人雌性生殖道树突状细胞表型鉴定的分离及功能研究
Summary
本文介绍了一种从人类女性生殖道的不同解剖间隔分离纯化树突状细胞的方法, 以评价其表型鉴定和功能特征。该方法可用于隔离其他粘膜组织中的其他免疫细胞或树突状细胞。
Abstract
人树突状细胞 (DCs) 在黏膜组织中的特征是挑战, 由于难以获得样本, 和低数量的 DCs 目前每组织。然而, 由于在组织环境中对 dcs 的表型和功能进行了修改, 因此有必要对组织驻留 DC 种群进行分析, 因为血源 dcs 不完全反映了组织中 dcs 的复杂性。在这里, 我们提出一个协议, 以隔离 DCs 从人类女性生殖道 (首次登记) 使用子宫切除标本, 允许表型鉴定和功能分析。该协议包括组织消化生成单个细胞混合细胞悬浮, 其次是正磁珠选择。我们的组织消化协议不切割表面标记, 这允许表型鉴定和功能分析的 DCs 在稳定的状态, 没有夜间孵化或细胞活化。该协议可用于隔离其他免疫细胞类型或隔离 DCs 与其他组织。
Introduction
首次登记税具有保护病原体的双重功能, 同时允许植入和妊娠1。为了做到这一点, 首次登记税是分开的, 每个解剖区域显示独特的组织学, 免疫学和功能特征1。
DCs 存在于粘膜表面, 与肺、肠道和生殖道中的微生物接触, 并为潜在病原体提供免疫监测2。DCs 有独特的能力, 主要天真的 T 细胞和触发自适应免疫应答3。在首次登记税中, DCs 也专门用于容忍外国抗原, 如精子和发育中胎儿的抗体, 以允许成功怀孕4。因此, 根据位置, DC 表型和功能将是不同的。众所周知, DCs 受到组织环境的强烈影响, 因此它们的数量、表型和功能都被其驻留3的组织环境所修改。因此, 为瞭解首次登记税区议会在首次登记税中的传染病、怀孕及癌症所扮演的角色, 需要研究居民 dcs, 因为血液衍生的 dc 模型不足以解决首次登记税组织所发现的监管复杂性。
由于黏膜组织中的细胞数量少, 人体组织样本难以获得, 人体组织 DCs 的特性具有挑战性。使用免疫组化5、6在首次登记税中研究了 DCs, 它通知了组织内的细胞位置, 但排除了功能性研究, 并且限制了可以分析的识别细胞标记的数量。一次。此外, 已开发了用于流细胞分析的单个单元隔离协议7、8、9。其中一些协议利用 DCs 的迁移能力来隔离那些迁移的单元格。这些方法通常需要夜间孵化和选择的活化 dcs, 但不允许对 dcs 的研究在稳定的状态。
在这里, 使用子宫切除标本, 我们优化了一个协议, 以隔离 DCs 从不同解剖地点的首次登记税, 子宫内膜 (EM), 宫颈管 (CX) 和 ectocervix (ECX), 这使得表型鉴定和功能分析。使用非蛋白水解酶消化协议, 我们可以立即进行组织消化后细胞分离和流动细胞表征, 而不激活细胞。采用多色流式细胞术和对低细胞数进行功能研究, 可以识别和表征首次登记的不同部位的 DCs 稀有子集。
Protocol
Representative Results
Discussion
粘膜 DCs 是一种罕见的细胞群, 受组织环境的强烈影响, 一旦进入组织3, 就会改变其表型和功能。虽然血源性 DCs 是一个非常有用的模型, 但它们并不完全代表在组织中发现的 DC 种群的多样性。因此, 要了解粘膜 DCs 的独特特点, 必须从组织中分离出原细胞。在首次登记中, 从不同解剖部位分离出 DCs, 为研究直流功能在体外提供了机会, 并比较了 dc 子集和解剖位置。
<p class="…Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
由 NIH 资助 AI102838 和 AI117739 (CRW) 支持的研究。我们感谢理查德. Rossoll 的技术援助。流细胞分析是在 DartLab (P30CA023108-37) 和 (P30GM103415-15) Dartmouthsupported 的共享资源中进行的。
Materials
| Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) | Hyclone | SH30015.03 | |
| Penicillin-streptomycin | Hyclone | SV30010 | |
| HEPES (1M) | Hyclone | 15630-080 | |
| Collagenase IV | Sigma | C5138 | |
| Deoxyribonuclease I | Worthington Biochemical | LS002140 | |
| D-glucose | Sigma Aldritch | 50-99-7 | |
| 0.22 um Stericup 500 mL filter | Millipore | SCGPU05RE | |
| 100mm x 15mm polystyrene petri dish | Fisherbrand | FB0875712 | |
| 150mm x 15mm polystyrene petri dish | Fisherbrand | FB0875714 | |
| 150mm x 25mm polystyrene dish | Corning | 430599 | Treated cell culture dish |
| Isotemp Incubator | Fisher Scientific | FICO3500TABB | 5.0% CO2 |
| American Rotator V | American DADE | R4140 | |
| 250 um nylon mesh | Sefar | 03-250/50 | |
| 20 um nylon mesh | Sefar | 03-20/14 | |
| Beckman GS-6R Centrifuge | Beckman | 358702 | |
| X-VIVO 15 with Gentamicin L-Gln, Phenol Red, 1 L | Lonza | 04-418Q | |
| Human AB Serum | Valley Biomedical | HP1022 | |
| Histopaque-1077 | Sigma Aldritch | 10771 | |
| Phosphate Buffer Solution (PBS) | National Diagnostics | CL-253 | pH 7.4 |
| Dead Cell Removal Kit | Miltenyi Biotec | 130-090-101 | |
| Pre-separation filter (30um) | Miltenyi Biotec | 130-041-407 | |
| LS column | Miltenyi Biotec | 130-042-410 | |
| Quadro MACS Separator | Miltenyi Biotec | 130-090-976 | |
| MACS multi-stand | Miltenyi Biotec | 130-042-303 | |
| EDTA | USB | 15694 | |
| CD1a Microbeads, human | Miltenyi Biotec | 130-051-001 | |
| CD14 Microbeads, human | Miltenyi Biotec | 130-050-201 | |
| eFluor 670 cell proliferation dye | eBiosciences | 65-0840-85 | |
| 96 well round bottom plate | Falcon | 9/8/2866 | |
| Zombie yellow viability dye | Biolegend | 423104 | |
| CD3 APC/Cy7, anti-human | Tonbo Biosciences | 25-0038-T100 | |
| CD4 PE, anti-human | eBiosciences | 12-0048-42 | |
| CD8a FITC, anti-human | Tonbo Biosciences | 35-0086-T100 | |
| Gallios Flow Cytometer | Beckman Coulter Life Sciences | B43618 | 10 color, VBR |
| MACSquant Analyzer 10 | Miltenyi Biotec | 130-096-343 | 8 color, VBR |
References
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