عزل الخلايا الجذعية من الإنسان الأنثى التناسلي للدراسات الشكلية والوظيفية
Summary
يصف لنا هنا طريقة لعزل وتنقية الخلايا الجذعية من الأقسام التشريحية المختلفة في المسالك التناسلية الأنثى البشرية لتقييم خصائصها الشكلية والوظيفية. هذا الأسلوب يمكن تكييفها لعزل الخلايا الجذعية من الأنسجة المخاطية الأخرى أو الخلايا المناعية الأخرى.
Abstract
وصف الإنسان الخلايا الجذعية (DCs) المقيم في الأنسجة المخاطية صعبة نظراً لصعوبة الحصول على عينات، وانخفاض عدد وحدات تحكم المجال Dc يقدم كل الأنسجة. حتى الآن، كما يتم تعديل النمط الظاهري والوظيفة لوحدات تحكم المجال Dc بالبيئة الأنسجة، من الضروري لتحليل الأنسجة، السكان المقيمين على العاصمة، حيث الدم اشتقاق وحدات تحكم المجال Dc غير كامل تعكس التعقيدات من وحدات تحكم المجال Dc في الأنسجة. نقدم هنا بروتوكولا لعزل وحدات تحكم المجال Dc من البشرية الإناث المسالك التناسلية (معاهدة سجل الأفلام) باستخدام عينات من استئصال الرحم تسمح التحليلات الشكلية والفنية على حد سواء. البروتوكول يتكون من هضم الأنسجة لإنشاء خلية واحدة مختلطة تعليق خلية، متبوعاً بالتحديد حبة المغناطيسية إيجابية. تنشق بروتوكولنا الهضم الأنسجة لا علامات السطح، مما يسمح للتحليل الشكلية والوظيفية لوحدات تحكم المجال Dc في حالة مستقرة، دون تنشيط خلية أو الحضانة بين عشية وضحاها. هذا البروتوكول يمكن تكييفها للعزلة لأنواع أخرى من الخلايا المناعية أو عزلة من وحدات تحكم المجال Dc من الأنسجة الأخرى.
Introduction
معاهدة سجل الأفلام له وظيفة مزدوجة لحمايتها ضد العوامل الممرضة بينما يسمح لغرس والحمل1. لإنجاز هذا، هو معاهدة سجل الأفلام مجزأة، مع كل منطقة التشريحية عرض الخصائص الفريدة في غذائها والمناعية، والوظيفي1.
وحدات تحكم المجال Dc في الأسطح المخاطية إجراء اتصالات مع الميكروبات في الرئة والأمعاء، والتناسلي، وتوفير المراقبة المناعية ل مسببات الأمراض المحتملة2. وحدات تحكم المجال Dc بقدرة فريدة على رئيس الوزراء السذاجة خلايا تي وتؤدي إلى الاستجابات المناعية التكيفية3. وحدات تحكم المجال Dc في معاهدة سجل الأفلام أيضا متخصصة أن تتسامح مع المستضدات الخارجية، مثل تلك التي وجدت في الحيوانات المنوية والجنين النامي، للسماح للحمل ناجحة4. ولذلك، اعتماداً على الموقع، DC النمط الظاهري ووظيفة ستكون متميزة. ومن المعروف أن وحدات تحكم المجال Dc تتأثر بشدة بالبيئة الأنسجة، حيث أن عددهم، والنمط الظاهري، ووظائف يتم تعديلها بواسطة أنسجة البيئة التي يقيمون فيها3. لذلك، لفهم الدور الذي تؤديه “معاهدة سجل الأفلام وحدات تحكم المجال Dc” في الأمراض المعدية، والحمل، والسرطان في معاهدة سجل الأفلام، المقيم وحدات تحكم المجال Dc تحتاج إلى دراسة، منذ الدم المشتق DC نماذج غير كافية لمعالجة التعقيدات التنظيمية الموجودة في أنسجة معاهدة سجل الأفلام.
وصف الأنسجة البشرية تتحدى DCs المقيمين نظراً لانخفاض عدد الخلايا الموجودة في الأنسجة المخاطية وصعوبة الحصول على عينات الأنسجة البشرية. وقد درست وحدات تحكم المجال Dc في معاهدة سجل الأفلام إيمونوهيستوتشيميستري5،6، الذي يبلغ عن موقع الخلية داخل الأنسجة، ولكن يحول دون الدراسات الفنية، ومحدودة في العدد من تحديد علامات الخلية التي يمكن تحليلها باستخدام في وقت واحد. وعلاوة على ذلك، كانت خلية مفردة العزلة البروتوكولات لتحليل تدفق سيتوميتريك المتقدمة7،،من89. بعض من هذه البروتوكولات الاستفادة من القدرات المهاجرة من وحدات تحكم المجال Dc لعزل تلك الخلايا التي تهاجر. عادة ما تكون هذه الأساليب تتطلب إينكوبيشنز بين عشية وضحاها، والتحديد لتنشيط وحدات تحكم المجال Dc، ولكن لا تسمح بدراسة وحدات تحكم المجال Dc في حالة مستقرة.
هنا، باستخدام عينات من استئصال الرحم، ونحن الأمثل بروتوكولا لعزل وحدات تحكم المجال Dc من مختلف المواقع التشريحية في معاهدة سجل الأفلام، بطانة الرحم (م)، اندوسيرفيكس (CX)، واكتوسيرفيكس (ECX)، التي تمكن من التحليلات الشكلية والفنية على حد سواء. استخدام بروتوكول غير proteolytic هضم الأنزيمي، يمكن أن نشرع فورا بعد الهضم الأنسجة لتوصيف سيتوميتريك العزلة وتدفق الخلية دون تنشيط الخلية. استخدام قياس التدفق متعدد الألوان والتكيف مع الدراسات الفنية لانخفاض عدد الخلايا، ونحن يمكن تحديد وتوصيف المجموعات النادرة من وحدات تحكم المجال Dc في مواقع مختلفة FRT.
Protocol
Representative Results
Discussion
وحدات تحكم المجال Dc المخاطية هي خلية نادرة سكان تأثرا شديدا بالبيئة الأنسجة، مما يؤدي إلى تغيير النمط الظاهري، والدالة بمجرد دخولهم الأنسجة3. بينما تستمد الدم DCs نموذجا مفيداً للغاية، وهي لا تمثل كامل تنوع سكان العاصمة وجدت في الأنسجة. ولذلك، فهم الخصائص الفريدة لوحدات تحكم ا…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
منح دراسة تدعمها المعاهد الوطنية للصحة AI102838 و AI117739 (كرو). ونحن نشكر روسول ريتشارد للمساعدة التقنية. أجرى تحليل تدفق سيتوميتريك في دارتلاب، “الموارد المشتركة” في دارتموثسوبورتيد (P30CA023108-37) و (P30GM103415-15).
Materials
| Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) | Hyclone | SH30015.03 | |
| Penicillin-streptomycin | Hyclone | SV30010 | |
| HEPES (1M) | Hyclone | 15630-080 | |
| Collagenase IV | Sigma | C5138 | |
| Deoxyribonuclease I | Worthington Biochemical | LS002140 | |
| D-glucose | Sigma Aldritch | 50-99-7 | |
| 0.22 um Stericup 500 mL filter | Millipore | SCGPU05RE | |
| 100mm x 15mm polystyrene petri dish | Fisherbrand | FB0875712 | |
| 150mm x 15mm polystyrene petri dish | Fisherbrand | FB0875714 | |
| 150mm x 25mm polystyrene dish | Corning | 430599 | Treated cell culture dish |
| Isotemp Incubator | Fisher Scientific | FICO3500TABB | 5.0% CO2 |
| American Rotator V | American DADE | R4140 | |
| 250 um nylon mesh | Sefar | 03-250/50 | |
| 20 um nylon mesh | Sefar | 03-20/14 | |
| Beckman GS-6R Centrifuge | Beckman | 358702 | |
| X-VIVO 15 with Gentamicin L-Gln, Phenol Red, 1 L | Lonza | 04-418Q | |
| Human AB Serum | Valley Biomedical | HP1022 | |
| Histopaque-1077 | Sigma Aldritch | 10771 | |
| Phosphate Buffer Solution (PBS) | National Diagnostics | CL-253 | pH 7.4 |
| Dead Cell Removal Kit | Miltenyi Biotec | 130-090-101 | |
| Pre-separation filter (30um) | Miltenyi Biotec | 130-041-407 | |
| LS column | Miltenyi Biotec | 130-042-410 | |
| Quadro MACS Separator | Miltenyi Biotec | 130-090-976 | |
| MACS multi-stand | Miltenyi Biotec | 130-042-303 | |
| EDTA | USB | 15694 | |
| CD1a Microbeads, human | Miltenyi Biotec | 130-051-001 | |
| CD14 Microbeads, human | Miltenyi Biotec | 130-050-201 | |
| eFluor 670 cell proliferation dye | eBiosciences | 65-0840-85 | |
| 96 well round bottom plate | Falcon | 9/8/2866 | |
| Zombie yellow viability dye | Biolegend | 423104 | |
| CD3 APC/Cy7, anti-human | Tonbo Biosciences | 25-0038-T100 | |
| CD4 PE, anti-human | eBiosciences | 12-0048-42 | |
| CD8a FITC, anti-human | Tonbo Biosciences | 35-0086-T100 | |
| Gallios Flow Cytometer | Beckman Coulter Life Sciences | B43618 | 10 color, VBR |
| MACSquant Analyzer 10 | Miltenyi Biotec | 130-096-343 | 8 color, VBR |
References
- Wira, C. R., Rodriguez-Garcia, M., Patel, M. V. The role of sex hormones in immune protection of the female reproductive tract. Nat Rev Immunol. 15 (4), 217-230 (2015).
- Banchereau, J., Steinman, R. M. Dendritic cells and the control of immunity. Nature. 392 (6673), 245-252 (1998).
- Schlitzer, A., McGovern, N., Ginhoux, F. Dendritic cells and monocyte-derived cells: Two complementary and integrated functional systems. Semin Cell Dev Biol. 41, 9-22 (2015).
- Tagliani, E., Erlebacher, A. Dendritic cell function at the maternal-fetal interface. Expert Rev Clin Immunol. 7 (5), 593-602 (2011).
- Kaldensjo, T., et al. Detection of intraepithelial and stromal Langerin and CCR5 positive cells in the human endometrium: potential targets for HIV infection. PLoS One. 6 (6), e21344 (2011).
- Schulke, L., Manconi, F., Markham, R., Fraser, I. S. Endometrial dendritic cell populations during the normal menstrual cycle. Hum Reprod. 23 (7), 1574-1580 (2008).
- Ballweber, L., et al. Vaginal langerhans cells nonproductively transporting HIV-1 mediate infection of T cells. J Virol. 85 (24), 13443-13447 (2011).
- Hladik, F., et al. Initial events in establishing vaginal entry and infection by human immunodeficiency virus type-1. Immunity. 26 (2), 257-270 (2007).
- Duluc, D., et al. Functional diversity of human vaginal APC subsets in directing T-cell responses. Mucosal Immunol. 6 (3), 626-638 (2013).
- Herzenberg, L. A., Tung, J., Moore, W. A., Parks, D. R. Interpreting flow cytometry data: a guide for the perplexed. Nat Immunol. 7 (7), 681-685 (2006).
- Juno, J. A., Boily-Larouche, G., Lajoie, J., Fowke, K. R. Collection, isolation, and flow cytometric analysis of human endocervical samples. J Vis Exp. (89), (2014).
- Givan, A. L., et al. Flow cytometric analysis of leukocytes in the human female reproductive tract: comparison of fallopian tube, uterus, cervix, and vagina. Am J Reprod Immunol. 38 (5), 350-359 (1997).
- Rodriguez-Garcia, M., et al. Dendritic cells from the human female reproductive tract rapidly capture and respond to HIV. Mucosal Immunol. 10 (2), 531-544 (2017).
- Rodriguez-Garcia, M., Barr, F. D., Crist, S. G., Fahey, J. V., Wira, C. R. Phenotype and susceptibility to HIV infection of CD4+ Th17 cells in the human female reproductive tract. Mucosal Immunol. 7 (6), 1375-1385 (2014).
- Shen, Z., Rodriguez-Garcia, M., Ochsenbauer, C., Wira, C. R. Characterization of immune cells and infection by HIV in human ovarian tissues. Am J Reprod Immunol. , (2017).
