Isolement de cellules dendritiques de l’appareil reproducteur féminin humain pour des études phénotypiques et fonctionnelles
Summary
Nous décrivons ici une méthode pour isoler et purifier les cellules dendritiques de différents compartiments anatomiques dans le tractus reproducteur femelle humain pour l’évaluation de leurs caractéristiques phénotypiques et fonctionnelles. Cette méthode peut être adaptée pour isoler des autres cellules immunitaires ou autres tissus muqueux, les cellules dendritiques.
Abstract
Il est difficile en raison de la difficulté à obtenir des échantillons de la caractérisation des cellules dendritiques humaines (DCs) résidents dans les tissus muqueux, et le faible nombre de DCs présents par tissu. Pourtant, que le phénotype et la fonction des contrôleurs de domaine n’est modifiée par l’environnement tissulaire, il est nécessaire d’analyser les populations résidentes de DC tissu, puisque le sang provenant DCs incomplètement refléter les complexités des contrôleurs de domaine dans les tissus. Nous présentons ici un protocole visant à isoler les contrôleurs de domaine de l’humain appareil reproducteur féminin (FRT) à l’aide de spécimens de l’hystérectomie qui permet des analyses phénotypiques et fonctionnelles. Le protocole se compose de digestion de tissu pour générer une seule cellule mixé suspension cellulaire, suivie par la sélection des billes magnétiques positifs. Notre protocole de digestion du tissu ne pas se fendent de marqueurs de surface, ce qui permet une analyse phénotypique et fonctionnelle des contrôleurs de domaine dans l’état d’équilibre, sans une nuit d’incubation ou cellule d’activation. Ce protocole peut être adapté pour l’isolement des autres types de cellules immunitaires ou l’isolement des contrôleurs de domaine provenant d’autres tissus.
Introduction
La DRF a la double fonction de protection contre les agents pathogènes tout en permettant l’implantation et la grossesse1. Pour ce faire, le TRAF est compartimenté, avec chaque région anatomique affiche des caractéristiques histologiques, immunologiques et fonctionnelle unique1.
DCs présents à surfaces muqueuses prendre contact avec les microbes dans les poumons, le tube digestif et l’appareil génital et assurer la surveillance immunitaire d’éventuels agents pathogènes2. Contrôleurs de domaine ont la capacité unique apprêter naïf T-cellules et de déclencher des réponses immunes adaptatives3. Contrôleurs de domaine dans le TRAF sont également spécialisés pour tolérer les antigènes étrangers, comme ceux que l’on trouve dans le sperme et le développement du fœtus, pour permettre une grossesse réussie4. Par conséquent, selon l’emplacement, le phénotype DC et la fonction seront dérouleront séparément. On sait que DCs sont fortement influencées par l’environnement tissulaire, telle que leur nombre, leur phénotype et fonctions sont modifiées par l’environnement tissulaire dans lequel ils résident3. Par conséquent, pour comprendre le rôle que jouent les FRT DCs en maladies infectieuses, la grossesse et le cancer dans le TRAF, DCs résidents doivent être étudiés, depuis le sang dérivées des modèles cc ne suffisent pas à résoudre les complexités réglementaires trouvées dans les tissus FRT.
La caractérisation des tissus humains DCs résidents est difficile en raison du faible nombre de cellules présentes dans les tissus muqueux et de la difficulté à obtenir des échantillons de tissus humains. Contrôleurs de domaine ont été étudiés dans le TRAF utilisant immunohistochimie5,6, qui renseigne sur l’emplacement de cellules dans les tissus, mais s’oppose à des études fonctionnelles et est limité dans le numéro d’identification de marqueurs de cellules qui peuvent être analysés Tout de suite. Par ailleurs, des protocoles d’isolement cellulaire unique pour cytométrie ont été développés7,8,9. Certains de ces protocoles tirer parti de la capacité migratoire de DCs pour isoler ces cellules qui migrent. Ces méthodes généralement nécessitent des incubations durant la nuit et sélection de DCs activés, mais ne permettent pas pour l’étude des contrôleurs de domaine à l’état stationnaire.
Ici, à l’aide de spécimens de l’hystérectomie, nous avons optimisé un protocole visant à isoler les contrôleurs de domaine de différents sites anatomiques de la FRT, l’endomètre (EM), l’endocol (CX) et l’exocol (ECX), qui permet des analyses phénotypiques et fonctionnelles. En utilisant un protocole non protéolytiques digestion enzymatique, nous pouvons procéder immédiatement après digestion de tissu à la caractérisation des cellule d’isolement et de flux par cytométrie en flux sans activation de la cellule. Cytométrie multicolore et en adaptant des études fonctionnelles pour les faibles nombres de cellules, nous pouvons identifier et caractériser les sous-ensembles rares de contrôleurs de domaine dans les différents sites de la FRT.
Protocol
Representative Results
Discussion
DCs muqueuses sont une population de cellules rares fortement influencée par l’environnement tissulaire, qui change leur phénotype et leurs fonctions une fois qu’ils pénètrent dans les tissus3. Bien que dérivé du sang DCs sont un modèle très utile, ils ne représentent pas complètement la diversité des populations de DC trouvé dans les tissus. Pour comprendre les caractéristiques uniques de muqueuses DCs, isolement de cellules primaires des tissus est donc nécessaire. Isolement de…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
AI102838 et AI117739 (CRW) bourses d’études appuyé par les NIH. Nous remercions Richard Rossoll d’assistance technique. Analyse en cytométrie en flux a été réalisée en DartLab, la ressource partagée au Dartmouthsupported de (P30CA023108-37) et (P30GM103415-15).
Materials
| Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) | Hyclone | SH30015.03 | |
| Penicillin-streptomycin | Hyclone | SV30010 | |
| HEPES (1M) | Hyclone | 15630-080 | |
| Collagenase IV | Sigma | C5138 | |
| Deoxyribonuclease I | Worthington Biochemical | LS002140 | |
| D-glucose | Sigma Aldritch | 50-99-7 | |
| 0.22 um Stericup 500 mL filter | Millipore | SCGPU05RE | |
| 100mm x 15mm polystyrene petri dish | Fisherbrand | FB0875712 | |
| 150mm x 15mm polystyrene petri dish | Fisherbrand | FB0875714 | |
| 150mm x 25mm polystyrene dish | Corning | 430599 | Treated cell culture dish |
| Isotemp Incubator | Fisher Scientific | FICO3500TABB | 5.0% CO2 |
| American Rotator V | American DADE | R4140 | |
| 250 um nylon mesh | Sefar | 03-250/50 | |
| 20 um nylon mesh | Sefar | 03-20/14 | |
| Beckman GS-6R Centrifuge | Beckman | 358702 | |
| X-VIVO 15 with Gentamicin L-Gln, Phenol Red, 1 L | Lonza | 04-418Q | |
| Human AB Serum | Valley Biomedical | HP1022 | |
| Histopaque-1077 | Sigma Aldritch | 10771 | |
| Phosphate Buffer Solution (PBS) | National Diagnostics | CL-253 | pH 7.4 |
| Dead Cell Removal Kit | Miltenyi Biotec | 130-090-101 | |
| Pre-separation filter (30um) | Miltenyi Biotec | 130-041-407 | |
| LS column | Miltenyi Biotec | 130-042-410 | |
| Quadro MACS Separator | Miltenyi Biotec | 130-090-976 | |
| MACS multi-stand | Miltenyi Biotec | 130-042-303 | |
| EDTA | USB | 15694 | |
| CD1a Microbeads, human | Miltenyi Biotec | 130-051-001 | |
| CD14 Microbeads, human | Miltenyi Biotec | 130-050-201 | |
| eFluor 670 cell proliferation dye | eBiosciences | 65-0840-85 | |
| 96 well round bottom plate | Falcon | 9/8/2866 | |
| Zombie yellow viability dye | Biolegend | 423104 | |
| CD3 APC/Cy7, anti-human | Tonbo Biosciences | 25-0038-T100 | |
| CD4 PE, anti-human | eBiosciences | 12-0048-42 | |
| CD8a FITC, anti-human | Tonbo Biosciences | 35-0086-T100 | |
| Gallios Flow Cytometer | Beckman Coulter Life Sciences | B43618 | 10 color, VBR |
| MACSquant Analyzer 10 | Miltenyi Biotec | 130-096-343 | 8 color, VBR |
References
- Wira, C. R., Rodriguez-Garcia, M., Patel, M. V. The role of sex hormones in immune protection of the female reproductive tract. Nat Rev Immunol. 15 (4), 217-230 (2015).
- Banchereau, J., Steinman, R. M. Dendritic cells and the control of immunity. Nature. 392 (6673), 245-252 (1998).
- Schlitzer, A., McGovern, N., Ginhoux, F. Dendritic cells and monocyte-derived cells: Two complementary and integrated functional systems. Semin Cell Dev Biol. 41, 9-22 (2015).
- Tagliani, E., Erlebacher, A. Dendritic cell function at the maternal-fetal interface. Expert Rev Clin Immunol. 7 (5), 593-602 (2011).
- Kaldensjo, T., et al. Detection of intraepithelial and stromal Langerin and CCR5 positive cells in the human endometrium: potential targets for HIV infection. PLoS One. 6 (6), e21344 (2011).
- Schulke, L., Manconi, F., Markham, R., Fraser, I. S. Endometrial dendritic cell populations during the normal menstrual cycle. Hum Reprod. 23 (7), 1574-1580 (2008).
- Ballweber, L., et al. Vaginal langerhans cells nonproductively transporting HIV-1 mediate infection of T cells. J Virol. 85 (24), 13443-13447 (2011).
- Hladik, F., et al. Initial events in establishing vaginal entry and infection by human immunodeficiency virus type-1. Immunity. 26 (2), 257-270 (2007).
- Duluc, D., et al. Functional diversity of human vaginal APC subsets in directing T-cell responses. Mucosal Immunol. 6 (3), 626-638 (2013).
- Herzenberg, L. A., Tung, J., Moore, W. A., Parks, D. R. Interpreting flow cytometry data: a guide for the perplexed. Nat Immunol. 7 (7), 681-685 (2006).
- Juno, J. A., Boily-Larouche, G., Lajoie, J., Fowke, K. R. Collection, isolation, and flow cytometric analysis of human endocervical samples. J Vis Exp. (89), (2014).
- Givan, A. L., et al. Flow cytometric analysis of leukocytes in the human female reproductive tract: comparison of fallopian tube, uterus, cervix, and vagina. Am J Reprod Immunol. 38 (5), 350-359 (1997).
- Rodriguez-Garcia, M., et al. Dendritic cells from the human female reproductive tract rapidly capture and respond to HIV. Mucosal Immunol. 10 (2), 531-544 (2017).
- Rodriguez-Garcia, M., Barr, F. D., Crist, S. G., Fahey, J. V., Wira, C. R. Phenotype and susceptibility to HIV infection of CD4+ Th17 cells in the human female reproductive tract. Mucosal Immunol. 7 (6), 1375-1385 (2014).
- Shen, Z., Rodriguez-Garcia, M., Ochsenbauer, C., Wira, C. R. Characterization of immune cells and infection by HIV in human ovarian tissues. Am J Reprod Immunol. , (2017).
