Isolatie van dendritische cellen uit de menselijke vrouwelijke voortplantingssysteem voor Phenotypical en functionele Studies
Summary
Hier beschrijven we een methode om te isoleren en te zuiveren van dendritische cellen uit verschillende anatomische compartimenten in de menselijke vrouwelijke voortplantingssysteem voor de evaluatie van hun phenotypical en functionele kenmerken. Deze methode kan worden aangepast aan het isoleren van andere immune cellen of van dendritische cellen uit andere mucosal weefsels.
Abstract
De karakterisering van de menselijke dendritische cellen (DC’s) woonachtig in de mucosal weefsels is uitdagend als gevolg van de moeilijkheden bij het verkrijgen van monsters, en de lage aantallen van DCs presenteren per weefsel. Nog, als de fenotype en de functie van DCs is gewijzigd door het weefsel milieu, er moet analyseren weefsel resident DC populaties, omdat bloed afkomstig DCs onvolledig weerspiegelen de complexiteit van DCs in weefsels. Hier presenteren we een protocol om te isoleren van de menselijke vrouwelijke voortplantingssysteem (FRT) met behulp van hysterectomie specimens waarmee zowel phenotypical en functionele analyses DCs. Het protocol bestaat uit weefsel spijsvertering voor het genereren van een eencellige gemengd celsuspensie, gevolgd door positieve magnetische kraal selectie. Ons weefsel spijsvertering protocol doet niet klieven oppervlakte markers, waardoor phenotypical en functionele analyse van DCs in de steady-state, zonder overnachting incubatie of cel activering. Dit protocol kan worden aangepast voor de isolatie van andersoortige immuun cel of isolatie van DCs uit andere weefsels.
Introduction
De FRT heeft de dubbele functie van de bescherming tegen ziekteverwekkers terwijl het toestaan van implantatie en zwangerschap1. Om dit te bereiken, is de FRT gecompartimenteerd, met elke anatomische regio unieke histologische, immunologische en functionele kenmerken1weer te geven.
DCs bijwonen mucosal oppervlakken maken contact met microben in de longen, de darmen en de voortplantingsorganen en immuun toezicht voor potentiële ziekteverwekkers2bieden. DCs hebben de unieke mogelijkheid om prime naïef T-cellen en adaptieve immuunresponsen3te activeren. DCs in de FRT zijn ook gespecialiseerd om het dulden van vreemde antigenen, zoals die gevonden in sperma en de zich ontwikkelende foetus, dat succesvolle zwangerschap4. Daarom, afhankelijk van de locatie, de DC fenotype en functie zal zijn verschillend. Het is bekend dat DCs sterk worden beïnvloed door het milieu weefsel, zodat hun aantal, fenotype en functies zijn gewijzigd door het milieu van de weefsels waarin zij3 wonen. Daarom, om te begrijpen van de rol die FRT DCs bij besmettelijke ziekten, zwangerschap, en kanker in de FRT spelen, resident DCs moeten worden bestudeerd, sinds bloed afgeleide DC modellen onvoldoende zijn om de regelgevende complexiteit gevonden in FRT weefsels.
De karakterisatie van menselijke weefsel resident DCs is uitdagend vanwege de lage aantallen cellen aanwezig in de mucosal weefsels en het moeilijk verkrijgen van menselijk weefselmonsters. DCs zijn bestudeerd in de FRT via immunohistochemistry5,6, die informeert over de cellocatie in het weefsel, maar verzet zich tegen de functionele studies, en die is beperkt in het aantal identificeren cel markeringen die kunnen worden geanalyseerd tegelijk. Bovendien zijn eencellige isolatie protocollen voor flow cytometrische analyse ontwikkelde7,8,9. Sommige van deze protocollen te profiteren van de trekkende capaciteit van DCs te isoleren van de cellen die migreren. Deze methoden meestal ‘s nachts incubations en selectie van geactiveerde DCs vereisen, maar laat niet voor de studie van DCs in de steady state.
Hier, met behulp van hysterectomie specimens, we geoptimaliseerd een protocol om te isoleren DCs van verschillende anatomische sites in de FRT, het endometrium (EM), de endocervix (CX), en de ectocervix (ECX), waarmee zowel de phenotypical en de functionele analyses. Een niet-Proteolytische enzymatische spijsvertering-protocol gebruikt, kunnen wij onmiddellijk na weefsel spijsvertering aan cel isolatie en stroom cytometrische karakterisering zonder activering van de cel. Multicolor stroom cytometry gebruikt en functionele studies voor de lage aantallen cellen aan te passen, kunnen we identificeren en karakteriseren van zeldzame deelverzamelingen van DCs in de verschillende sites van de FRT.
Protocol
Representative Results
Discussion
Mucosale DCs zijn een zeldzame celpopulatie sterk beïnvloed door het milieu weefsel, dat verandert hun fenotype en functie zodra ze de weefsels3invoert. Terwijl bloed afkomstig DCs zijn een handig model, ze doen niet geheel representatief is de diversiteit van DC populaties gevonden in weefsels. Daarom, om te begrijpen van de unieke kenmerken van mucosal DCs, isolatie van primaire cellen van weefsels is noodzakelijk. Isolatie van DCs van verschillende anatomische sites in de FRT biedt de mogelijk…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ondersteund door de NIH studiebeurzen AI102838 en AI117739 (CRW). Wij danken Richard Rossoll voor technische bijstand. Flow cytometrische analyse werd uitgevoerd in DartLab, de gedeelde Resource Dartmouthsupported door (P30CA023108-37) en (P30GM103415-15).
Materials
| Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) | Hyclone | SH30015.03 | |
| Penicillin-streptomycin | Hyclone | SV30010 | |
| HEPES (1M) | Hyclone | 15630-080 | |
| Collagenase IV | Sigma | C5138 | |
| Deoxyribonuclease I | Worthington Biochemical | LS002140 | |
| D-glucose | Sigma Aldritch | 50-99-7 | |
| 0.22 um Stericup 500 mL filter | Millipore | SCGPU05RE | |
| 100mm x 15mm polystyrene petri dish | Fisherbrand | FB0875712 | |
| 150mm x 15mm polystyrene petri dish | Fisherbrand | FB0875714 | |
| 150mm x 25mm polystyrene dish | Corning | 430599 | Treated cell culture dish |
| Isotemp Incubator | Fisher Scientific | FICO3500TABB | 5.0% CO2 |
| American Rotator V | American DADE | R4140 | |
| 250 um nylon mesh | Sefar | 03-250/50 | |
| 20 um nylon mesh | Sefar | 03-20/14 | |
| Beckman GS-6R Centrifuge | Beckman | 358702 | |
| X-VIVO 15 with Gentamicin L-Gln, Phenol Red, 1 L | Lonza | 04-418Q | |
| Human AB Serum | Valley Biomedical | HP1022 | |
| Histopaque-1077 | Sigma Aldritch | 10771 | |
| Phosphate Buffer Solution (PBS) | National Diagnostics | CL-253 | pH 7.4 |
| Dead Cell Removal Kit | Miltenyi Biotec | 130-090-101 | |
| Pre-separation filter (30um) | Miltenyi Biotec | 130-041-407 | |
| LS column | Miltenyi Biotec | 130-042-410 | |
| Quadro MACS Separator | Miltenyi Biotec | 130-090-976 | |
| MACS multi-stand | Miltenyi Biotec | 130-042-303 | |
| EDTA | USB | 15694 | |
| CD1a Microbeads, human | Miltenyi Biotec | 130-051-001 | |
| CD14 Microbeads, human | Miltenyi Biotec | 130-050-201 | |
| eFluor 670 cell proliferation dye | eBiosciences | 65-0840-85 | |
| 96 well round bottom plate | Falcon | 9/8/2866 | |
| Zombie yellow viability dye | Biolegend | 423104 | |
| CD3 APC/Cy7, anti-human | Tonbo Biosciences | 25-0038-T100 | |
| CD4 PE, anti-human | eBiosciences | 12-0048-42 | |
| CD8a FITC, anti-human | Tonbo Biosciences | 35-0086-T100 | |
| Gallios Flow Cytometer | Beckman Coulter Life Sciences | B43618 | 10 color, VBR |
| MACSquant Analyzer 10 | Miltenyi Biotec | 130-096-343 | 8 color, VBR |
References
- Wira, C. R., Rodriguez-Garcia, M., Patel, M. V. The role of sex hormones in immune protection of the female reproductive tract. Nat Rev Immunol. 15 (4), 217-230 (2015).
- Banchereau, J., Steinman, R. M. Dendritic cells and the control of immunity. Nature. 392 (6673), 245-252 (1998).
- Schlitzer, A., McGovern, N., Ginhoux, F. Dendritic cells and monocyte-derived cells: Two complementary and integrated functional systems. Semin Cell Dev Biol. 41, 9-22 (2015).
- Tagliani, E., Erlebacher, A. Dendritic cell function at the maternal-fetal interface. Expert Rev Clin Immunol. 7 (5), 593-602 (2011).
- Kaldensjo, T., et al. Detection of intraepithelial and stromal Langerin and CCR5 positive cells in the human endometrium: potential targets for HIV infection. PLoS One. 6 (6), e21344 (2011).
- Schulke, L., Manconi, F., Markham, R., Fraser, I. S. Endometrial dendritic cell populations during the normal menstrual cycle. Hum Reprod. 23 (7), 1574-1580 (2008).
- Ballweber, L., et al. Vaginal langerhans cells nonproductively transporting HIV-1 mediate infection of T cells. J Virol. 85 (24), 13443-13447 (2011).
- Hladik, F., et al. Initial events in establishing vaginal entry and infection by human immunodeficiency virus type-1. Immunity. 26 (2), 257-270 (2007).
- Duluc, D., et al. Functional diversity of human vaginal APC subsets in directing T-cell responses. Mucosal Immunol. 6 (3), 626-638 (2013).
- Herzenberg, L. A., Tung, J., Moore, W. A., Parks, D. R. Interpreting flow cytometry data: a guide for the perplexed. Nat Immunol. 7 (7), 681-685 (2006).
- Juno, J. A., Boily-Larouche, G., Lajoie, J., Fowke, K. R. Collection, isolation, and flow cytometric analysis of human endocervical samples. J Vis Exp. (89), (2014).
- Givan, A. L., et al. Flow cytometric analysis of leukocytes in the human female reproductive tract: comparison of fallopian tube, uterus, cervix, and vagina. Am J Reprod Immunol. 38 (5), 350-359 (1997).
- Rodriguez-Garcia, M., et al. Dendritic cells from the human female reproductive tract rapidly capture and respond to HIV. Mucosal Immunol. 10 (2), 531-544 (2017).
- Rodriguez-Garcia, M., Barr, F. D., Crist, S. G., Fahey, J. V., Wira, C. R. Phenotype and susceptibility to HIV infection of CD4+ Th17 cells in the human female reproductive tract. Mucosal Immunol. 7 (6), 1375-1385 (2014).
- Shen, Z., Rodriguez-Garcia, M., Ochsenbauer, C., Wira, C. R. Characterization of immune cells and infection by HIV in human ovarian tissues. Am J Reprod Immunol. , (2017).
