Optimierung und Vergleichsanalyse von pflanzlichen organellaren DNA-Anreicherungsmethoden Geeignet für die Sequenzierung der nächsten Generation
Summary
Der Vergleich und die Optimierung zweier pflanzenorganischer DNA-Anreicherungsmethoden werden vorgestellt: traditionelle Differentialzentrifugation und Fraktionierung der gesamten gDNA auf Basis des Methylierungsstatus. Wir beurteilen die resultierende DNA-Quantität und -Qualität, zeigen die Leistung in der Kurzzeit-Sequenzierung der nächsten Generation und diskutieren das Potenzial für den Einsatz in der Langzeit-Einzelmolekül-Sequenzierung.
Abstract
Pflanzenorganellare Genome enthalten große, sich wiederholende Elemente, die einer Paarung oder Rekombination unterzogen werden können, um komplexe Strukturen und / oder subgenomische Fragmente zu bilden. Organellare Genome gibt es auch in Beimischungen innerhalb einer gegebenen Zelle oder eines Gewebetyps (Heteroplasmie), und eine Fülle von Subtypen kann sich während der Entwicklung oder unter Belastung (unterstöchiometrische Verschiebung) ändern. Next-Generation-Sequenzierung (NGS) -Technologien sind erforderlich, um ein tieferes Verständnis der organellaren Genomstruktur und -funktion zu erhalten. Traditionelle Sequenzierungsstudien verwenden mehrere Methoden, um organellare DNA zu erhalten: (1) Wenn eine große Menge an Ausgangsgewebe verwendet wird, wird sie homogenisiert und einer differentiellen Zentrifugation und / oder Gradientenreinigung unterworfen. (2) Wenn eine kleinere Menge an Gewebe verwendet wird ( dh wenn Samen, Material oder Raum begrenzt sind), wird das gleiche Verfahren wie in (1) durchgeführt, gefolgt von einer Vollgenom-Amplifikation, um ausreichende DNA zu erhalten. (3) Die Analyse der Bioinformatik kann für die SeqDie gesamte genomische DNA und die Analyse der organellaren liest. Alle diese Methoden haben inhärente Herausforderungen und Kompromisse. In (1) kann es schwierig sein, eine so große Menge an Ausgangsgewebe zu erhalten; In (2) könnte eine Vollgenom-Amplifikation eine Sequenzierungsvorspannung einführen; Und in (3) könnte die Homologie zwischen nuklearen und organellaren Genomen die Versammlung und Analyse beeinträchtigen. In Pflanzen mit großen nuklearen Genomen ist es vorteilhaft, für organellare DNA zu reichern, um Sequenzierungskosten und Sequenzkomplexität für Bioinformatik-Analysen zu reduzieren. Hier vergleichen wir eine traditionelle Differentialzentrifugationsmethode mit einer vierten Methode, einem angepassten CpG-Methyl-Pulldown-Ansatz, um die gesamte genomische DNA in nukleare und organelläre Fraktionen zu trennen. Beide Methoden liefern genügend DNA für NGS, DNA, die für organelläre Sequenzen hoch angereichert ist, wenn auch mit unterschiedlichen Verhältnissen in Mitochondrien und Chloroplasten. Wir stellen die Optimierung dieser Methoden für Weizenblattgewebe vor und diskutieren große Vorteile und dNachfolgen von jedem Ansatz im Rahmen von Stichprobeneingabe, Protokoll-Leichtigkeit und Downstream-Anwendung.
Introduction
Genomsequenzierung ist ein mächtiges Werkzeug, um die zugrunde liegende genetische Basis wichtiger Pflanzenmerkmale zu sezieren. Die meisten Genom-Sequenzierungsstudien konzentrieren sich auf den Kerngenom-Gehalt, da sich die Mehrheit der Gene im Kern befindet. Allerdings organellären Genome, einschließlich der Mitochondrien (über Eukaryonten) und Plastiden (in Pflanzen, die spezielle Form, die Chloroplasten, arbeitet bei der Photosynthese) beitragen signifikante genetische Informationen wesentlich zu organismal Entwicklung, Stressreaktion, und die allgemeine Fitness 1. Organellären Genome werden typischerweise in Gesamt – DNA – Extraktionen , die für nukleare Genom – Sequenzierung enthalten, obwohl Verfahren Organell Zahlen vor der DNA – Extraktion zu reduzieren auch 2 eingesetzt werden. Viele Studien haben Sequenzierungsergebnisse aus Gesamt-gDNA-Extraktionen verwendet, um die organellaren Genome 3 , 4 , 5 ,Xref "> 6 , 7. Wenn jedoch das Ziel der Studie auf organellare Genome zu konzentrieren ist, erhöht die Gesamt-gDNA die Sequenzierungskosten, da viele Lesungen an die nuklearen DNA-Sequenzen, insbesondere in Pflanzen mit großen nuklearen Genomen, verloren gehen Darüber hinaus ist aufgrund der Vervielfältigung und Übertragung von organellaren Sequenzen in das nukleare Genom und zwischen Organellen die Auflösung der korrekten Kartierungsposition der Sequenzierung auf das richtige Genom bioinformatisch anspruchsvoll 2 , 8. Die Reinigung von organellaren Genomen aus dem nuklearen Genom ist eine Strategie, um diese Probleme zu reduzieren. Weitere Bioinformatik-Strategien können verwendet werden, um Lesungen zu trennen, die in Regionen der Homologie zwischen den Mitochondrien und Chloroplasten abbilden.
Während die organellaren Genome aus vielen Pflanzenarten sequenziert wurden, ist wenig über die Breite der organellaren Genomvielfalt bekanntVerfügbar in wilden Populationen oder in kultivierten Zuchtpools. Organellare Genome sind auch als dynamische Moleküle bekannt, die eine signifikante strukturelle Umlagerung durch Rekombination zwischen den Wiederholungssequenzen 9 erfahren. Darüber hinaus sind mehrere Kopien des organellaren Genoms in jeder Organelle enthalten, und mehrere Organellen sind in jeder Zelle enthalten. Nicht alle Kopien dieser Genome sind identisch, was als Heteroplasmie bekannt ist. Im Gegensatz zum kanonischen Bild der "Meisterkreise" gibt es jetzt wachsende Hinweise auf ein komplexeres Bild von organellaren Genomstrukturen, darunter sub-genomische Kreise, lineare Chromosomen, lineare Concatamere und verzweigte Strukturen 10 . Die Zusammenstellung von pflanzlichen organellaren Genomen wird durch ihre relativ großen Größen und erheblichen umgekehrten und direkten Wiederholungen weiter kompliziert.
Traditionelle Protokolle für organellare Isolierung, DNA-Reinigung und nachfolgendes Genom E Sequenzierung sind oft schwerfällig und erfordern große Mengen an Gewebeeintritt, wobei mehrere Gramm bis zu Hunderten von Gramm jungem Blattgewebe als Ausgangspunkt 11 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17 erforderlich sind. Dies macht die organische Genomsequenzierung unzugänglich, wenn das Gewebe begrenzt ist. In einigen Situationen sind die Saatgutmengen begrenzt, z. B. wenn es notwendig ist, auf einer Generationsbasis oder in männlichen sterilen Linien zu sequenzieren, die über eine Kreuzung aufrechterhalten werden müssen. In diesen Situationen kann organellare DNA gereinigt und dann einer Vollgenom-Amplifikation unterworfen werden. Allerdings kann die Vollgenom-Amplifikation eine signifikante Sequenzierungsvorspannung einführen, was ein besonderes Problem bei der Beurteilung von Strukturvariation, sub-genomischen Strukturen und Heteroplasmie-Niveaus ist> 18 Jüngste Fortschritte in der Bibliotheksvorbereitung für Kurz-Lese-Sequenzierungstechnologien haben niedrige Eingangsbarrieren überwunden, um eine Vollgenom-Verstärkung zu vermeiden. Zum Beispiel ermöglicht das Illumina Nextera XT-Bibliotheks-Präparationskit so wenig wie 1 ng DNA als Eingang 19 verwendet werden . Allerdings benötigen Standard-Bibliothekspräparate für Langzeit-Sequenzierungsanwendungen, wie z. B. PacBio- oder Oxford-Nanopore-Sequenztechnologien, noch eine relativ hohe Menge an Input-DNA, die eine Herausforderung für die organelläre Genomsequenzierung darstellen kann. In letzter Zeit wurden neue, benutzerdefinierte, lang ersehnte Sequenzprotokolle entwickelt, um die Eingangsmengen zu reduzieren und zu helfen, die Genomsequenzierung in Proben zu erleichtern, wo das Erhalten von Mikrogrammmengen von DNA schwierig ist 20 , 21 . Allerdings bleibt die Erzielung hochmolekularer, reiner organellarer Fraktionen zur Einspeisung in diese Bibliothekspräparate eine Herausforderung.
Wir suchten tO vergleichen und optimieren organellare DNA Anreicherung und Isolation Methoden geeignet für NGS ohne die Notwendigkeit der Voll-Genom-Amplifikation. Insbesondere war es unser Ziel, Best Practices zu bestimmen, um für hochmolekulare organellare DNA aus begrenzten Ausgangsmaterialien, wie z. B. einer Teilprobe eines Blattes, zu bereichern. Diese Arbeit stellt eine vergleichende Analyse von Methoden zur Anreicherung der organellaren DNA dar: (1) ein modifiziertes, traditionelles Differentialzentrifugationsprotokoll gegenüber (2) einem DNA-Fraktionierungsprotokoll, das auf der Verwendung eines kommerziell erhältlichen DNA-CpG-Methyl-Bindungsdomänen-Protein-Pulldown-Ansatzes basiert 22 auf Pflanzengewebe 23 angewendet. Wir empfehlen Best Practices für die Isolierung von organellaren DNA aus Weizenblattgewebe, die sich leicht auf andere Pflanzen und Gewebetypen erweitern lassen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bis heute konzentrieren sich die meisten organellaren Sequenzierungsstudien auf traditionelle DC-Methoden, um für spezifische DNA zu bereichern. Verfahren zur Isolierung von Organellen aus verschiedenen Pflanzen wurden beschrieben, einschließlich Moos 40 ; Monokotten wie Weizen 15 und Hafer 11 ; Und Dicots wie Arabidopsis 11 , Sonnenblumen 17 und Raps 14 . Die meisten Protokol…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir möchten die Finanzierung aus dem United States Department of Agriculture-Agricultural Research Service und der National Science Foundation (IOS 1025881 und IOS 1361554) anerkennen. Wir danken R. Caspers für Gewächshauspflege und Pflanzenpflege. Wir danken auch der University of Minnesota Genomics Center, wo die Illumina Bibliothek Vorbereitungen und Sequenzierung durchgeführt wurden. Wir sind auch dankbar für die Kommentare der Zeitschriftenredakteure und vier anonyme Rezensenten, die unser Manuskript weiter gestärkt haben. Wir danken OECD für ein Stipendium für SK, um diese Protokolle für kollaborative Projekte mit Kollegen in Japan zu integrieren.
Materials
| 2-mercaptoethanol (beta-mercaptoethanol; BME) | Sigma Aldrich | M3148-100ml | |
| 2-propanol (Isopropyl alcohol/isopropanol), bioreagent | Sigma Aldrich | I9516 | |
| agarose, Bio-Rad Cetified Megabase agarose | Bio-Rad | 1613108 | |
| analytical balance | Mettler Toledo | AB54-S | |
| balance | Mettler Toledo | PB1502-S | |
| bovine serum albumin (BSA) | Sigma Aldrich | B4287-25G | |
| Ceramic grinding cylinders, 3/8in x 7/8in | SPEX SamplePrep | 2183 | |
| Cryogenic Blocks compatible with tissue homogenizer for holding 50 ml tubes | SPEX SamplePrep | 2664 | |
| DNaseI | Sigma | DN25 | |
| ethanol, absolute | Decon Laboratories | 2716 | |
| Ethylenediamine Tetraacetic Acid (EDTA), 0.5M Solution, pH8.0 | Fisher | BP2482-500 | |
| gel imaging system | |||
| gel stain | Such as GelRed or Ethidium Bromide | ||
| grinding pestle, wide tip for 2 ml conical tubes | |||
| Guanidine-HCl, 8M solution | ThermoFisher | 24115 | |
| LightCycler 480 SYBR Green I Master | Roche | 4707516001 | |
| liquid nitrogen | |||
| Lysing enzymes from Trichoderma harzianum | Sigma | L1412 | |
| Magnesium Chloride | G Bioscience | 24115 | |
| magnetic rack | ThermoFisher | A13346 | |
| microcentrifuge tubes, LoBind 1.5 ml | Eppendorf | 22431021 | |
| microcentrifuge tubes, standard nuclease-free 1.5 ml | Eppendorf | ||
| microcentrifuge, refrigerated | Sorvall | Legend X1R | Or equivalent product, must be capable of reaching at least 18,000 x g with rotors for 50 ml tubes, Oak Ridge tubes, and 1.5 ml tubes |
| microcentrifuge, room temperature | Eppendorf | 5424 | Or equivalent product, must be capable of reaching at least 18,000 x g with rotor for 1.5 ml and 2 ml microcentrifuge tubes |
| Microcon DNA Fast Flow Centrifugal Filter Units | EMD Millipore | MRCFOR100 | |
| Miracloth, 1 square per sample cut to fit funnel | EMD Millipore | 475855 | |
| NEBNext Microbiome DNA Enrichment Kit | New England Biolabs | E2612L | |
| parafilm | Parafilm M | PM992 | |
| plastic pots and trays | |||
| polyvinylpyrrolidone (PVP) | Fisher | BP431-100 | |
| Proteinase K | Qiagen | 19131 | |
| Pulsed-Field Gel Electrophoresis rig (e.g. CHEF DR III) | Bio-Rad | 1703697 | |
| purification beads, Agencourt AMpureXP beads | Beckman Coulter | A63881 | |
| QIAamp DNA Mini Kit | Qiagen | 51304 | |
| Qiagen 20/g Genomic Tip DNA Extraction Kit | Qiagen | 10223 | |
| Qiagen Buffer EB (elution buffer) | Qiagen | 19086 | |
| Qiagen DNA Extraction Buffer Set | Qiagen | 19060 | |
| QiaRack | Qiagen | 19015 | |
| qPCR machine (e.g. Roche Light Cycler 480) | Roche | ||
| qPCR plate sealing film | Roche | 4729757001 | |
| qPCR plate, 96 well plate | Roche | 4729692001 | |
| Qubit assay tubes | Life Technologies | Q32856 | |
| Qubit Broad Spectrum assay kit | Life Technologies | Q32850 | |
| Qubit High Sensitivity assay kit | Life Technologies | Q32851 | |
| RNaseA | Qiagen | 19101 | |
| Serological pipettes (20 ml) and pipet-aid | Fisher | 13-678-11 | |
| Small funnels, 1 per sample | |||
| Sodium Chloride | Ambion | AM9759 | |
| Soft paintbrush, 2 per sample | |||
| SPEX SamplePrep 2010 Geno/Grinder or another type of tissue homogenizer | SPEX SamplePrep | Or another comparable tissue homogenizer. If you do not have access to a tissue homogenizer, then grinding in a pre-chilled mortar and pestle will suffice (see protocol for details). However, a homogenizer will give more consistent results and total homogenization time is reduced. | |
| Sucrose | Omnipure | 8550 | |
| TBE | |||
| thermomixer | |||
| Tris | Sigma | T2819-100ml | |
| Triton X-100 | Promega | H5142 | |
| tube rotater | |||
| tubes, 50 mL conical polypropylene | Corning | 352070 | |
| tubes, 50 ml high-speed polypropylene | ThermoScientific/Nalgene | 3119-0050 | e.g. Nalgene Oakridge tubes or equivalent |
| vermiculite | |||
| water bath | |||
| water, sterile and certified Nuclease-free | Fisher | 1481 | |
| water, sterile milliQ |
References
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