الأمثل والتحليل المقارن لطرق التخصيب الحمض النووي النباتي أورغانيلار مناسبة للجيل القادم التسلسل
Summary
يتم عرض المقارنة والاستفادة المثلى من اثنين من أساليب التخصيب دنا النبات العضوي: الطرد المركزي التفاضلي التقليدي وتجزئة من غنا الكلي على أساس حالة مثيلة. نقوم بتقييم كمية الحمض النووي الناتجة والجودة، وإظهار الأداء في قراءة قصيرة الجيل القادم التسلسل، ومناقشة إمكانات للاستخدام في قراءة طويلة تسلسل جزيء واحد.
Abstract
يحتوي الجينوم العضوي النباتي على عناصر كبيرة ومتكررة قد تخضع لعملية الاقتران أو إعادة التركيب لتشكيل هياكل معقدة و / أو شظايا دون الجينومية. توجد جينومات أورغانيلار أيضا في خلطات داخل خلية أو نوع معين من الأنسجة (هيتيروبلاسمي)، وقد تتغير وفرة الأنواع الفرعية في جميع مراحل التنمية أو عندما تكون تحت الضغط (التحول شبه المتكافئ). مطلوب الجيل التالي من تقنيات التسلسل (نغس) للحصول على فهم أعمق لهيكل الجينوم العضوي وظيفة. تستخدم دراسات التسلسل التقليدية عدة طرق للحصول على الحمض النووي العضوي: (1) إذا تم استخدام كمية كبيرة من الأنسجة بدءا، فمن المتجانسة وتعرض الطرد المركزي التفاضلي و / أو تنقية التدرج. (2) إذا تم استخدام كمية أقل من الأنسجة ( أي إذا كانت البذور أو المواد أو الفضاء محدودة)، يتم تنفيذ نفس العملية كما هو الحال في (1)، تليها تضخيم الجينوم كله للحصول على الحمض النووي كافية. (3) التحليل المعلوماتية الحيوية يمكن استخدامها ليقوموبالتالي الحمض النووي الجيني الكلي وتحليل قراءات أورغانيلار. كل هذه الأساليب لها تحديات ومواقف متأصلة. في (1)، قد يكون من الصعب الحصول على كمية كبيرة من الأنسجة بدءا. في (2)، يمكن أن تضخيم الجينوم كله إدخال التحيز التسلسل. وفي (3)، يمكن التماثل بين الجينوم النووية والعضلية التداخل مع التجمع والتحليل. في النباتات ذات الجينومات النووية الكبيرة، من المفيد إثراء الحمض النووي للعضلات للحد من تكاليف التسلسل وتعقيد تسلسل لتحليلات المعلوماتية الحيوية. هنا، قارنا طريقة الطرد المركزي التفاضلية التقليدية مع الطريقة الرابعة، نهج كبغ الميثيل المنسدلة تكييفها، لفصل الحمض النووي الجيني الكلي إلى الكسور النووية والعضلات. كلا الطرازين تعطي الحمض النووي كافية ل نغس، الحمض النووي التي هي المخصب للغاية لتسلسل أورغانيلار، وإن كان بنسب مختلفة في الميتوكوندريا والبلاستيك الكلور. نقدم الأمثل لهذه الأساليب لنسيج أوراق القمح ومناقشة المزايا الرئيسية و دوعيوب كل نهج في سياق مدخلات العينة، وسهولة البروتوكول، وتطبيق المصب.
Introduction
تسلسل الجينوم هو أداة قوية لتشريح الأساس الجيني الكامن وراء الصفات النباتية الهامة. تركز معظم الدراسات التسلسل الجينوم على محتوى الجينوم النووي، حيث أن غالبية الجينات تقع في النواة. ومع ذلك، فإن الجينوم العضوي، بما في ذلك الميتوكوندريا (عبر حقيقيات النوى) والبلاستيدات (في النباتات، والشكل المتخصص، والكلوروبلاست، ويعمل في عملية التمثيل الضوئي) يسهم معلومات وراثية هامة ضرورية لتنمية الكائنات الحية، والاستجابة للضغط، واللياقة البدنية العامة 1 . وعادة ما يتم تضمين جينومات أورغانيلار في الاستخراج الكلي للحمض النووي المقصود لتسلسل الجينوم النووي، على الرغم من أن أساليب للحد من عدد العضيات قبل استخراج الحمض النووي تستخدم أيضا 2 . وقد استخدمت العديد من الدراسات نتائج التسلسل من مجموع الاستخراج غنا لتجميع جينوم أورغانيلار 3 ، 4 ، 5 ،كريف "> 6 ، 7. ومع ذلك، عندما يكون الهدف من الدراسة هو التركيز على الجينوم العضلي، وذلك باستخدام مجموع غنا يزيد من تكاليف التسلسل لأن العديد من يقرأ" فقدت "تسلسل الحمض النووي النووي، وخاصة في النباتات ذات الجينوم النووية الكبيرة ، وعلاوة على ذلك، نظرا للازدواجية ونقل تسلسل الكيس العضلي في الجينوم النووي وبين العضيات، وحل موقف رسم الخرائط الصحيح من تسلسل يقرأ إلى الجينوم الصحيح هو بيوانفورماتيكالي تحدي 2 ، 8. تنقية جينوم عضوي من الجينوم النووي هو واحد استراتيجية للحد من هذه المشاكل.ويمكن استخدام مزيد من الاستراتيجيات المعلوماتية الحيوية لفصل يقرأ تلك الخريطة إلى مناطق التماثل بين الميتوكوندريا والكلوروبلاست.
في حين أن الجينوم العضوي من العديد من الأنواع النباتية قد تم تسلسلها، لا يعرف إلا القليل عن اتساع تنوع جينوم عضويالمتاحة في مجموعات البرية أو في تربية تربية المزارع. ومن المعروف أيضا جينومات أورغانيلار أن تكون الجزيئات الحيوية التي تخضع لإعادة ترتيب هيكلية كبيرة بسبب إعادة التركيب بين تسلسل تكرار 9 . وعلاوة على ذلك، يتم تضمين نسخ متعددة من الجينوم العضلي داخل كل عضلة، وترد عضيات متعددة داخل كل خلية. ليس كل نسخ هذه الجينوم متطابقة، والتي تعرف باسم هيتيروبلاسمي. على النقيض من الصورة الكنسي "الدوائر الرئيسية"، هناك الآن أدلة متزايدة على صورة أكثر تعقيدا من الهياكل الجينوم العضوي، بما في ذلك الدوائر شبه الجينومية، الكروموسومات الخطية، الخطية كونكاتامرس، والهياكل المتفرعة 10 . وتجدر الإشارة إلى أن تجميع الجينوم العضوي النباتي يزداد تعقيدا بسبب أحجامها الكبيرة نسبيا وتكرارها المقلوب والمباشر الكبير.
البروتوكولات التقليدية لعزل العضل، وتنقية الحمض النووي، والجنوم اللاحقة e التسلسل غالبا ما تكون مرهقة وتتطلب كميات كبيرة من إدخال الأنسجة، مع عدة غرامات إلى ما يزيد عن مئات غرام من الأنسجة ورقة الشباب اللازمة كنقطة انطلاق 11 ، 12 ، 13 ، 14 ، 15 ، 16 ، 17 . وهذا يجعل التسلسل الجينوم العضوي لا يمكن الوصول إليها عندما الأنسجة محدودة. في بعض الحالات، تكون كميات البذور محدودة، مثل عندما يكون ذلك ضروريا للتسلسل على أساس الأجيال أو في الخطوط العقيمة الذكرية التي يجب الحفاظ عليها عبر المعبر. في هذه الحالات، يمكن تنقيته الحمض النووي العضلي ثم تعرض لتضخيم الجينوم كله. ومع ذلك، يمكن أن تضخيم الجينوم كله إدخال التحيز تسلسل كبير، وهو مشكلة خاصة عند تقييم التباين الهيكلي، والهياكل شبه الجينومية، ومستويات هيتيروبلاسمي> 18. وقد ساهمت التطورات الحديثة في إعداد المكتبة للتكنولوجيات التسلسلية القصيرة القراءة في التغلب على الحواجز ذات المدخلات المنخفضة لتجنب تضخيم الجينوم بأكمله. على سبيل المثال، مجموعة إعداد مكتبة إلومينا نكستيرا شت تسمح بأقل من 1 نانوغرام من الحمض النووي لاستخدامها كمدخل 19 . ومع ذلك، فإن الاستعدادات القياسية للمكتبات لتطبيقات تسلسل قراءة طويلة، مثل تقنيات تسلسل باكبيو أو أكسفورد نانوبور، لا تزال تتطلب كمية عالية نسبيا من الحمض النووي المدخلات، والتي يمكن أن تشكل تحديا لتسلسل الجينوم العضوي. في الآونة الأخيرة، تم تطوير بروتوكولات تسلسل جديدة طويلة الصنع الصنع وقراءة طويلة للحد من كميات المدخلات والمساعدة في تسهيل تسلسل الجينوم في العينات حيث الحصول على كميات ميكروغرام من الحمض النووي صعب 20 ، 21 . ومع ذلك، لا يزال الحصول على الوزن الجزيئي عالية، الكسور العضوي النقي لتغذية هذه الاستعدادات مكتبة تحديا.
سعينا رo مقارنة وتحسين التخصيب الحمض النووي العضلي وطرق العزل مناسبة ل نغس دون الحاجة إلى تضخيم الجينوم كله. على وجه التحديد، كان هدفنا هو تحديد أفضل الممارسات لإثراء الحمض النووي العضلي عالي الوزن الجزيئي من مواد البدء المحدودة، مثل عينة فرعية من ورقة. يقدم هذا العمل تحليلا مقارنا لأساليب إثراء الحمض النووي العضوي: (1) تعديل، بروتوكول الطرد المركزي التفاضلي المعدل مقابل (2) بروتوكول تجزئة الحمض النووي على أساس استخدام دنا المتاحة تجاريا كبغ الميثيل ملزم نهج سحب البروتين المجال 22 تطبق على الأنسجة النباتية 23 . نوصي أفضل الممارسات لعزل الحمض النووي العضوي من الأنسجة ورقة القمح، والتي يمكن أن تمتد بسهولة إلى النباتات وأنواع الأنسجة الأخرى.
Protocol
Representative Results
Discussion
حتى الآن، تركز معظم الدراسات التسلسل العضوي على أساليب دس التقليدية لإثراء الحمض النووي المحدد. وقد وصفت طرق لعزل العضيات من النباتات المتنوعة، بما في ذلك الطحلب 40 ؛ مونوكوتس مثل القمح 15 والشوفان 11 ؛ و ديكوتس مثل أرابيدوبسيس <sup…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ونود أن نعترف بتمويل من وزارة الزراعة الأمريكية – دائرة البحوث الزراعية ومن المؤسسة الوطنية للعلوم (يوس 1025881 و يوس 1361554). نشكر R. كاسبرز لصيانة الدفيئة ورعاية النبات. كما نشكر جامعة مينيسوتا مركز الجينوميات، حيث تم إجراء التحضيرات مكتبة إلومينا والتسلسل. كما نعرب عن امتناننا للتعليقات التي أبداها محررو المجلة وأربعة مراجعين مجهولين من شأنها تعزيز مخطوطةنا. كما نشكر منظمة التعاون والتنمية في الميدان الاقتصادي على زمالة ل سك لدمج هذه البروتوكولات للمشاريع التعاونية مع الزملاء في اليابان.
Materials
| 2-mercaptoethanol (beta-mercaptoethanol; BME) | Sigma Aldrich | M3148-100ml | |
| 2-propanol (Isopropyl alcohol/isopropanol), bioreagent | Sigma Aldrich | I9516 | |
| agarose, Bio-Rad Cetified Megabase agarose | Bio-Rad | 1613108 | |
| analytical balance | Mettler Toledo | AB54-S | |
| balance | Mettler Toledo | PB1502-S | |
| bovine serum albumin (BSA) | Sigma Aldrich | B4287-25G | |
| Ceramic grinding cylinders, 3/8in x 7/8in | SPEX SamplePrep | 2183 | |
| Cryogenic Blocks compatible with tissue homogenizer for holding 50 ml tubes | SPEX SamplePrep | 2664 | |
| DNaseI | Sigma | DN25 | |
| ethanol, absolute | Decon Laboratories | 2716 | |
| Ethylenediamine Tetraacetic Acid (EDTA), 0.5M Solution, pH8.0 | Fisher | BP2482-500 | |
| gel imaging system | |||
| gel stain | Such as GelRed or Ethidium Bromide | ||
| grinding pestle, wide tip for 2 ml conical tubes | |||
| Guanidine-HCl, 8M solution | ThermoFisher | 24115 | |
| LightCycler 480 SYBR Green I Master | Roche | 4707516001 | |
| liquid nitrogen | |||
| Lysing enzymes from Trichoderma harzianum | Sigma | L1412 | |
| Magnesium Chloride | G Bioscience | 24115 | |
| magnetic rack | ThermoFisher | A13346 | |
| microcentrifuge tubes, LoBind 1.5 ml | Eppendorf | 22431021 | |
| microcentrifuge tubes, standard nuclease-free 1.5 ml | Eppendorf | ||
| microcentrifuge, refrigerated | Sorvall | Legend X1R | Or equivalent product, must be capable of reaching at least 18,000 x g with rotors for 50 ml tubes, Oak Ridge tubes, and 1.5 ml tubes |
| microcentrifuge, room temperature | Eppendorf | 5424 | Or equivalent product, must be capable of reaching at least 18,000 x g with rotor for 1.5 ml and 2 ml microcentrifuge tubes |
| Microcon DNA Fast Flow Centrifugal Filter Units | EMD Millipore | MRCFOR100 | |
| Miracloth, 1 square per sample cut to fit funnel | EMD Millipore | 475855 | |
| NEBNext Microbiome DNA Enrichment Kit | New England Biolabs | E2612L | |
| parafilm | Parafilm M | PM992 | |
| plastic pots and trays | |||
| polyvinylpyrrolidone (PVP) | Fisher | BP431-100 | |
| Proteinase K | Qiagen | 19131 | |
| Pulsed-Field Gel Electrophoresis rig (e.g. CHEF DR III) | Bio-Rad | 1703697 | |
| purification beads, Agencourt AMpureXP beads | Beckman Coulter | A63881 | |
| QIAamp DNA Mini Kit | Qiagen | 51304 | |
| Qiagen 20/g Genomic Tip DNA Extraction Kit | Qiagen | 10223 | |
| Qiagen Buffer EB (elution buffer) | Qiagen | 19086 | |
| Qiagen DNA Extraction Buffer Set | Qiagen | 19060 | |
| QiaRack | Qiagen | 19015 | |
| qPCR machine (e.g. Roche Light Cycler 480) | Roche | ||
| qPCR plate sealing film | Roche | 4729757001 | |
| qPCR plate, 96 well plate | Roche | 4729692001 | |
| Qubit assay tubes | Life Technologies | Q32856 | |
| Qubit Broad Spectrum assay kit | Life Technologies | Q32850 | |
| Qubit High Sensitivity assay kit | Life Technologies | Q32851 | |
| RNaseA | Qiagen | 19101 | |
| Serological pipettes (20 ml) and pipet-aid | Fisher | 13-678-11 | |
| Small funnels, 1 per sample | |||
| Sodium Chloride | Ambion | AM9759 | |
| Soft paintbrush, 2 per sample | |||
| SPEX SamplePrep 2010 Geno/Grinder or another type of tissue homogenizer | SPEX SamplePrep | Or another comparable tissue homogenizer. If you do not have access to a tissue homogenizer, then grinding in a pre-chilled mortar and pestle will suffice (see protocol for details). However, a homogenizer will give more consistent results and total homogenization time is reduced. | |
| Sucrose | Omnipure | 8550 | |
| TBE | |||
| thermomixer | |||
| Tris | Sigma | T2819-100ml | |
| Triton X-100 | Promega | H5142 | |
| tube rotater | |||
| tubes, 50 mL conical polypropylene | Corning | 352070 | |
| tubes, 50 ml high-speed polypropylene | ThermoScientific/Nalgene | 3119-0050 | e.g. Nalgene Oakridge tubes or equivalent |
| vermiculite | |||
| water bath | |||
| water, sterile and certified Nuclease-free | Fisher | 1481 | |
| water, sterile milliQ |
References
- Liberatore, K. L., Dukowic-Schulze, S., Miller, M. E., Chen, C., Kianian, S. F. The role of mitochondria in plant development and stress tolerance. Free Radic Biol Med. 100, 238-256 (2016).
- Samaniego Castruita, J. A., Zepeda Mendoza, M. L., Barnett, R., Wales, N., Gilbert, M. T. Odintifier–A computational method for identifying insertions of organellar origin from modern and ancient high-throughput sequencing data based on haplotype phasing. BMC Bioinformatics. 16 (232), 1-13 (2015).
- Zhang, T., Zhang, X., Hu, S., Yu, J. An efficient procedure for plant organellar genome assembly, based on whole genome data from the 454 GS FLX sequencing platform. Plant Methods. 7 (38), 1-8 (2011).
- Wambugu, P. W., Brozynska, M., Furtado, A., Waters, D. L., Henry, R. J. Relationships of wild and domesticated rices (Oryza AA genome species) based upon whole chloroplast genome sequences. Sci Rep. 5 (13957), 1-9 (2015).
- Iorizzo, M., et al. De novo assembly of the carrot mitochondrial genome using next generation sequencing of whole genomic DNA provides first evidence of DNA transfer into an angiosperm plastid genome. BMC Plant Biol. 12 (61), 1-17 (2012).
- Park, S., et al. Complete sequences of organelle genomes from the medicinal plant Rhazya stricta (Apocynaceae) and contrasting patterns of mitochondrial genome evolution across asterids. BMC Genomics. 15 (405), 1-18 (2014).
- Skippington, E., Barkman, T. J., Rice, D. W., Palmer, J. D. Miniaturized mitogenome of the parasitic plant Viscum scurruloideum is extremely divergent and dynamic and has lost all nad genes. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (27), E3515-E3524 (2015).
- Wicke, S., Schneeweiss, G. M., Hörandl, E., Appelhans, M. Chapter 1. Next Generation Sequencing in Plant Systematics. , (2015).
- Sloan, D. B. One ring to rule them all? Genome sequencing provides new insights into the ‘master circle’ model of plant mitochondrial DNA structure. New Phytol. 200 (4), 978-985 (2013).
- Woloszynska, M. Heteroplasmy and stoichiometric complexity of plant mitochondrial genomes–though this be madness, yet there’s method in’t. J Exp Bot. 61 (3), 657-671 (2010).
- Ahmed, Z., Fu, Y. B. An improved method with a wider applicability to isolate plant mitochondria for mtDNA extraction. Plant Methods. 11 (56), 1-11 (2015).
- Ejaz, M., et al. Comparison of small scale methods for the rapid and efficient extraction of mitochondrial DNA from wheat crop suitable for down-stream processes. Genet Mol Res. 13 (4), 10320-10331 (2014).
- Eubel, H., Heazlewood, J. L., Millar, A. H. Isolation and subfractionation of plant mitochondria for proteomic analysis. Methods Mol Biol. 355, 49-62 (2007).
- Hao, W., Fan, S., Hua, W., Wang, H. Effective extraction and assembly methods for simultaneously obtaining plastid and mitochondrial genomes. PLoS One. 9 (9), e108291 (2014).
- Pomeroy, M. K. Studies on the respiratory properties of mitochondria isolated from developing winter wheat seedlings. Plant Physiol. 53 (4), 653-657 (1974).
- Taylor, N. L., Stroher, E., Millar, A. H. Arabidopsis organelle isolation and characterization. Methods Mol Biol. 1062, 551-572 (2014).
- Triboush, S. O., Danilenko, N. G., Davydenko, O. G. A method for isolation of chloroplast DNA and mitochondrial DNA from Sunflower. Plant Mol Biol Rep. 16 (2), 183-189 (1998).
- Pinard, R., et al. Assessment of whole genome amplification-induced bias through high-throughput, massively parallel whole genome sequencing. BMC Genomics. 7 (216), 1-21 (2006).
- Lamble, S., et al. Improved workflows for high throughput library preparation using the transposome-based Nextera system. BMC Biotechnol. 13 (104), 1-10 (2013).
- Raley, C., et al. Preparation of next-generation DNA sequencing libraries from ultra-low amounts of input DNA: Application to single-molecule, real-time (SMRT) sequencing on the Pacific Biosciences RS II. bioRxiv. , (2014).
- Tsai, Y. C., et al. Resolving the Complexity of Human Skin Metagenomes Using Single-Molecule Sequencing. MBio. 7 (1), e01948 (2016).
- Feehery, G. R., et al. A method for selectively enriching microbial DNA from contaminating vertebrate host DNA. PLoS One. 8 (10), e76096 (2013).
- Yigit, E., Hernandez, D. I., Trujillo, J. T., Dimalanta, E., Bailey, C. D. Genome and metagenome sequencing: Using the human methyl-binding domain to partition genomic DNA derived from plant tissues. Appl Plant Sci. 2 (11), 1-6 (2014).
- Noyszewski, A. K., et al. Accelerated evolution of the mitochondrial genome in an alloplasmic line of durum wheat. BMC Genomics. 15 (67), 1-16 (2014).
- . QIAamp DNA Mini and Blood Mini Handbook Available from: https://www.qiagen.com/ch/resources/ (2016)
- . User developed protocol: Isolation of genomic DNA from plants and filamentous fungi using the QIAGEN Genomic-tip – (EN) Available from: https://www.qiagen.com/ch/resources/ (2001)
- . QIAGEN Genomic DNA Handbook Available from: https://www.qiagen.com/ch/resources/ (2012)
- Bolger, A. M., Lohse, M., Usadel, B. Trimmomatic: a flexible trimmer for Illumina sequence data. Bioinformatics. 30 (15), 2114-2120 (2014).
- Ogihara, Y., et al. Structural dynamics of cereal mitochondrial genomes as revealed by complete nucleotide sequencing of the wheat mitochondrial genome. Nucleic Acids Res. 33 (19), 6235-6250 (2005).
- Ogihara, Y., et al. Structural features of a wheat plastome as revealed by complete sequencing of chloroplast DNA. Mol Genet Genomics. 266 (5), 740-746 (2002).
- International Wheat Genome Sequencing Consortium (IWGSC). A chromosome-based draft sequence of the hexaploid bread wheat (Triticum aestivum) genome. Science. 345 (6194), (2014).
- Langmead, B., Salzberg, S. L. Fast gapped-read alignment with Bowtie 2. Nat Methods. 9 (4), 357-359 (2012).
- Bendich, A. J. Why do chloroplasts and mitochondria contain so many copies of their genome?. Bioessays. 6 (6), 279-282 (1987).
- Kumar, R. A., Oldenburg, D. J., Bendich, A. J. Changes in DNA damage, molecular integrity, and copy number for plastid DNA and mitochondrial DNA during maize development. J Exp Bot. 65 (22), 6425-6439 (2014).
- Ma, J., Li, X. Q. Organellar genome copy number variation and integrity during moderate maturation of roots and leaves of maize seedlings. Curr Genet. 61 (4), 591-600 (2015).
- Lang, E. G., et al. Simultaneous isolation of pure and intact chloroplasts and mitochondria from moss as the basis for sub-cellular proteomics. Plant Cell Rep. 30 (2), 205-215 (2011).
- Tobin, A. K. Subcellular fractionation of plant tissues. Isolation of chloroplasts and mitochondria from leaves. Methods Mol Biol. 59, 57-68 (1996).
