Isolamento de células dendríticas do tracto reprodutivo feminino humano para estudos fenotípica e funcionais
Summary
Descrevemos aqui um método para isolar e purificar as células dendríticas de diferentes compartimentos anatômicas no aparelho reprodutor feminino humano para a avaliação de suas características fenotípica e funcionais. Esse método pode ser adaptado para isolar outras células do sistema imunológico ou células dendríticas de outros tecidos da mucosa.
Abstract
A caracterização das humano as células dendríticas (DCs) residentes nos tecidos da mucosa é um desafio devido à dificuldade na obtenção de amostras e o baixo número de DCs presentes por tecido. Ainda, como o fenótipo e a função de DCs é modificado pelo ambiente de tecido, é necessário analisar as populações residentes de tecido DC, desde sangue derivado DCs incompleta refletem as complexidades de DCs em tecidos. Aqui nós apresentamos um protocolo para isolar DCs de humano feminino trato reprodutivo (FRT) usando amostras de histerectomia que permite análise fenotípica e funcional. O protocolo é composto por digestão do tecido para gerar uma única célula misturado a suspensão de células, seguido pela seleção de grânulo magnética positiva. Nosso protocolo de digestão do tecido não cleave marcadores de superfície, que permite a análise fenotípica e funcional de DCs no estado estacionário, sem ativação de incubação ou celular durante a noite. Este protocolo pode ser adaptado para o isolamento de outros tipos de células imunes ou isolamento de DCs de outros tecidos.
Introduction
A FRT tem a dupla função de proteger contra patógenos, permitindo a implantação e gravidez1. Para realizar isto, a FRT é compartimentada, com cada região anatômica, mostrando características histológicas, imunológicas e funcional1.
DCs presentes em superfícies mucosas fazem contato com micróbios no pulmão, intestino e do trato genital e fornecer vigilância imune para potenciais patógenos2. DCs têm a capacidade única de prime ingênuo células T e desencadear respostas imunes adaptáveis3. DCs no FRT também são especializados para tolerar a antígenos estranhos, tais como aqueles encontrados no esperma e o desenvolvimento do feto, para permitir que a gravidez bem sucedida4. Portanto, dependendo da localização, o fenótipo de DC e a função será distintos. É conhecido que DCs são fortemente influenciados pelo ambiente de tecido, tal que o seu número, fenótipo e funções são modificadas pelo ambiente de tecido em que residem3. Portanto, para entender o papel que FRT DCs desempenham na gravidez, doenças infecciosas e câncer no FRT, DCs residentes precisam ser estudados, desde sangue derivada DC modelos são insuficientes para resolver as complexidades regulamentares encontradas em tecidos FRT.
A caracterização do tecido humano residentes DCs é um desafio devido ao baixo número de células presentes nos tecidos da mucosa e a dificuldade de obtenção de amostras de tecido humano. DCs têm sido estudadas no FRT usando immunohistochemistry5,6, que informa sobre a localização da célula dentro do tecido, mas se opõe a estudos funcionais e é limitado o número de identificação de marcadores de células que podem ser analisados ao mesmo tempo. Além disso, os protocolos de isolamento única célula para análise de fluxo cytometric foram desenvolvidos7,8,9. Alguns desses protocolos tirar proveito da capacidade migratória do DCs para isolar as células que migram. Esses métodos normalmente exigem a incubação do durante a noite e seleção de DCs ativados, mas não permitem o estudo da DCs no estado estacionário.
Aqui, usando amostras de histerectomia, nós aperfeiçoamos um protocolo para isolar DCs em locais anatômicos diferentes no FRT, o endométrio (EM), a endocérvice (CX) e a ectocérvice (ECX), que permite a análise fenotípica e funcional. Usando um protocolo não-proteolíticas digestão enzimática, podemos prosseguir imediatamente após a digestão do tecido celular isolamento e fluxo cytometric uma caracterização sem ativação de células. Utilizando citometria de fluxo multicolor e adaptação de estudos funcionais para baixo número de células, nós podemos identificar e caracterizar raros subconjuntos de DCs em diferentes locais do Frist
Protocol
Representative Results
Discussion
DCs da mucosa são uma população de células raras fortemente influenciada pelo ambiente de tecido, que muda seu fenótipo e a função, uma vez que eles entram os tecidos3. Enquanto o sangue derivado DCs são um modelo muito útil, totalmente não representam a diversidade de populações de DC, encontrado em tecidos. Portanto, para entender as características únicas do DCs da mucosa, o isolamento de células primárias de tecidos é necessário. Isolamento de DCs em locais anatômicos difere…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bolsas de estudo suportado pelo NIH, AI102838 e AI117739 (CRW). Agradecemos a Richard Rossoll para obter assistência técnica. Análise de fluxo cytometric foi realizado em DartLab, o recurso compartilhado no Dartmouthsupported por (P30CA023108-37) e (P30GM103415-15).
Materials
| Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) | Hyclone | SH30015.03 | |
| Penicillin-streptomycin | Hyclone | SV30010 | |
| HEPES (1M) | Hyclone | 15630-080 | |
| Collagenase IV | Sigma | C5138 | |
| Deoxyribonuclease I | Worthington Biochemical | LS002140 | |
| D-glucose | Sigma Aldritch | 50-99-7 | |
| 0.22 um Stericup 500 mL filter | Millipore | SCGPU05RE | |
| 100mm x 15mm polystyrene petri dish | Fisherbrand | FB0875712 | |
| 150mm x 15mm polystyrene petri dish | Fisherbrand | FB0875714 | |
| 150mm x 25mm polystyrene dish | Corning | 430599 | Treated cell culture dish |
| Isotemp Incubator | Fisher Scientific | FICO3500TABB | 5.0% CO2 |
| American Rotator V | American DADE | R4140 | |
| 250 um nylon mesh | Sefar | 03-250/50 | |
| 20 um nylon mesh | Sefar | 03-20/14 | |
| Beckman GS-6R Centrifuge | Beckman | 358702 | |
| X-VIVO 15 with Gentamicin L-Gln, Phenol Red, 1 L | Lonza | 04-418Q | |
| Human AB Serum | Valley Biomedical | HP1022 | |
| Histopaque-1077 | Sigma Aldritch | 10771 | |
| Phosphate Buffer Solution (PBS) | National Diagnostics | CL-253 | pH 7.4 |
| Dead Cell Removal Kit | Miltenyi Biotec | 130-090-101 | |
| Pre-separation filter (30um) | Miltenyi Biotec | 130-041-407 | |
| LS column | Miltenyi Biotec | 130-042-410 | |
| Quadro MACS Separator | Miltenyi Biotec | 130-090-976 | |
| MACS multi-stand | Miltenyi Biotec | 130-042-303 | |
| EDTA | USB | 15694 | |
| CD1a Microbeads, human | Miltenyi Biotec | 130-051-001 | |
| CD14 Microbeads, human | Miltenyi Biotec | 130-050-201 | |
| eFluor 670 cell proliferation dye | eBiosciences | 65-0840-85 | |
| 96 well round bottom plate | Falcon | 9/8/2866 | |
| Zombie yellow viability dye | Biolegend | 423104 | |
| CD3 APC/Cy7, anti-human | Tonbo Biosciences | 25-0038-T100 | |
| CD4 PE, anti-human | eBiosciences | 12-0048-42 | |
| CD8a FITC, anti-human | Tonbo Biosciences | 35-0086-T100 | |
| Gallios Flow Cytometer | Beckman Coulter Life Sciences | B43618 | 10 color, VBR |
| MACSquant Analyzer 10 | Miltenyi Biotec | 130-096-343 | 8 color, VBR |
References
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