Otimização e Análise Comparativa de Métodos de Enriquecimento de DNA de Plantas Organizadas Adequado para Seqüenciamento de Próxima Geração
Summary
A comparação e otimização de dois métodos de enriquecimento de DNA orgânico de plantas são apresentadas: centrifugação diferencial tradicional e fracionamento do gDNA total com base no estado de metilação. Nós avaliamos a quantidade e a qualidade de DNA resultantes, demonstram desempenho em seqüenciamento de próxima geração de leitura curta e discutimos o potencial para uso em sequenciação de moléculas únicas de leitura longa.
Abstract
Os genomas orgânicos de plantas contêm elementos grandes e repetitivos que podem sofrer combinação ou recombinação para formar estruturas complexas e / ou fragmentos sub-genômicos. Os genomas de Organellar também existem em misturas dentro de uma determinada célula ou tipo de tecido (heteroplasmia), e uma abundância de subtipos pode mudar ao longo do desenvolvimento ou quando sob estresse (deslocamento sub-estequiométrico). As tecnologias de sequenciação de próxima geração (NGS) são necessárias para obter uma compreensão mais profunda da estrutura e da função do genoma organelar. Estudos de seqüenciamento tradicionais usam vários métodos para obter DNA organelar: (1) Se uma grande quantidade de tecido inicial é usada, é homogeneizada e submetida a centrifugação diferencial e / ou a depuração gradiente. (2) Se uma quantidade menor de tecido é usada ( ou seja, se sementes, material ou espaço é limitado), o mesmo processo é realizado como em (1), seguido de amplificação de todo o genoma para obter DNA suficiente. (3) A análise de bioinformática pode ser usada para seqUence o DNA genômico total e analisar as leituras orgânicas. Todos esses métodos têm desafios e compromissos inerentes. Em (1), pode ser difícil obter uma quantidade tão grande de tecido inicial; Em (2), a amplificação do genoma inteiro poderia introduzir um viés de seqüenciamento; E em (3), a homologia entre genomas nucleares e organelares poderia interferir na montagem e análise. Em plantas com grandes genomas nucleares, é vantajoso enriquecer o DNA organelar para reduzir os custos de sequenciação e a complexidade da sequência para análises de bioinformática. Aqui, comparamos um método de centrifugação diferencial tradicional com um quarto método, uma abordagem adaptada de CpG-methyl pulldown, para separar o DNA genômico total em frações nucleares e orgânicas. Ambos os métodos produzem DNA suficiente para NGS, DNA que é altamente enriquecido para seqüências organelares, embora em diferentes proporções nas mitocôndrias e nos cloroplastos. Apresentamos a otimização desses métodos para o tecido das folhas de trigo e discutimos grandes vantagens e dSão vantagens de cada abordagem no contexto de entrada de amostra, facilidade de protocolo e aplicação a jusante.
Introduction
O seqüenciamento do genoma é uma ferramenta poderosa para dissecar a base genética subjacente de traços importantes da planta. A maioria dos estudos de sequenciação do genoma se concentra no conteúdo do genoma nuclear, já que a maioria dos genes está localizada no núcleo. No entanto, os genomas organelares, incluindo as mitocôndrias (através de eucariotas) e os plastidios (nas plantas, a forma especializada, o cloroplasto, funciona na fotossíntese) contribuem com informações genéticas significativas essenciais ao desenvolvimento organizacional, à resposta ao estresse e à aptidão geral 1 . Os genomas organelares são tipicamente incluídos em extrações de DNA total destinadas ao seqüenciamento do genoma nuclear, embora também sejam empregados métodos para reduzir o número de organelas antes da extração de DNA 2 . Muitos estudos usaram resultados de seqüenciamento das extrações totais de gDNA para reunir genomas organelares 3 , 4 , 5 ,xref "> 6, 7. No entanto, quando o alvo do estudo é se concentrar em genomas organelares, usando o gADN total aumenta os custos de seqüenciamento porque muitas leituras são 'perdidos' para as seqüências de DNA nuclear, particularmente em plantas com grandes genomas nucleares Além disso, devido à duplicação e transferência de seqüências organelares para o genoma nuclear e entre organelas, a resolução da correta posição de mapeamento das leituras de seqüência para o genoma apropriado é um desafio bioinformático 2 , 8. A purificação de genomas organelares do genoma nuclear é uma Estratégia para reduzir esses problemas. Outras estratégias de bioinformática podem ser usadas para separar as leituras desse mapa para regiões de homologia entre mitocôndrias e cloroplastos.
Enquanto os genomas organelares de muitas espécies de plantas foram sequenciados, pouco se sabe sobre a amplitude da diversidade organometrica do genomaDisponíveis em populações selvagens ou em piscinas cultivadas. Os genomas orgânicos também são conhecidos por moléculas dinâmicas que sofrem rearranjo estrutural significativo devido à recombinação entre as seqüências repetidas 9 . Além disso, várias cópias do genoma orgânico estão contidas dentro de cada organela e várias organelas estão contidas em cada célula. Nem todas as cópias desses genomas são idênticas, o que é conhecido como heteroplasmia. Em contraste com a imagem canônica de "círculos mestres", há agora evidências crescentes de uma imagem mais complexa das estruturas do genoma organelar, incluindo círculos sub-genômicos, cromossomos lineares, concatomas lineares e estruturas ramificadas 10 . A montagem dos genomas orgânicos de plantas é ainda mais complicada por seus tamanhos relativamente grandes e repetições substanciais inversas e diretas.
Protocolos tradicionais para isolamento organelar, purificação de DNA e genoma subseqüente A seqüenciamento é muitas vezes pesada e requer grandes volumes de entrada de tecido, com vários gramas para cima de centenas de gramas de tecido de folhas jovens necessárias como ponto de partida 11 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17 . Isso torna o seqüenciamento genômico organelar inacessível quando o tecido é limitado. Em algumas situações, as quantidades de sementes são limitadas, como quando é necessário seqüenciar em uma base geracional ou em linhas estéreis masculinas que devem ser mantidas por cruzamento. Nessas situações, o DNA organelar pode ser purificado e depois submetido a amplificação do genoma total. No entanto, a amplificação do genoma total pode introduzir um viés de sequenciação significativo, o que é um problema particular ao avaliar variações estruturais, estruturas sub-genômicas e níveis de heteroplastia> 18. Os avanços recentes na preparação da biblioteca para tecnologias de seqüência de leitura curta superaram barreiras de baixa entrada para evitar a amplificação do genoma total. Por exemplo, o kit de preparação da biblioteca Illumina Nextera XT permite que apenas 1 ng de DNA seja usado como entrada 19 . No entanto, as preparações de bibliotecas padrão para aplicações de seqüência de leitura longa, como as tecnologias de sequenciação PacBio ou Oxford Nanopore, ainda requerem uma quantidade relativamente alta de DNA de entrada, o que pode representar um desafio para o seqüenciamento genômico organelar. Recentemente, foram desenvolvidos novos protocolos de seqüência de leitura longa, elaborados para reduzir as quantidades de insumos e ajudar a facilitar o seqüenciamento do genoma em amostras onde a obtenção de microgramas de quantidades de DNA é difícil 20 , 21 . No entanto, a obtenção de fracções orgânicas puras de peso molecular elevado para alimentar estas preparações de biblioteca continua a ser um desafio.
Buscamos tO comparar e otimizar métodos de enriquecimento e isolamento de DNA organelar adequados para NGS sem a necessidade de amplificação do genoma total. Especificamente, nosso objetivo era determinar as melhores práticas para enriquecer o DNA organelar de alto peso molecular de materiais de partida limitados, como uma subconjunto de uma folha. Este trabalho apresenta uma análise comparativa de métodos para enriquecer para o DNA organelar: (1) um protocolo de centrifugação diferencial modificado e tradicional versus (2) um protocolo de fracionamento de DNA com base no uso de uma abordagem comercial de DNA CpG-ligação de metilação 22 aplicado ao tecido vegetal 23 . Recomendamos melhores práticas para o isolamento de DNA organelar a partir de tecido de folha de trigo, que pode ser facilmente estendido para outras plantas e tipos de tecido.
Protocol
Representative Results
Discussion
Até à data, a maioria dos estudos de sequenciação organelar se centra em métodos tradicionais de DC para enriquecer para DNA específico. Foram descritos métodos para isolar organelas de diversas plantas, incluindo o musgo 40 ; Monocotiledose, como o trigo 15 e a aveia 11 ; E dicotiledóneas, como arabidopsis 11 , girassol 17 e colza 14 . A maioria dos protocolos concentra…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gostaríamos de reconhecer financiamento do Departamento de Agricultura dos Estados Unidos – Serviço de Pesquisa Agrícola e da National Science Foundation (IOS 1025881 e IOS 1361554). Agradecemos a R. Caspers pela manutenção de estufas e cuidados com plantas. Agradecemos também ao Centro de Genômica da Universidade de Minnesota, onde foram realizados os preparativos e sequenciações da biblioteca Illumina. Também agradecemos os comentários dos editores da revista e quatro revisores anônimos que reforçaram ainda mais o nosso manuscrito. Também agradecemos à OCDE uma bolsa de estudos para a SK para integrar esses protocolos para projetos colaborativos com colegas no Japão.
Materials
| 2-mercaptoethanol (beta-mercaptoethanol; BME) | Sigma Aldrich | M3148-100ml | |
| 2-propanol (Isopropyl alcohol/isopropanol), bioreagent | Sigma Aldrich | I9516 | |
| agarose, Bio-Rad Cetified Megabase agarose | Bio-Rad | 1613108 | |
| analytical balance | Mettler Toledo | AB54-S | |
| balance | Mettler Toledo | PB1502-S | |
| bovine serum albumin (BSA) | Sigma Aldrich | B4287-25G | |
| Ceramic grinding cylinders, 3/8in x 7/8in | SPEX SamplePrep | 2183 | |
| Cryogenic Blocks compatible with tissue homogenizer for holding 50 ml tubes | SPEX SamplePrep | 2664 | |
| DNaseI | Sigma | DN25 | |
| ethanol, absolute | Decon Laboratories | 2716 | |
| Ethylenediamine Tetraacetic Acid (EDTA), 0.5M Solution, pH8.0 | Fisher | BP2482-500 | |
| gel imaging system | |||
| gel stain | Such as GelRed or Ethidium Bromide | ||
| grinding pestle, wide tip for 2 ml conical tubes | |||
| Guanidine-HCl, 8M solution | ThermoFisher | 24115 | |
| LightCycler 480 SYBR Green I Master | Roche | 4707516001 | |
| liquid nitrogen | |||
| Lysing enzymes from Trichoderma harzianum | Sigma | L1412 | |
| Magnesium Chloride | G Bioscience | 24115 | |
| magnetic rack | ThermoFisher | A13346 | |
| microcentrifuge tubes, LoBind 1.5 ml | Eppendorf | 22431021 | |
| microcentrifuge tubes, standard nuclease-free 1.5 ml | Eppendorf | ||
| microcentrifuge, refrigerated | Sorvall | Legend X1R | Or equivalent product, must be capable of reaching at least 18,000 x g with rotors for 50 ml tubes, Oak Ridge tubes, and 1.5 ml tubes |
| microcentrifuge, room temperature | Eppendorf | 5424 | Or equivalent product, must be capable of reaching at least 18,000 x g with rotor for 1.5 ml and 2 ml microcentrifuge tubes |
| Microcon DNA Fast Flow Centrifugal Filter Units | EMD Millipore | MRCFOR100 | |
| Miracloth, 1 square per sample cut to fit funnel | EMD Millipore | 475855 | |
| NEBNext Microbiome DNA Enrichment Kit | New England Biolabs | E2612L | |
| parafilm | Parafilm M | PM992 | |
| plastic pots and trays | |||
| polyvinylpyrrolidone (PVP) | Fisher | BP431-100 | |
| Proteinase K | Qiagen | 19131 | |
| Pulsed-Field Gel Electrophoresis rig (e.g. CHEF DR III) | Bio-Rad | 1703697 | |
| purification beads, Agencourt AMpureXP beads | Beckman Coulter | A63881 | |
| QIAamp DNA Mini Kit | Qiagen | 51304 | |
| Qiagen 20/g Genomic Tip DNA Extraction Kit | Qiagen | 10223 | |
| Qiagen Buffer EB (elution buffer) | Qiagen | 19086 | |
| Qiagen DNA Extraction Buffer Set | Qiagen | 19060 | |
| QiaRack | Qiagen | 19015 | |
| qPCR machine (e.g. Roche Light Cycler 480) | Roche | ||
| qPCR plate sealing film | Roche | 4729757001 | |
| qPCR plate, 96 well plate | Roche | 4729692001 | |
| Qubit assay tubes | Life Technologies | Q32856 | |
| Qubit Broad Spectrum assay kit | Life Technologies | Q32850 | |
| Qubit High Sensitivity assay kit | Life Technologies | Q32851 | |
| RNaseA | Qiagen | 19101 | |
| Serological pipettes (20 ml) and pipet-aid | Fisher | 13-678-11 | |
| Small funnels, 1 per sample | |||
| Sodium Chloride | Ambion | AM9759 | |
| Soft paintbrush, 2 per sample | |||
| SPEX SamplePrep 2010 Geno/Grinder or another type of tissue homogenizer | SPEX SamplePrep | Or another comparable tissue homogenizer. If you do not have access to a tissue homogenizer, then grinding in a pre-chilled mortar and pestle will suffice (see protocol for details). However, a homogenizer will give more consistent results and total homogenization time is reduced. | |
| Sucrose | Omnipure | 8550 | |
| TBE | |||
| thermomixer | |||
| Tris | Sigma | T2819-100ml | |
| Triton X-100 | Promega | H5142 | |
| tube rotater | |||
| tubes, 50 mL conical polypropylene | Corning | 352070 | |
| tubes, 50 ml high-speed polypropylene | ThermoScientific/Nalgene | 3119-0050 | e.g. Nalgene Oakridge tubes or equivalent |
| vermiculite | |||
| water bath | |||
| water, sterile and certified Nuclease-free | Fisher | 1481 | |
| water, sterile milliQ |
References
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