021
microcentrifuge tubes, standard nuclease-free 1.5 ml	Eppendorf
microcentrifuge, refrigerated	Sorvall	Legend X1R	Or equivalent product, must be capable of reaching at least 18,000 x g with rotors for 50 ml tubes, Oak Ridge tubes, and 1.5 ml tubes
microcentrifuge, room temperature	Eppendorf	5424	Or equivalent product, must be capable of reaching at least 18,000 x g with rotor for 1.5 ml and 2 ml microcentrifuge tubes
Microcon DNA Fast Flow Centrifugal Filter Units	EMD Millipore	MRCFOR100
Miracloth, 1 square per sample cut to fit funnel	EMD Millipore	475855
NEBNext Microbiome DNA Enrichment Kit	New England Biolabs	E2612L
parafilm	Parafilm M	PM992
plastic pots and trays
polyvinylpyrrolidone (PVP)	Fisher	BP431-100
Proteinase K	Qiagen	19131
Pulsed-Field Gel Electrophoresis rig (e.g. CHEF DR III)	Bio-Rad	1703697
purification beads, Agencourt AMpureXP beads	Beckman Coulter	A63881
QIAamp DNA Mini Kit	Qiagen	51304
Qiagen 20/g Genomic Tip DNA Extraction Kit	Qiagen	10223
Qiagen Buffer EB (elution buffer)	Qiagen	19086
Qiagen DNA Extraction Buffer Set	Qiagen	19060
QiaRack	Qiagen	19015
qPCR machine (e.g. Roche Light Cycler 480)	Roche
qPCR plate sealing film	Roche	4729757001
qPCR plate, 96 well plate	Roche	4729692001
Qubit assay tubes	Life Technologies	Q32856
Qubit Broad Spectrum assay kit	Life Technologies	Q32850
Qubit High Sensitivity assay kit	Life Technologies	Q32851
RNaseA	Qiagen	19101
Serological pipettes (20 ml) and pipet-aid	Fisher	13-678-11
Small funnels, 1 per sample
Sodium Chloride	Ambion	AM9759
Soft paintbrush, 2 per sample
SPEX SamplePrep 2010 Geno/Grinder or another type of tissue homogenizer	SPEX SamplePrep		Or another comparable tissue homogenizer. If you do not have access to a tissue homogenizer, then grinding in a pre-chilled mortar and pestle will suffice (see protocol for details). However, a homogenizer will give more consistent results and total homogenization time is reduced.
Sucrose	Omnipure	8550
TBE
thermomixer
Tris	Sigma	T2819-100ml
Triton X-100	Promega	H5142
tube rotater
tubes, 50 mL conical polypropylene	Corning	352070
tubes, 50 ml high-speed polypropylene	ThermoScientific/Nalgene	3119-0050	e.g. Nalgene Oakridge tubes or equivalent
vermiculite
water bath
water, sterile and certified Nuclease-free	Fisher	1481
water, sterile milliQ