Summary
Se presenta un protocolo para el establecimiento de un modelo genético de ratón de cáncer colorrectal por infección segmentaria de adenovirus y su vigilancia mediante colonoscopia de alta resolución.
Abstract
A pesar de las ventajas de la fácil aplicabilidad y rentabilidad, los modelos de ratones de cáncer colorrectal basados en la inyección de células tumorales tienen limitaciones severas y no simulan con precisión la biología tumoral y la diseminación de células tumorales. Se han introducido modelos de ratón genéticamente modificados para superar estas limitaciones; Sin embargo, tales modelos son técnicamente exigentes, especialmente en órganos grandes como el colon en el que sólo se desea un solo tumor.
Como resultado, se desarrolló un modelo inmunocompetente, modificado genéticamente, de cáncer colorrectal que desarrolla tumores muy uniformes y puede usarse para estudios de biología tumoral así como para ensayos terapéuticos. El desarrollo tumoral se inicia mediante la infección quirúrgica segmentaria del colon distal con el virus adeno-cre en ratones mutantes condicionalmente compuestos. Los tumores pueden ser fácilmente detectados y monitorizados vía colonoscopia. Aquí describimos la técnica quirúrgica de la infección segmentaria adeno-cre deEl colon, la vigilancia del tumor vía colonoscopia de alta resolución y presentan los tumores colorrectales resultantes.
Introduction
El cáncer colorrectal (CRC) sigue siendo una de las principales causas de muerte relacionada con el cáncer en los países occidentales. 1 Aunque el pronóstico de los pacientes con enfermedad en estadio temprano es bueno, muchos tumores son diagnosticados en etapas posteriores en los que, a pesar de las numerosas opciones de tratamiento, el pronóstico es limitado. 2 , 3 , 4 , 5
La mayoría de los actuales modelos de CRC de ratones se basan en la implantación de células tumorales derivadas de líneas celulares o tumores de pacientes en ratones inmunodeficientes. 6 , 7 , 8 Esto conduce a local y, dependiendo del sitio de inyección y de las células tumorales utilizadas para inyección, a veces tumores metastásicos. 9 , 10 Sin embargo, los modelos de xenoinjerto resultantes tienen majoR limitaciones. Deben establecerse en ratones inmunodeficientes, eliminando así la interacción compleja entre el tumor y el sistema inmune del huésped. Además, como el estroma tumoral se deriva de las células huésped, la interacción entre el parénquima tumoral humano y el estroma murino es defectuosa y por lo tanto no es representativa de la enfermedad. Estas deficiencias pueden evitarse mediante el uso de líneas de células murinas para inyección. Sin embargo, sólo hay pocas líneas de células de CRC murinas disponibles y, similares a la mayoría de las líneas de células CRC humanas disponibles, son monoclonales y altamente anaplásticas. En resumen, la mayoría de los modelos de ratón CRC actualmente disponibles son altamente artificiales y no son totalmente representativos de la enfermedad humana.
Modelos de ratón genéticamente modificados (GEMM) de CRC pueden evitar estos inconvenientes, ya que presentan verdaderos tumores de ratón que se crean a través de la inducción de las principales mutaciones de CRC en el colon. 12 , 13 ,Esto puede lograrse mediante la activación de las mutaciones de la línea germinal condicional (floxed) por cre recombinasa dentro de la mucosa colorrectal. Mientras que en GEMMs de muchas otras entidades tumorales germline (inducible) cre expresión impulsada por promotores específicos de tejidos se utiliza, línea germinal cre no se puede utilizar en el colon, ya que esto conduce a un gran número de adenomas en todo el colon causando la muerte por tumor benigno carga a Una edad muy joven. Por lo tanto, en el modelo descrito aquí se utiliza un vector adenoviral que expresa cre para infectar un segmento de colon corto. Esto conduce a la inducción de la tumorigénesis dentro de este segmento de la mucosa en un punto de tiempo definido por el investigador, dando lugar a adenomas en última instancia, progresando a carcinoma invasivo y metastásico. Los tumores son verdaderos tumores de ratón, crecen en un microambiente intacto y por lo tanto son capaces de simular la totalidad de la oncogénesis colorrectal incluyendo la interacción tumor-huésped y la cascada metastásica. Este modelo esPor lo tanto, una plataforma atractiva para estudios de biología del cáncer y ensayos terapéuticos preclínicos.
Una de las principales desventajas de los modelos de CRC modificados genéticamente es su complejidad técnica. Se ha descrito anteriormente la administración local de crema usando enemas de adeno-crema rectales en ratones que llevan alelos de Apc floxed; Sin embargo, la incidencia, multiplicidad y localización de los tumores intestinales puede ser altamente variable con esta técnica. Por lo tanto, se ha desarrollado la técnica de confinar la infección adeno-cre por pinzamiento quirúrgico del segmento a inducir. 13 Hemos modificado este procedimiento con el fin de mejorar el bienestar animal, así como reducir la mortalidad y el número de tumores resultantes. Con este protocolo, todos los laboratorios con experiencia en cirugía de roedores pequeños deben ser capaces de reproducir el modelo y producir tumores que sean altamente reproducibles y de fácil acceso a la colonoscopia. Dependiendo del condicional mUvas utilizadas para la tumorigénesis, se puede observar el espectro completo de adenoma, carcinoma invasivo y metástasis. Como los tumores se localizan en el colon distal, la evaluación endoscópica seriada es fácilmente posible en este modelo.
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Protocol
Los experimentos con animales presentados aquí fueron revisados y aprobados de forma independiente por un Comité institucional y gubernamental de Cuidado y Uso de Animales y se llevaron a cabo de acuerdo con las directrices de la Federación de Asociaciones de Ciencia Animal de Laboratorio (FELASA). Todas las medidas posibles fueron tomadas para minimizar el sufrimiento incluyendo anestesia y analgesia o, si es necesario, eutanasia prematura.
1. Inducción local del tumor a través de la infección adenovirúrgica quirúrgica
- Preparación de animales para la cirugía
NOTA: Prácticamente cualquier mutación condicional ("floxed") puede ser inducida a través del método aquí descrito. Se recomienda el uso de mutaciones en genes relevantes en cáncer colorrectal como Apc, Kras o Tp53. La eficacia de la recombinación cre es dependiente del tamaño del constructo que se va a extirpar. Las secuencias floxed grandes son excised menos eficientemente. La recombinación de todos los alelos debe ser confirmada en los tumores por PCR.- Para el desarrollo de tumores colorrectales, utilice un cruzamiento de los siguientes alelos condicionales para un modelo básico de CRC (número de base de datos MGI entre paréntesis):
Apc tm2Rak (MGI: 3688435) 16
Kras tm4Tyj (MGI: 2429948) 17
Tp53 tm2Tyj (MGI: 3039263) 18 - Si se requiere un alelo indicador de fluorescencia ( por ejemplo , para detectar micrometástasis), utilice el siguiente alelo:
Gt (ROSA) _ { 26 } S o tm _ { 6 } (CAG - ZsGreen _ {1 }) Hze (MGI: 3809522) 19
NOTA: Todas las cepas anteriores están disponibles a través del NCI Mouse Repository o el Laboratorio de Jackson. No se requiere ayuno, ya que toda la materia fecal restante puede eliminarse antes de la infección adenoviral. El ayuno preoperatorio conduce a una mayor mortalidad perioperatoria y constituye un tremendo estrés para los pequeños roedores. - Utilice sevoflurano a 3 - 3,5% en volumen para anestesia general. Una pérdida de tEl reflejo de pellizcar el dedo del pie indica suficiente anestesia.
- Antes de la primera incisión, inyectar 0,05 mg / kg de buprenorfina por vía subcutánea.
- Cubrir los ojos del ratón anestesiado con pomada oftálmica para evitar la desecación de la córnea.
- Coloque el ratón en posición supina sobre una mesa pequeña. Utilice cintas adhesivas no traumáticas para restringir el ratón.
- Afeitar el abdomen con una máquina de afeitar eléctrica (la crema depilatoria se puede utilizar alternativamente) y desinfectar con los hisopos del alcohol o el yodo. Use el tiempo de contacto recomendado por el fabricante.
- Cubrir el campo quirúrgico con cortinas estériles.
NOTA: El uso de antibióticos perioperatorios es opcional y está sujeto a las pautas institucionales. - Utilice instrumentos estériles de un solo uso o esterilizados para todos los procedimientos quirúrgicos.
- Para el desarrollo de tumores colorrectales, utilice un cruzamiento de los siguientes alelos condicionales para un modelo básico de CRC (número de base de datos MGI entre paréntesis):
- Laparotomía de la línea media y la exposición del colon
- Utilice las tijeras (los escalpelos se pueden utilizar alternativamente) para hacer una incisión de la línea media(~ 15 mm) de la piel en la parte inferior del abdomen.
- Recoger la musculatura de la pared abdominal con fórceps y cuidadosamente incise con tijeras, abriendo así la cavidad abdominal.
- Identificar el colon distal, sólo tocarlo con pinzas atraumáticas. Abrazadera del colon con una pinza delgada ( por ejemplo , una abrazadera vascular Micro Serrefine) aproximadamente 15 mm proximal del ano.
NOTA: Preste especial atención a la vulnerabilidad del colon en todo momento. La perforación conduce inevitablemente a peritonitis y sepsis y requiere eutanasia del animal.
- Infección del colon segmentario con el virus Adeno-cre
- Insertar un tubo de Teflón flexible transanalmente y avanzar cuidadosamente hasta alcanzar la oclusión del lumen lograda por la abrazadera colocada previamente a 15 mm del borde anal. No utilice el exceso de fuerza, ya que esto puede provocar perforación.
- Cannulate el tubo con una cánula 30G, conecte una jeringuilla estándar de 1 mL y enjuague el coloN con solución salina normal con el fin de evacuar la materia fecal restante. Esto puede requerir varios ml de solución salina.
- Una vez que el colon distal está vacío quitar el tubo y reemplazarlo con un tubo de Teflon fresco y de nuevo la posición directamente distal a la abrazadera como se describe anteriormente.
- Ocultar el colon con una segunda pinza ~ 3 mm distal a la abrazadera proximal ( es decir , sobre el tubo insertado, ~ 12 mm desde el borde anal), resultando en un segmento aislado de 3 mm para ser infectado.
NOTA: Para la oclusión distal del segmento, los clips de la arteria coronaria de Fogarty han demostrado ser los más adecuados ya que están cauchutados, lo que lleva a una oclusión del colon a pesar del tubo intraluminal entre las ramas de la abrazadera. - Utilice una segunda jeringa (1 ml estándar con una cánula de 30 G) para inyectar cuidadosamente 50 a 80 μL de tripsina-EDTA al 0,25% en el segmento de colon fijado e incubar durante 10 min. Deje la cánula y la jeringa unidas al tubo de Teflón para evitar que el líquido se filtre hacia atrás.
- Primero quite la abrazadera distal, y luego el tubo de tripsina.
- Enjuague el colon distal con ~ 500 μL de solución salina normal para eliminar la tripsina restante.
- Inserte un nuevo tubo de Teflón, vuelva a colocar la abrazadera distal e infle el segmento de colon con 50 - 80 μl de solución adenoviral (10 11 unidades formadoras de placas (PFU) / ml en solución salina tamponada con fosfato) e incube durante 30 min Figura 2A ).
NOTA: No derrame la solución viral ya que el contacto con el adenol puede conducir al desarrollo del tumor en cualquier tejido de ratones mutantes condicionalmente. - Retire las abrazaderas y el tubo.
- Cierre del abdomen y recuperación postoperatoria
- Cierre la pared abdominal con 6-0 de absorción rápida(Por ejemplo , polidioxanona (PDS)).
- Cierre la piel con clips para heridas quirúrgicas.
- Coloque el ratón sobre la almohadilla calentadora ajustada a 38 ° C hasta que se haya recuperado completamente de la anestesia.
- Administrar otro bolo de buprenorfina ip 0,05 mg / kg 12 h después de la cirugía, seguido de bolos adicionales de buprenorfina cada 12 h si es necesario.
- Vigilar a los ratones al menos una vez al día para detectar signos de angustia debido al crecimiento del tumor.
2. Colonoscopia
NOTA: Dependiendo de las mutaciones condicionales utilizadas, la infección adenoviral conduce a tumores endoscópicamente visibles dentro de 2 a 4 semanas. Por lo tanto, realice la primera colonoscopia postoperatoria 2 semanas después de la inducción adenoviral y repita cada 2 semanas. Se recomienda un sistema disponible comercialmente para la colonoscopia murina. 20
- Preparación de animales para colonoscopia
NOTA: No hay necesidad de ayunoEd. La materia fecal restante suele estar bien formada en el colon distal y puede ser empujada más allá del tumor durante la colonoscopia, lo que hace innecesario el proceso estresante del ayuno repetido.- Utilice sevoflurano a 3 - 3,5% en volumen para anestesia general. Una pérdida del reflejo de pinza del dedo del pie indica suficiente anestesia.
- Cubrir los ojos de los ratones anestesiados con pomada oftálmica para evitar la desecación de la córnea.
- Retenga los ratones en posición supina sobre una mesa pequeña.
- Colonoscopia
- Insertar el espacio (diámetro 1,9 mm, longitud 10 cm) en el tracto intestinal a través del ano y cuidadosamente insuflar aire bajo control visual para distender el colon. No inflar más aire de lo necesario para el examen.
NOTA: Para la insuflación de aire, se puede usar la bomba de aire anti-niebla del sistema de colonoscopia. Si no hay bomba de aire antiniebla disponible, se puede usar cualquier otra bomba de aire con ajustes de presión muy baja, o preAire ssurized con una válvula de reducción de presión delicado. El dióxido de carbono (CO 2 ) conduce fácilmente a la acidosis en roedores pequeños y debe ser evitado. - Cuidadosamente empuje el alcance hacia adelante hasta que una lesión mucosa en el colon distal puede ser identificado ( Figura 1A - 1D ).
- Guarde las imágenes endoscópicas para una evaluación posterior. Se ha descrito anteriormente un sistema de puntuación endoscópica para tumores intraluminales. 20
- Retire con cuidado el alcance y coloque el ratón sobre la almohadilla calentadora ajustada a 38 ° C hasta que se haya recuperado completamente de la anestesia.
- Insertar el espacio (diámetro 1,9 mm, longitud 10 cm) en el tracto intestinal a través del ano y cuidadosamente insuflar aire bajo control visual para distender el colon. No inflar más aire de lo necesario para el examen.
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Representative Results
Si se realiza adecuadamente,> 85% de los animales desarrollan tumores. La mortalidad del procedimiento quirúrgico aquí presentado es <5%, la mortalidad de la colonoscopia es prácticamente inexistente. En la mayoría de los ratones, se detecta una sola lesión; En aproximadamente el 30% se pueden detectar 2 - 3 adenomas pequeños que usualmente se fusionan a un solo tumor dentro de 2 a 3 semanas después de la inducción del tumor.
El fenotipo y el comportamiento biológico de los tumores resultantes depende en gran medida de las mutaciones condicionales de los animales. El nocaut local cre-mediado de Apc es suficiente para inducir tumorigenesis y conduce inicialmente al adenoma, que se puede detectar 2 - 4 semanas después de la infección adenoviral y que progresa al adenocarcinoma invasor en el plazo de 12 - 16 semanas. Este proceso se puede acelerar añadiendo una mutación Kras oncogénica condicional (Kras G12D), los tumores resultantes progresan rápidamente a invasivosAdenocarcinoma. Tras la adición de Tc53 R172H oncogénico los tumores progresan rápidamente a carcinoma invasivo y metastásico. La supervivencia depende en gran medida del genotipo de los tumores; La mediana de supervivencia es usualmente de 80 a 200 días después de la inducción tumoral. La causa de la muerte en la gran mayoría de los casos es la obstrucción del intestino grueso secundaria al crecimiento tumoral.
Los tumores se pueden monitorizar fácilmente y repetidamente mediante colonoscopia ( Figura 1 ) sin mayor estrés para los animales.
Las manifestaciones de la enfermedad son muy similares a la CRC humana. Los animales desarrollan adenomas y finalmente adenocarcinomas del colon distal ( Figuras 2B, 2C, 2F ). Dependiendo del genotipo condicional de los ratones, los tumores también metastatizan al peritoneo ( Figura 2D ) los hígados ( Figura 2E ) y raros Los pulmones (no se muestra). Si se utiliza un alelo de reportero cre ( por ejemplo , ZSGreen 19 ), todas las manifestaciones tumorales pueden ser fácilmente identificadas. El alelo reportero ZSGreen presenta una expresión de proteína fluorescente lo suficientemente brillante como para ser visible a la luz del día ( Figura 1B , Figura 2C ).
Histológicamente, el 95% de los tumores en desarrollo son adenocarcinomas. Alrededor del 5% de los tumores son de origen mesenquimal, por ejemplo , fibrosarcoma o leiomiosarcoma, presumiblemente desarrollándose a partir de células estromales que han sido accidentalmente infectadas con adenovirus. La histomorfología de los adenocarcinomas se asemeja a CRC humanos, con todo el espectro de adenoma no invasivo a adenocarcinoma invadiendo las estructuras circundantes ( Figura 3A-3C ).
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Figura 1. Imágenes colonoscópicas de tumores colorrectales (alelos condicionales del animal dado en brackets).
A. Colon distal normal. B. Adenoma temprano 2 semanas después de la infección adeno-cre. Observe el color verde debido a un alelo reportero GFP en este ratón. (Apc tm2Rak , Kras tm4Tyj , Gt (ROSA) 26Sor tm6 (CAG-ZsGreen1) Hze ). C. Adenoma tardío (Apc tm2Rak , Kras tm4Tyj ). D. El adenocarcinoma colorrectal (diagnosticado por patología después de la colonoscopia se obtuvieron imágenes: Apc tm2Rak , Kras tm4Tyj , Tp53 tm2Tyj ). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Figura 2. A. Situs intraoperatorio . Tenga en cuenta el clip grande de Fogarty de goma en la parte inferior y el tubo insertado transanalmente para la inyección adeno-cre (flecha roja). B. Tumor colorrectal (flecha blanca) con obstrucción consecutiva del intestino grueso 8 semanas después de la infección adeno-cre (Apc tm2Rak , Kras tm4Tyj , Tp53 tm2Tyj ). C. Tumor colorrectal (flecha blanca) 10 semanas después de la infección adeno-cre (Apc tm2Rak , Kras tm4Tyj , Gt (ROSA) 26So tm6 (CAG-ZsGreen1) Hze ). Obsérvese el color verdoso debido a un alelo reportero de proteína fluorescente verde (GFP) en este ratón. D. Carcinosis peritoneal (flechas negras) en el GEMM (Apc tm2Rak , Kras tm4Tyj , Tp53 tm2Tyj ). El hígado y el intestino se han eliminado para exponer los riñones y el diafragma. E. Metástasis hepática bruta en el GEMM 12 semanas después del adenovirus en(Apc tm2Rak , Kras tm4Tyj ). F. Colón con tumor después de la separación del animal representado en la Figura 2C . Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3. Secciones teñidas de hematoxilina / eosina (H / E) de tumores colorrectales del GEMM.
A. Zona transicional desde la mucosa normal hasta el adenocarcinoma con infiltración de mucosa, submucosa y muscularis mucosae (Apc tm2Rak , Kras tm4Tyj ). B. Zona transicional de la mucosa colónica normal al adenocarcinoma invasivo (Apc tm2Rak , Kras tm4Tyj ). C. Adenocarcinoma de alto grado con infiltración de tejido circundante (Apc tm2Rak, Kras tm4Tyj , Tp53 tm2Tyj ). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Mientras que son generalmente fáciles de generar y de mantener, los modelos clásicos del ratón del CRC basados en la inyección de la línea celular son artificiales y no pueden recapitulate completamente la enfermedad humana. Como consecuencia, se han desarrollado GEMMs. El primer CRC GEMM fue el ratón Apc Min , que alberga una mutación nula heterocigótica en el gen Apc, por lo tanto imitando la enfermedad hereditaria humana poliposis adenomatosa familiar (FAP). Sin embargo, los ratones Apc Min desarrollan invariablemente múltiples adenomas intestinales no limitados al colon; Además, el tiempo y la localización exacta de la formación de adenomas es aleatoria y los tumores rara vez se convierten en lesiones malignas cuando el ratón muere de carga benigna de tumor antes de que los adenomas puedan progresar. Por lo tanto, el ratón Apc Min es un modelo de FAP, no esporádico CRC. Otros modelos presentan mutaciones en los genes de reparación del desajuste del ADN. 22 , 23 Aunque algunos de estosLos ratones son excelentes modelos para el cáncer gastrointestinal hereditario, que no representan el cáncer colorrectal esporádico.
Aparte de la alteración genética subyacente es la localización de la lesión genética que distingue modelos de cáncer colorrectal esporádico y sindrómico. Todos los modelos mencionados anteriormente presentan mutaciones que son constitutivamente activas o inducidas en todo el colon o incluso en todo el tracto gastrointestinal. Esto resulta en la formación de adenomas múltiples, que no son representativos de la CRC esporádica humana, difícilmente se puede evaluar por colonoscopia y, además, por lo general no deja a los tumores suficiente tiempo para desarrollarse antes de que el animal sucumba a la extensa carga tumoral. Por lo tanto, un modelo de ratón para el cáncer colorrectal esporádico debe incorporar la activación local de la tumorigénesis colorrectal.
Los tumores que surgen en el GEMM aquí presentado están estrictamente confinados al segmento sujetado quirúrgicamente y adeno-cre-infectadoDel colon. Esto da como resultado la formación de un único tumor que es fácilmente accesible a la detección y vigilancia por colonoscopia. Además, la localización distal hace que la obstrucción intestinal sea una complicación tardía del crecimiento tumoral, permitiendo que los tumores se conviertan en invasivos y, dependiendo del genotipo, carcinoma metastásico antes de que el animal requiera eutanasia. Otra ventaja de la infección segmental cre es el medio ambiente no afectado. Mientras que en Apc Min y otros modelos de ratón hereditario, la mucosa circundante e incluso las células estromales sufren las mismas aberraciones genéticas que los tumores, los tumores en el modelo aquí propuesto se desarrollan dentro del epitelio colónico normal y estroma. Esto permite una interacción tumoral-huésped más realista y estudios moleculares sin restricciones. Además, el tiempo de inducción tumoral está bien definido en este modelo. Mientras que en el ratón Apc Min , los tumores se desarrollan después del "segundo golpe", durante el cual el segundo alelo Apc es stochastTodas las mutaciones deseadas se activan simultáneamente en el modelo aquí descrito, permitiendo así estudios de lesiones muy tempranas o biopsias consecutivas de una manera muy definida.
Sin embargo, este modelo también viene con limitaciones. El cruce de alelos múltiples en un modelo requiere tiempo y recursos tremendos; Además, a menudo no todos los descendientes pueden ser utilizados para los experimentos debido a un genotipo inadecuado. El procedimiento requiere práctica y requiere mucho tiempo. La producción de suspensión de virus adeno-cre con títulos suficientemente altos y en grandes cantidades es costosa. Por lo tanto, este modelo no es adecuado para reemplazar todos los otros modelos de ratón CRC y se limitará a los laboratorios con un enfoque distinto en los modelos GEM.
El protocolo en sí mismo es técnicamente exigente, sin embargo, con algún entrenamiento personal no quirúrgico puede realizar los procedimientos adecuadamente. El paso crítico durante la adeno-creLa infección es la inflamación del segmento del intestino sujeto - exceso de presión intraluminal conduce a la perforación, la presión insuficiente reduce la tasa de infección con éxito. Este paso requiere entrenamiento.
Un protocolo para la infección adenoviral del colon distal ha sido publicado por Hung et al. antes de. 13 El protocolo aquí presentado difiere del mencionado protocolo en varios aspectos clave. Como frecuentemente causa perforación intestinal en manos inexpertas, la abrasión mecánica de la mucosa antes de la incubación de adeno-crema se omite en el presente protocolo. Esto da como resultado una tasa reducida de formación de tumores, la cual sin embargo puede ser contrarrestada por títulos incrementados de virus. De esta manera, la tasa de tumores mesenquimales también se puede reducir como sin abrasión mucosa menos células mesenquimales dentro de la pared intestinal se exponen a adeno-cre.
Además, en contraste con el mencionado protocolo 13, el aquíDescrito no recomienda el ayuno durante la noche antes de la cirugía o la colonoscopia. En cambio, el enrojecimiento del intestino o, en caso de colonoscopia, la manipulación mecánica simple se utiliza para eliminar la materia fecal restante. Este refinamiento del protocolo mejora drásticamente el bienestar de los animales. El ayuno durante la noche es un procedimiento muy estresante para los pequeños roedores y conocido por influir fuertemente en el metabolismo murino, por lo que también influye en los resultados experimentales. 24 , 25 Estos efectos no deseados del ayuno durante la noche pueden ser evitados en el manuscrito aquí presentado.
Otra diferencia importante entre el protocolo aquí presentado y el protocolo de Hung et al. Es la longitud del segmento sujeto (y de este modo infectado). Aunque el protocolo aquí descrito recomienda una longitud corta (~ 3 mm), Hung et al. Recomiendan 20 mm del colon distal para ser infectado. Se ha elegido la longitud de segmento más corta para reducir el númeroDe criptas recombinadas y por lo tanto tumores resultantes. Como la mayoría de los pacientes con CRC esporádica desarrollan un único tumor en lugar de múltiples tumores, esta medida aumenta la relevancia clínica del modelo. La tasa de formación de tumores no parece afectada por la superficie reducida de colon infectado.
Las aplicaciones futuras de esta técnica incluyen todos los protocolos que requieren recombinación local en la mucosa del colon. La mayoría de las aplicaciones en la investigación del cáncer incluirán oncogenes condicionales, dando lugar a la formación de tumores colorrectales; Sin embargo, todas las otras aplicaciones tales como la inducción de construcciones informadoras dentro de la mucosa del colon pueden lograrse también con el protocolo aquí presentado.
En conclusión, la combinación aquí presentada de un modelo de ratón altamente sofisticado manipulado genéticamente de cáncer colorrectal junto con la opción de colonoscopia de alta resolución para la detección y vigilancia de los tumores en desarrollo proporcionanS un excelente escenario para estudiar la biología y el tratamiento de la CRC.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Este trabajo está dedicado a la memoria del profesor Moritz Koch.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents / consumables | |||
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline | Life Technologies GmbH | 14190169 | |
| Trypsin-EDTA (0.25%, Phenol-Red) | Life Technologies GmbH | 25200072 | |
| Normal saline 0.9% (E154) | Serumwerk Bernburg AG | 10013 | |
| Aqua ad injectabilia | B. Braun Melsungen AG | 235144 | |
| Ad5CMV-Cre (adenovirus, c = 2E+11 PFU/mL) | Gene Transfer Vector Core University of Iowa |
||
| 15 mL, 50 mL centrifuge tubes | Greiner Bio-One GmbH | 188271/227270 | |
| Eppendorf tubes 1.5 mL/ 2 mL | Sarstedt AG & Co. | 72,695,400 | |
| Petri dish PS 100/15 mm (sterile, Nuclon) | Fisher Scientific GmbH | 10508921/ NUNC150350 | |
| 1 mL Syringe (without dead volume) - Injekt-F SOLO | Braun/neoLab | 194291661 | |
| 30G injection needle | BECTON DICKINSON | 304000 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Analgesia / anesthesia | |||
| Sevoflurane (Sevoflurane AbbVie) | AbbVie Germany GmbH & Co. KG | - | |
| Medical oxygen | Air Liquide Medical GmbH | - | |
| Buprenorphine (Temgesic) | Indivior Eu Ltd. | - | |
| Bepanthen - ophthalmic ointment | Bayer Vital GmbH | 10047757 | |
| Table Top Research Anesthesia Machine x/O2 Flush w/ Sevoflurane Vaporizer | Parkland Scientific | V3000PS/PK | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Surgical Equipment | |||
| Cellulose swabs | Lohmann & Rauscher Deutschland | 13356 | |
| Insulin syringe EMG 1 mL (with 30G cannula) | B. Braun Melsungen AG | 9161627S | |
| Fine Bore Tubing (bore: 0.28 mm/ diameter: 0.61mm) | Smiths Medical Deutschland | 800/100/100 | |
| Micro-Adson Forceps | Fine Science Tools | 11018-12 | |
| Iris Scissor - ToughCut | Fine Science Tools | 14058-11 | |
| Olsen-Hegar Needle Holder | Fine Science Tools | 12002-12 | |
| AutoClip Kit | Fine Science Tools | 12020-00 | |
| PDS Z1012H 6/0 C1 (surgical suture) | Johnson & Johnson Medical GmbH | Z1012H | |
| Curved Micro Serrefine Vascular Clamp | Fine Science Tools | 18055-05 | |
| Fogarty Spring Clips | Edwards | CDSAFE 6 | |
| Hot Plate 062 | Labotect | 13854 | |
| Isis - Hair shaver | Aesculap - Braun | - | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Colonoscopy | |||
| Cold Light Fountain XENON 175 SCB | Karl Storz | 20132101-1 | Karl Storz Coloview System Mainz |
| Fiber Optic Light Cable | Karl Storz | 69495NL | Karl Storz Coloview System Mainz |
| TRICAM Three-Chip Camera Head | Karl Storz | 20221030 | Karl Storz Coloview System Mainz |
| TRICAM SLII Camera Control Unit | Karl Storz | 20223011-1 | Karl Storz Coloview System Mainz |
| 15" Flat Screen Monitor EndoVue | Karl Storz | 9415NN | Karl Storz Coloview System Mainz |
| HOPKINS Straight Forward Telescope diameter 1.9 mm; length 10 cm autoclavable fiber optic light transmission incorporated |
Karl Storz | 64301AA | |
| Protection and Examination Sheath | Karl Storz | 61029C |
References
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