İnsan dişi üreme yolu dendritik hücreler yalıtım Phenotypical ve fonksiyonel çalışmaları için
Summary
Biz burada yalıtmak ve phenotypical ve fonksiyonel özellikleri değerlendirilmesi için insan kadın üreme sistemi içinde farklı anatomik bölmeleri dendritik hücrelerden arındırmak için bir yöntem açıklanmaktadır. Bu yöntem diğer bağışıklık hücreleri veya diğer Mukozal doku dendritik hücrelerden yalıtmak için adapte edilebilir.
Abstract
İnsan dendritik hücreler (DC) içinde Mukozal doku ikamet karakterizasyonu örnekleri alınırken zorluk nedeniyle zordur ve DCs az sayıda doku mevcut. Fenotip ve DCs işlevinin değiştirilmiş doku çevre tarafından henüz, doku ikamet DC nüfus analiz etmek, kan DCs eksik olarak elde edilen bu yana DCs karmaşıklığı dokularda yansıtmak için gerekli olduğu. Burada phenotypical ve fonksiyonel analiz sağlayan histerektomi örnekler kullanarak insan kadın üreme yolu (FRT) DCs yalıtmak için bir iletişim kuralı mevcut. Tek bir hücre hücre süspansiyon, pozitif manyetik boncuk seçime göre takip karışık üretmek için doku sindirim protokol oluşur. Bizim doku sindirim Protokolü phenotypical ve fonksiyonel analizde DC’lerin gecede kuluçka veya hücre etkinleştirme olmadan kararlı duruma sağlayan yüzey işaretleyicileri, ayırmak değil. Bu iletişim kuralı yalıtım diğer bağışıklık hücre tiplerinin veya diğer dokularda DC’lerin izolasyon için adapte edilebilir.
Introduction
FRT implantasyon ve gebelik1izin verirken patojenlere karşı korumanın çift işlevi vardır. Bunu yapmak için FRT, görünen benzersiz histolojik, immünolojik ve fonksiyonel özellikleri1her anatomik bölge ile bölümlere.
DCs Mukozal yüzeyler mevcut mikroplar akciğer, gut ve genital sistem ile ulaşın ve olası patojenler2için immün gözetim sağlayın olun. DCs saf T-hücreleri Başbakan ve adaptif bağışıklık yanıtı3tetiklemek için benzersiz yeteneği var. DCs FRT içinde de sperm ve başarılı gebelik4izin vermek için gelişmekte olan fetus bulunanlar gibi yabancı antijenleri tolere uzmanlaşmıştır. Bu nedenle, DC fenotip ve işlev konumuna bağlı olarak farklı olacaktır. Öyle ki onların numarası, fenotip ve işlevleri3bulundukları doku çevre tarafından değiştirilir DCs şiddetle doku çevre tarafından etkilenmiştir bilinir. Bu nedenle, bulaşıcı hastalıklar, gebelik ve FRT Kanserinde FRT DCs oynadığı rol, ikamet DCs türetilmiş DC modelleri FRT dokularda bulunan düzenleyici karmaşıklığı gidermek yetersiz kan beri incelenecektir anlamalısın.
İnsan dokusu karakterizasyonu ikamet DCs zorlu hücre içinde Mukozal doku mevcut düşük sayı ve insan doku örnekleri alınırken zorluk nedeniyle. DCs kullanarak doku içinde hücre konumu hakkında bilgilendirir ama fonksiyonel çalışmalar önler ve analiz edilebilir hücre işaretleyicileri tanımlama sayısı sınırlı immünhistokimya5,6, FRT incelenmiştir hemen. Ayrıca, tek hücre izolasyon protokolleri akış sitometrik analizi için gelişmiş7,8,9olmuştur. Bu protokollerin bazıları, geçiş hücreleri izole etmek için DCs göçmen kapasitesi avantajlarından yararlanın. Bu yöntemler genellikle gece incubations ve aktif DCs yelpazesi gerektirir ancak DCs çalışmada kararlı duruma için izin vermez.
Burada, histerektomi örnekler kullanarak, biz optimize DCs FRT, endometrium (EM), farklı anatomik sitelerden yalıtmak için bir protokol endocerviks (CX) ve ectocervix (ECX), phenotypical ve fonksiyonel analiz sağlar. Proteolitik Enzimatik sindirim protokolünü kullanarak, biz hemen sonra doku sindirim olmadan hücre aktivasyonu hücre izolasyon ve akım sitometrik karakterizasyonu için devam edebilirsiniz. Çok renkli Akış Sitometresi kullanarak ve fonksiyonel çalışmalar hücre düşük numaraları için adapte, biz tanımlamak ve DCs FRT. farklı sitelerdeki nadir kümelerine karakterize
Protocol
Representative Results
Discussion
Mukozal DCs şiddetle doku3girdiğinizde hangi onların fenotip ve işlev değişiklikleri doku çevre tarafından etkilenmiş bir nadir hücre nüfus vardır. Kan türetilmiş DCs çok kullanışlı bir model vardır, onlar tamamen dokularda bulunan DC nüfus çeşitliliği temsil etmemektedir. Bu nedenle, Mukozal DCs benzersiz özellikleri anlamak için birincil hücre dokuları yalıtım gereklidir. Yalıtım DC’lerin FRT farklı anatomik sitelerden DC işlevi vitro çalışma ve DC al…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
NIH tarafından desteklenen çalışma AI102838 ve AI117739 (CRW) verir. Richard Rossoll teknik yardım için teşekkür ederiz. Akış sitometrik analiz DartLab, Dartmouthsupported (P30CA023108-37) tarafından ve (P30GM103415-15) paylaşılan kaynak gerçekleştirilmiştir.
Materials
| Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) | Hyclone | SH30015.03 | |
| Penicillin-streptomycin | Hyclone | SV30010 | |
| HEPES (1M) | Hyclone | 15630-080 | |
| Collagenase IV | Sigma | C5138 | |
| Deoxyribonuclease I | Worthington Biochemical | LS002140 | |
| D-glucose | Sigma Aldritch | 50-99-7 | |
| 0.22 um Stericup 500 mL filter | Millipore | SCGPU05RE | |
| 100mm x 15mm polystyrene petri dish | Fisherbrand | FB0875712 | |
| 150mm x 15mm polystyrene petri dish | Fisherbrand | FB0875714 | |
| 150mm x 25mm polystyrene dish | Corning | 430599 | Treated cell culture dish |
| Isotemp Incubator | Fisher Scientific | FICO3500TABB | 5.0% CO2 |
| American Rotator V | American DADE | R4140 | |
| 250 um nylon mesh | Sefar | 03-250/50 | |
| 20 um nylon mesh | Sefar | 03-20/14 | |
| Beckman GS-6R Centrifuge | Beckman | 358702 | |
| X-VIVO 15 with Gentamicin L-Gln, Phenol Red, 1 L | Lonza | 04-418Q | |
| Human AB Serum | Valley Biomedical | HP1022 | |
| Histopaque-1077 | Sigma Aldritch | 10771 | |
| Phosphate Buffer Solution (PBS) | National Diagnostics | CL-253 | pH 7.4 |
| Dead Cell Removal Kit | Miltenyi Biotec | 130-090-101 | |
| Pre-separation filter (30um) | Miltenyi Biotec | 130-041-407 | |
| LS column | Miltenyi Biotec | 130-042-410 | |
| Quadro MACS Separator | Miltenyi Biotec | 130-090-976 | |
| MACS multi-stand | Miltenyi Biotec | 130-042-303 | |
| EDTA | USB | 15694 | |
| CD1a Microbeads, human | Miltenyi Biotec | 130-051-001 | |
| CD14 Microbeads, human | Miltenyi Biotec | 130-050-201 | |
| eFluor 670 cell proliferation dye | eBiosciences | 65-0840-85 | |
| 96 well round bottom plate | Falcon | 9/8/2866 | |
| Zombie yellow viability dye | Biolegend | 423104 | |
| CD3 APC/Cy7, anti-human | Tonbo Biosciences | 25-0038-T100 | |
| CD4 PE, anti-human | eBiosciences | 12-0048-42 | |
| CD8a FITC, anti-human | Tonbo Biosciences | 35-0086-T100 | |
| Gallios Flow Cytometer | Beckman Coulter Life Sciences | B43618 | 10 color, VBR |
| MACSquant Analyzer 10 | Miltenyi Biotec | 130-096-343 | 8 color, VBR |
References
- Wira, C. R., Rodriguez-Garcia, M., Patel, M. V. The role of sex hormones in immune protection of the female reproductive tract. Nat Rev Immunol. 15 (4), 217-230 (2015).
- Banchereau, J., Steinman, R. M. Dendritic cells and the control of immunity. Nature. 392 (6673), 245-252 (1998).
- Schlitzer, A., McGovern, N., Ginhoux, F. Dendritic cells and monocyte-derived cells: Two complementary and integrated functional systems. Semin Cell Dev Biol. 41, 9-22 (2015).
- Tagliani, E., Erlebacher, A. Dendritic cell function at the maternal-fetal interface. Expert Rev Clin Immunol. 7 (5), 593-602 (2011).
- Kaldensjo, T., et al. Detection of intraepithelial and stromal Langerin and CCR5 positive cells in the human endometrium: potential targets for HIV infection. PLoS One. 6 (6), e21344 (2011).
- Schulke, L., Manconi, F., Markham, R., Fraser, I. S. Endometrial dendritic cell populations during the normal menstrual cycle. Hum Reprod. 23 (7), 1574-1580 (2008).
- Ballweber, L., et al. Vaginal langerhans cells nonproductively transporting HIV-1 mediate infection of T cells. J Virol. 85 (24), 13443-13447 (2011).
- Hladik, F., et al. Initial events in establishing vaginal entry and infection by human immunodeficiency virus type-1. Immunity. 26 (2), 257-270 (2007).
- Duluc, D., et al. Functional diversity of human vaginal APC subsets in directing T-cell responses. Mucosal Immunol. 6 (3), 626-638 (2013).
- Herzenberg, L. A., Tung, J., Moore, W. A., Parks, D. R. Interpreting flow cytometry data: a guide for the perplexed. Nat Immunol. 7 (7), 681-685 (2006).
- Juno, J. A., Boily-Larouche, G., Lajoie, J., Fowke, K. R. Collection, isolation, and flow cytometric analysis of human endocervical samples. J Vis Exp. (89), (2014).
- Givan, A. L., et al. Flow cytometric analysis of leukocytes in the human female reproductive tract: comparison of fallopian tube, uterus, cervix, and vagina. Am J Reprod Immunol. 38 (5), 350-359 (1997).
- Rodriguez-Garcia, M., et al. Dendritic cells from the human female reproductive tract rapidly capture and respond to HIV. Mucosal Immunol. 10 (2), 531-544 (2017).
- Rodriguez-Garcia, M., Barr, F. D., Crist, S. G., Fahey, J. V., Wira, C. R. Phenotype and susceptibility to HIV infection of CD4+ Th17 cells in the human female reproductive tract. Mucosal Immunol. 7 (6), 1375-1385 (2014).
- Shen, Z., Rodriguez-Garcia, M., Ochsenbauer, C., Wira, C. R. Characterization of immune cells and infection by HIV in human ovarian tissues. Am J Reprod Immunol. , (2017).
