Summary

בידוד של תאים דנדריטים האדם באיברי הרבייה הנקביים ללימודי פנוטיפיות שהיו קיימות בעבר ופונקציונלי

Published: March 13, 2018
doi:

Summary

נתאר כאן שיטה כדי לבודד ולטהר תאים דנדריטים שונים אנטומי בתאים אנושיים באיברי הרבייה הנקביים על ההערכה של תכונות פנוטיפיות שהיו קיימות בעבר ופונקציונליים שלהם. בשיטה זו ניתן להתאים כדי לבודד תאים חיסוניים אחרים או תאים דנדריטים של רקמות הרירית אחרות.

Abstract

האפיון של האדם התאים הדנדריטים (Dc) תושב ברקמות הרירית מאתגר עקב הקושי בהשגת דגימות, המספרים נמוכים בדרור להציג לכל רקמות. ובכל זאת, כמו פנוטיפ והתפקוד של בקרי קבוצת מחשבים משתנה על ידי הסביבה רקמות, זה הכרחי לנתח אוכלוסיות DC תושב רקמות, מאז דם נגזר DCs שהיישום לשקף את המורכבות של בקרי קבוצת מחשבים ברקמות. כאן אנו מציגים פרוטוקול כדי לבודד DCs מ האדם באיברי הרבייה הנקביים (והשפלתם) באמצעות דגימות כריתת רחם המאפשרת ניתוח פנוטיפיות שהיו קיימות בעבר וגם פונקציונלי. הפרוטוקול מורכב עיכול רקמת ליצירת תא בודד מעורב תא ההשעיה, ואחריו הבחירה חרוז מגנטי חיובי. פרוטוקול מערכת העיכול שלנו רקמות לא קליב סמני פני השטח, מה שמאפשר ניתוח פנוטיפיות שהיו קיימות בעבר ופונקציונליים של בקרי קבוצת מחשבים במצב יציב, ללא הפעלה דגירה או תא לילה. פרוטוקול זה ניתן להתאים עבור בידוד של סוגי תאים חיסוניים אחרים או בידוד של בקרי קבוצת מחשבים של רקמות אחרות.

Introduction

והשפלתם יש את הפונקציה כפול של הגנה מפני פתוגנים תוך מתן אפשרות השרשה והריון1. כדי לעשות זאת, והשפלתם באופן ממודר, עם כל אזור אנטומי מציג מאפיינים ייחודיים היסטולוגית, חיסונית, פונקציונלי1.

DCs נוכח משטחים הרירית לעשות קשר עם החיידקים הריאה, הבטן, ואת מערכת איברי המין, או לספק מעקב המערכת החיסונית פתוגנים פוטנציאליים2. בקרי קבוצת מחשבים יש יכולת ייחודית פריים תמים תאי-T ו לעורר תגובות מערכת החיסון מסתגלת3. בקרי קבוצת מחשבים והשפלתם מתמחה גם לסבול אנטיגנים זרים, כגון אלה שנמצאו הזרע ואת העובר המתפתח, כדי לאפשר הריון מוצלח4. לכן, בהתאם למיקום, פנוטיפ DC פונקציה יהיו ברורים. זה ידוע DCs מושפעים מאוד הסביבה רקמות, כך מספר שלהם, פנוטיפ ופונקציות עוברות שינוי על ידי הסביבה רקמות שבו הן שוכנות3. לכן, כדי להבין את התפקיד כי והשפלתם DCs לשחק ב מחלות זיהומיות, הריון ו סרטן והשפלתם, DCs תושב צריך להילמד, מאז דם מודלים DC הנגזר אינם הולמים לטפל המורכבות רגולטורי מצאו ברקמות והשפלתם.

האפיון של רקמה אנושית DCs תושב הוא מאתגר בשל המספרים הנמוכים של תאים נוכח רקמות הרירית ואת הקושי קבלת דגימות רקמה אנושית. DCs נחקרו על והשפלתם באמצעות אימונוהיסטוכימיה5,6, אשר מודיע על המיקום תאים בתוך הרקמה, אבל מונע מחקרים פונקציונלי, מוגבל במספר זיהוי סמנים התא מסוגל לנתח בעת ובעונה אחת. יתר על כן, תא בודד בידוד פרוטוקולים עבור ניתוח תזרים cytometric כבר מפותחת7,8,9. כמה מהפרוטוקולים האלה לנצל יכולת הנדידה של בקרי קבוצת מחשבים לבודד תאים אלה זה להעביר. שיטות אלה בדרך כלל דורשים incubations לילה ומבחר DCs מופעל, אך אינם מאפשרים את המחקר של בקרי קבוצת מחשבים במצב יציב.

כאן, אנחנו באמצעות דגימות כריתת רחם, אופטימיזציה פרוטוקול כדי לבודד DCs מאתרי אנטומי שונה והשפלתם, רירית הרחם (EM), בלוטת endocervix (CX), ectocervix (ECX), המאפשרת ניתוח פנוטיפיות שהיו קיימות בעבר וגם פונקציונלי. באמצעות פרוטוקול שאינו הפרוטאוליטי עיכול אנזימטי, נוכל להתקדם מיד לאחר מערכת העיכול הרקמה תא בידוד ואת זרימת cytometric אפיון ללא הפעלה תא באמצעות cytometry זרימה ססגוניות והתאמת פונקציונלי ללימודי מספר נמוך של תאים, אנחנו יכולים לזהות ולאפיין נדיר קבוצות משנה של בקרי קבוצת מחשבים באתרים שונים של FRT.

Protocol

מחקרים שכללו ניסויים נערכו על פי עקרונות לידי ביטוי הצהרת הלסינקי. מחקרים אושרו על-ידי המכללה דארטמאות מוסדיים המנהלים והוועדה עבור ההגנה של האדם נושאים (CPHS). בכתב הסכמה מדעת הושג לפני הניתוח של HIV-שלילי בנשים שעברו hysterectomies במרכז הרפואי דארטמות-היצ’קוק (NH לבנון). פתולוגים מיומן נבחרת דגימות…

Representative Results

עיכול רקמת הבאים, שחרורו של גליונות אפיתל ובלוטות יכול להיות שנצפו, כפי שמוצג באיור 1A; זה פקד חיובי המציין שעיכול אנזימטי היה מוצלח. מספר התאים קיימא הכולל ו- DCs התאושש לגרם של רקמות מוצגים גם איור 1B , איור 1C, בהתאמה. תאים חיסו…

Discussion

DCs הרירית הם אוכלוסיה תא נדיר מאוד מושפעת הסביבה רקמות, אשר משנה פנוטיפ והתפקוד שלהם, ברגע שהם מזינים את הרקמות3. בעוד דם נגזר DCs הם מודל שימושי מאוד, הם אינם מייצגים את המגוון של אוכלוסיות DC נמצאו ברקמות באופן מלא. לכן, כדי להבין את המאפיינים הייחודיים של הרירית DCs, בידוד תאי העיק…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

המחקר נתמך על ידי NIH מעניקה AI102838 ו- AI117739 (CRW). אנו מודים Rossoll ריצ’רד לקבלת סיוע טכני. ניתוח תזרים cytometric בוצע ב DartLab, המשאב המשותף בשעה Dartmouthsupported על ידי (P30CA023108-37) ו- (P30GM103415-15).

Materials

Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) Hyclone SH30015.03
Penicillin-streptomycin Hyclone SV30010
HEPES (1M) Hyclone 15630-080
Collagenase IV Sigma C5138
Deoxyribonuclease I Worthington Biochemical LS002140
D-glucose Sigma Aldritch 50-99-7
0.22 um Stericup 500 mL  filter Millipore SCGPU05RE
100mm x 15mm polystyrene petri dish Fisherbrand FB0875712
150mm x 15mm polystyrene petri dish Fisherbrand FB0875714
150mm x 25mm polystyrene dish Corning 430599 Treated cell culture dish
Isotemp Incubator Fisher Scientific FICO3500TABB 5.0% CO2
American Rotator V American DADE R4140
250 um nylon mesh Sefar 03-250/50
20 um nylon mesh Sefar 03-20/14
Beckman GS-6R Centrifuge Beckman 358702
X-VIVO 15 with Gentamicin L-Gln, Phenol Red, 1 L Lonza 04-418Q
Human AB Serum Valley Biomedical HP1022
Histopaque-1077 Sigma Aldritch 10771
Phosphate Buffer Solution (PBS) National Diagnostics CL-253 pH 7.4
Dead Cell Removal Kit Miltenyi Biotec 130-090-101
Pre-separation filter (30um) Miltenyi Biotec 130-041-407
LS column Miltenyi Biotec 130-042-410
Quadro MACS Separator Miltenyi Biotec 130-090-976
MACS multi-stand Miltenyi Biotec 130-042-303
EDTA USB 15694
CD1a Microbeads, human Miltenyi Biotec 130-051-001
CD14 Microbeads, human Miltenyi Biotec 130-050-201
eFluor 670 cell proliferation dye eBiosciences 65-0840-85
96 well round bottom plate Falcon 9/8/2866
Zombie yellow viability dye Biolegend 423104
CD3 APC/Cy7, anti-human Tonbo Biosciences 25-0038-T100
CD4 PE, anti-human eBiosciences 12-0048-42
CD8a FITC, anti-human Tonbo Biosciences 35-0086-T100
Gallios Flow Cytometer Beckman Coulter Life Sciences B43618 10 color, VBR
MACSquant Analyzer 10 Miltenyi Biotec 130-096-343 8 color, VBR

References

  1. Wira, C. R., Rodriguez-Garcia, M., Patel, M. V. The role of sex hormones in immune protection of the female reproductive tract. Nat Rev Immunol. 15 (4), 217-230 (2015).
  2. Banchereau, J., Steinman, R. M. Dendritic cells and the control of immunity. Nature. 392 (6673), 245-252 (1998).
  3. Schlitzer, A., McGovern, N., Ginhoux, F. Dendritic cells and monocyte-derived cells: Two complementary and integrated functional systems. Semin Cell Dev Biol. 41, 9-22 (2015).
  4. Tagliani, E., Erlebacher, A. Dendritic cell function at the maternal-fetal interface. Expert Rev Clin Immunol. 7 (5), 593-602 (2011).
  5. Kaldensjo, T., et al. Detection of intraepithelial and stromal Langerin and CCR5 positive cells in the human endometrium: potential targets for HIV infection. PLoS One. 6 (6), e21344 (2011).
  6. Schulke, L., Manconi, F., Markham, R., Fraser, I. S. Endometrial dendritic cell populations during the normal menstrual cycle. Hum Reprod. 23 (7), 1574-1580 (2008).
  7. Ballweber, L., et al. Vaginal langerhans cells nonproductively transporting HIV-1 mediate infection of T cells. J Virol. 85 (24), 13443-13447 (2011).
  8. Hladik, F., et al. Initial events in establishing vaginal entry and infection by human immunodeficiency virus type-1. Immunity. 26 (2), 257-270 (2007).
  9. Duluc, D., et al. Functional diversity of human vaginal APC subsets in directing T-cell responses. Mucosal Immunol. 6 (3), 626-638 (2013).
  10. Herzenberg, L. A., Tung, J., Moore, W. A., Parks, D. R. Interpreting flow cytometry data: a guide for the perplexed. Nat Immunol. 7 (7), 681-685 (2006).
  11. Juno, J. A., Boily-Larouche, G., Lajoie, J., Fowke, K. R. Collection, isolation, and flow cytometric analysis of human endocervical samples. J Vis Exp. (89), (2014).
  12. Givan, A. L., et al. Flow cytometric analysis of leukocytes in the human female reproductive tract: comparison of fallopian tube, uterus, cervix, and vagina. Am J Reprod Immunol. 38 (5), 350-359 (1997).
  13. Rodriguez-Garcia, M., et al. Dendritic cells from the human female reproductive tract rapidly capture and respond to HIV. Mucosal Immunol. 10 (2), 531-544 (2017).
  14. Rodriguez-Garcia, M., Barr, F. D., Crist, S. G., Fahey, J. V., Wira, C. R. Phenotype and susceptibility to HIV infection of CD4+ Th17 cells in the human female reproductive tract. Mucosal Immunol. 7 (6), 1375-1385 (2014).
  15. Shen, Z., Rodriguez-Garcia, M., Ochsenbauer, C., Wira, C. R. Characterization of immune cells and infection by HIV in human ovarian tissues. Am J Reprod Immunol. , (2017).

Play Video

Cite This Article
Rodriguez-Garcia, M., Fortier, J. M., Barr, F. D., Wira, C. R. Isolation of Dendritic Cells from the Human Female Reproductive Tract for Phenotypical and Functional Studies. J. Vis. Exp. (133), e57100, doi:10.3791/57100 (2018).

View Video