Изоляция дендритных клеток от женского репродуктивного тракта человека Фенотипические и функциональных исследований
Summary
Здесь мы описываем метод, чтобы изолировать и очистить дендритные клетки из различных анатомических отсеков в человека женского репродуктивного тракта для оценки их Фенотипические и функциональные характеристики. Этот метод может быть адаптирована для изоляции другие иммунные клетки или дендритные клетки от других слизистых тканей.
Abstract
Характеристика человека дендритных клеток (DCs) проживающих в слизистых тканей сложной из-за трудностей в получении образцов, и малочисленность РСУ представляют на ткани. Тем не менее измененная фенотипа и функции контроллеров домена является ткани окружающей среды, необходимо анализировать ткани жителей DC, поскольку кровь производные DCs неполно отражают сложность DCs в тканях. Здесь мы представляем протокол изолировать DCs от человека женского репродуктивного тракта (ФРТ) с использованием образцов гистерэктомия, позволяющий Фенотипические и функционального анализа. Протокол состоит из ткани пищеварение сформировать одну ячейку смешанные суспензию клеток, последовали положительные магнитный шарик выбор. Наши ткани пищеварение протокол не прилепится поверхностных маркеров, который позволяет Фенотипические и функциональный анализ DCs в стационарном состоянии, без ночи инкубации или клетки активации. Этот протокол может быть адаптирована для изоляции других типов иммунных клеток или изоляции DCs из других тканей.
Introduction
ФРТ имеет двойную функцию защиты от патогенов, позволяя имплантации и беременность-1. Для этого, ФРТ разобщенным, с каждого анатомического региона отображения уникальные гистологические, иммунологических и функциональные характеристики1.
DCs на слизистой поверхности сделать контакт с микробами в легких и кишечника, половых путей и обеспечивают иммунной наблюдения для потенциальных патогенов2. Контроллеры домена имеют уникальную возможность премьер наивные Т-клеток и инициировать адаптивного иммунного ответа3. DCs на ФРТ также специализированные терпеть иностранных антигены, например в спермы и развивающегося плода, чтобы позволить беременность4. Таким образом в зависимости от местоположения, DC фенотипа и функция будет собственный. Известно, что DCs сильно зависит от окружающей среды ткани, таким образом, что их количество, фенотип и функции изменяются средой ткани, в которой они проживают3. Таким образом чтобы понять роль, которую играют FRT DCs в инфекционных заболеваний и беременности, рака в ФРТ, резидентов DCs необходимо изучить, поскольку производные DC модели являются недостаточными для решения нормативные сложности в тканях FRT крови.
Характеристика тканей человека резидентов DCs является сложной задачей из-за низкого числа клеток в слизистой ткани и трудности с получением образцов человеческой ткани. РСУ были изучены в ФРТ, иммуногистохимия5,6, который сообщает о местонахождении клеток в тканях, но исключает функциональных исследований и ограничено количество идентификации ячейки маркеры, которые могут быть проанализированы с помощью за один раз. Кроме того протоколы изоляции одной ячейки для анализа потока гранулярных были развитых7,8,9. Некоторые из этих протоколов воспользоваться мигрирующих DCs способность изолировать те клетки, которые мигрируют. Эти методы обычно требуют ночи инкубаций и подбор активированного DCs, но не позволяют для изучения DCs в стационарном состоянии.
Здесь, используя образцы гистерэктомия, оптимизированный протокол изолировать DCs из различных анатомических сайтов в ФРТ, эндометрия (EM), эндоцервикса (CX) и ectocervix (ECX), что позволяет Фенотипические и функционального анализа. С помощью протокола не протеолитических ферментативного пищеварения, мы можем приступить сразу же после переваривания ткани для ячейки изоляции и потока гранулярных характеристика без активации клеток. Используя многоцветные проточной цитометрии и адаптации функциональные исследования для незначительного числа клеток, мы можем определить и охарактеризовать редких подмножеств DCs в различных сайтах фрахт
Protocol
Representative Results
Discussion
Слизистых оболочек DCs являются популяции редких клеток под влиянием окружающей среды ткани, который изменяет их фенотипа и функции, как только они вступают в тканях3. Хотя производные крови DCs являются весьма полезной модели, они не полностью отражают разнообразие DC населе?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Поддерживаемый NIH стипендии AI102838 и AI117739 (CRW). Мы благодарим Ричарда Rossoll для оказания технической помощи. Анализ потока гранулярных был проведен в DartLab, общий ресурс на Dartmouthsupported (P30CA023108-37) и (P30GM103415-15).
Materials
| Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) | Hyclone | SH30015.03 | |
| Penicillin-streptomycin | Hyclone | SV30010 | |
| HEPES (1M) | Hyclone | 15630-080 | |
| Collagenase IV | Sigma | C5138 | |
| Deoxyribonuclease I | Worthington Biochemical | LS002140 | |
| D-glucose | Sigma Aldritch | 50-99-7 | |
| 0.22 um Stericup 500 mL filter | Millipore | SCGPU05RE | |
| 100mm x 15mm polystyrene petri dish | Fisherbrand | FB0875712 | |
| 150mm x 15mm polystyrene petri dish | Fisherbrand | FB0875714 | |
| 150mm x 25mm polystyrene dish | Corning | 430599 | Treated cell culture dish |
| Isotemp Incubator | Fisher Scientific | FICO3500TABB | 5.0% CO2 |
| American Rotator V | American DADE | R4140 | |
| 250 um nylon mesh | Sefar | 03-250/50 | |
| 20 um nylon mesh | Sefar | 03-20/14 | |
| Beckman GS-6R Centrifuge | Beckman | 358702 | |
| X-VIVO 15 with Gentamicin L-Gln, Phenol Red, 1 L | Lonza | 04-418Q | |
| Human AB Serum | Valley Biomedical | HP1022 | |
| Histopaque-1077 | Sigma Aldritch | 10771 | |
| Phosphate Buffer Solution (PBS) | National Diagnostics | CL-253 | pH 7.4 |
| Dead Cell Removal Kit | Miltenyi Biotec | 130-090-101 | |
| Pre-separation filter (30um) | Miltenyi Biotec | 130-041-407 | |
| LS column | Miltenyi Biotec | 130-042-410 | |
| Quadro MACS Separator | Miltenyi Biotec | 130-090-976 | |
| MACS multi-stand | Miltenyi Biotec | 130-042-303 | |
| EDTA | USB | 15694 | |
| CD1a Microbeads, human | Miltenyi Biotec | 130-051-001 | |
| CD14 Microbeads, human | Miltenyi Biotec | 130-050-201 | |
| eFluor 670 cell proliferation dye | eBiosciences | 65-0840-85 | |
| 96 well round bottom plate | Falcon | 9/8/2866 | |
| Zombie yellow viability dye | Biolegend | 423104 | |
| CD3 APC/Cy7, anti-human | Tonbo Biosciences | 25-0038-T100 | |
| CD4 PE, anti-human | eBiosciences | 12-0048-42 | |
| CD8a FITC, anti-human | Tonbo Biosciences | 35-0086-T100 | |
| Gallios Flow Cytometer | Beckman Coulter Life Sciences | B43618 | 10 color, VBR |
| MACSquant Analyzer 10 | Miltenyi Biotec | 130-096-343 | 8 color, VBR |
References
- Wira, C. R., Rodriguez-Garcia, M., Patel, M. V. The role of sex hormones in immune protection of the female reproductive tract. Nat Rev Immunol. 15 (4), 217-230 (2015).
- Banchereau, J., Steinman, R. M. Dendritic cells and the control of immunity. Nature. 392 (6673), 245-252 (1998).
- Schlitzer, A., McGovern, N., Ginhoux, F. Dendritic cells and monocyte-derived cells: Two complementary and integrated functional systems. Semin Cell Dev Biol. 41, 9-22 (2015).
- Tagliani, E., Erlebacher, A. Dendritic cell function at the maternal-fetal interface. Expert Rev Clin Immunol. 7 (5), 593-602 (2011).
- Kaldensjo, T., et al. Detection of intraepithelial and stromal Langerin and CCR5 positive cells in the human endometrium: potential targets for HIV infection. PLoS One. 6 (6), e21344 (2011).
- Schulke, L., Manconi, F., Markham, R., Fraser, I. S. Endometrial dendritic cell populations during the normal menstrual cycle. Hum Reprod. 23 (7), 1574-1580 (2008).
- Ballweber, L., et al. Vaginal langerhans cells nonproductively transporting HIV-1 mediate infection of T cells. J Virol. 85 (24), 13443-13447 (2011).
- Hladik, F., et al. Initial events in establishing vaginal entry and infection by human immunodeficiency virus type-1. Immunity. 26 (2), 257-270 (2007).
- Duluc, D., et al. Functional diversity of human vaginal APC subsets in directing T-cell responses. Mucosal Immunol. 6 (3), 626-638 (2013).
- Herzenberg, L. A., Tung, J., Moore, W. A., Parks, D. R. Interpreting flow cytometry data: a guide for the perplexed. Nat Immunol. 7 (7), 681-685 (2006).
- Juno, J. A., Boily-Larouche, G., Lajoie, J., Fowke, K. R. Collection, isolation, and flow cytometric analysis of human endocervical samples. J Vis Exp. (89), (2014).
- Givan, A. L., et al. Flow cytometric analysis of leukocytes in the human female reproductive tract: comparison of fallopian tube, uterus, cervix, and vagina. Am J Reprod Immunol. 38 (5), 350-359 (1997).
- Rodriguez-Garcia, M., et al. Dendritic cells from the human female reproductive tract rapidly capture and respond to HIV. Mucosal Immunol. 10 (2), 531-544 (2017).
- Rodriguez-Garcia, M., Barr, F. D., Crist, S. G., Fahey, J. V., Wira, C. R. Phenotype and susceptibility to HIV infection of CD4+ Th17 cells in the human female reproductive tract. Mucosal Immunol. 7 (6), 1375-1385 (2014).
- Shen, Z., Rodriguez-Garcia, M., Ochsenbauer, C., Wira, C. R. Characterization of immune cells and infection by HIV in human ovarian tissues. Am J Reprod Immunol. , (2017).
