Aislamiento de las células dendríticas del tracto reproductivo femenino humano estudios fenotípica y funcional
Summary
Aquí describimos un método para aislar y purificar las células dendríticas de diferentes compartimentos anatómicos en el tracto reproductor femenino humano para la evaluación de sus características fenotípicas y funcionales. Este método puede adaptarse para aislar a otras células inmunes o las células dendríticas de otros tejidos de la mucosa.
Abstract
La caracterización de las humanos las células dendríticas (DCs) residentes en los tejidos de la mucosa es un reto debido a la dificultad en la obtención de muestras, y el bajo número de DCs presenta por tejido. Sin embargo, el fenotipo y la función de DCs es modificada por el ambiente del tejido, es necesario analizar poblaciones residentes de DC de tejidos, como sangre había derivada DCs incompleto reflejar las complejidades de la DCs en los tejidos. Aquí presentamos un protocolo para aislar DCs del humano aparato reproductor femenino (FRT) utilizando a especímenes de la histerectomia que permite el análisis fenotípicas y funcionales. El protocolo consiste en la digestión del tejido para generar una célula mixta de suspensión celular, seguido por la selección de grano magnético positivo. Nuestro protocolo de digestión de tejido no hienden marcadores de superficie, que permite el análisis fenotípico y funcional de DCs en el estado estacionario, sin activación de incubación o de la célula durante la noche. Este protocolo puede ser adaptado para el aislamiento de otros tipos de células inmunes o aislamiento de DCs de otros tejidos.
Introduction
El FRT tiene la doble función de proteger contra patógenos permitiendo la implantación y el embarazo1. Para lograr esto, el FRT está compartimentado, con cada región anatómica mostrando características histológicas, inmunológicas y funcionales1.
DCs presentes en superficies de la mucosa que en contacto con microbios en el pulmón, el intestino y el tracto genital y vigilancia inmune por patógenos potenciales2. DCs tienen la capacidad única de primer ingenuo t-células y desencadenar respuestas inmunitarias adaptativa3. DCs en la FRT se especializan también tolerar antígenos extraños, como los que se encuentran en los espermatozoides y el desarrollo del feto, para permitir el embarazo acertado4. Por lo tanto, dependiendo de la ubicación, el fenotipo de la DC y la función va ser distintos. Es conocido que los DCs están fuertemente influenciadas por el ambiente del tejido, tal que su número, fenotipo y funciones son modificadas por el ambiente de tejidos en que residen3. Por lo tanto, para entender el papel que en las enfermedades infecciosas, embarazo y cáncer en la FRT FRT DCs, residente DCs necesitan ser estudiados, desde sangre derivada DC modelos son insuficientes para abordar las complejidades reglamentarias encontradas los tejidos de la FRT.
La caracterización de tejido humano DCs residente es difícil debido al bajo número de células presentes en los tejidos de la mucosa y la dificultad de obtener muestras de tejido humano. DCs se han estudiado en la FRT usando immunohistochemistry5,6, que informa sobre la ubicación del celular dentro del tejido, pero excluye los estudios funcionales y está limitada en el número de identificación de marcadores celulares que pueden analizarse a la vez. Por otra parte, los protocolos de aislamiento de célula para análisis cytometric del flujo han sido desarrollados7,8,9. Algunos de estos protocolos, aprovechando la capacidad migratoria de DCs para aislar las células que migran. Estos métodos generalmente requieren incubaciones durante la noche y la selección de DCs activados, pero no permiten el estudio de DCs en el estado estacionario.
Aquí, usando especímenes de la histerectomia, optimizado un protocolo para aislar DCs de diferentes sitios anatómicos en la FRT, el endometrio (EM), el endocervix (CX) y el ectocérvix (ECX), que permite el análisis fenotípicas y funcionales. Utiliza un protocolo no proteolytic digestión enzimática, podemos proceder inmediatamente después de la digestión de tejido a células aislamiento y flujo cytometric caracterización sin activación de la célula. Mediante citometría de flujo multicolor y adaptación de estudios funcionales de bajo número de células, podemos identificar y caracterizar los subconjuntos raros de DCs en los diferentes sitios de la FRT.
Protocol
Representative Results
Discussion
Mucosa DCs son una población celular raro fuertemente influenciada por el ambiente del tejido, que cambia su fenotipo y la función una vez que entran en los tejidos3. Mientras que deriva la sangre DCs son un modelo muy útil, no representan completamente la diversidad de poblaciones de DC en los tejidos. Por lo tanto, para entender las características únicas de mucosa DCs, aislamiento de células primarias de los tejidos es necesario. Aislamiento de DCs de diferentes sitios anatómicos en la F…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Becas de estudio apoyado por los NIH AI102838 y AI117739 (CRW). Agradecemos a Richard Rossoll para asistencia técnica. Análisis cytometric del flujo se llevó a cabo en DartLab, el recurso compartido Dartmouthsupported por (P30CA023108-37) y (P30GM103415-15).
Materials
| Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) | Hyclone | SH30015.03 | |
| Penicillin-streptomycin | Hyclone | SV30010 | |
| HEPES (1M) | Hyclone | 15630-080 | |
| Collagenase IV | Sigma | C5138 | |
| Deoxyribonuclease I | Worthington Biochemical | LS002140 | |
| D-glucose | Sigma Aldritch | 50-99-7 | |
| 0.22 um Stericup 500 mL filter | Millipore | SCGPU05RE | |
| 100mm x 15mm polystyrene petri dish | Fisherbrand | FB0875712 | |
| 150mm x 15mm polystyrene petri dish | Fisherbrand | FB0875714 | |
| 150mm x 25mm polystyrene dish | Corning | 430599 | Treated cell culture dish |
| Isotemp Incubator | Fisher Scientific | FICO3500TABB | 5.0% CO2 |
| American Rotator V | American DADE | R4140 | |
| 250 um nylon mesh | Sefar | 03-250/50 | |
| 20 um nylon mesh | Sefar | 03-20/14 | |
| Beckman GS-6R Centrifuge | Beckman | 358702 | |
| X-VIVO 15 with Gentamicin L-Gln, Phenol Red, 1 L | Lonza | 04-418Q | |
| Human AB Serum | Valley Biomedical | HP1022 | |
| Histopaque-1077 | Sigma Aldritch | 10771 | |
| Phosphate Buffer Solution (PBS) | National Diagnostics | CL-253 | pH 7.4 |
| Dead Cell Removal Kit | Miltenyi Biotec | 130-090-101 | |
| Pre-separation filter (30um) | Miltenyi Biotec | 130-041-407 | |
| LS column | Miltenyi Biotec | 130-042-410 | |
| Quadro MACS Separator | Miltenyi Biotec | 130-090-976 | |
| MACS multi-stand | Miltenyi Biotec | 130-042-303 | |
| EDTA | USB | 15694 | |
| CD1a Microbeads, human | Miltenyi Biotec | 130-051-001 | |
| CD14 Microbeads, human | Miltenyi Biotec | 130-050-201 | |
| eFluor 670 cell proliferation dye | eBiosciences | 65-0840-85 | |
| 96 well round bottom plate | Falcon | 9/8/2866 | |
| Zombie yellow viability dye | Biolegend | 423104 | |
| CD3 APC/Cy7, anti-human | Tonbo Biosciences | 25-0038-T100 | |
| CD4 PE, anti-human | eBiosciences | 12-0048-42 | |
| CD8a FITC, anti-human | Tonbo Biosciences | 35-0086-T100 | |
| Gallios Flow Cytometer | Beckman Coulter Life Sciences | B43618 | 10 color, VBR |
| MACSquant Analyzer 10 | Miltenyi Biotec | 130-096-343 | 8 color, VBR |
References
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