Summary

Isolement de cellules dendritiques de l’appareil reproducteur féminin humain pour des études phénotypiques et fonctionnelles

Published: March 13, 2018
doi:

Summary

Nous décrivons ici une méthode pour isoler et purifier les cellules dendritiques de différents compartiments anatomiques dans le tractus reproducteur femelle humain pour l’évaluation de leurs caractéristiques phénotypiques et fonctionnelles. Cette méthode peut être adaptée pour isoler des autres cellules immunitaires ou autres tissus muqueux, les cellules dendritiques.

Abstract

Il est difficile en raison de la difficulté à obtenir des échantillons de la caractérisation des cellules dendritiques humaines (DCs) résidents dans les tissus muqueux, et le faible nombre de DCs présents par tissu. Pourtant, que le phénotype et la fonction des contrôleurs de domaine n’est modifiée par l’environnement tissulaire, il est nécessaire d’analyser les populations résidentes de DC tissu, puisque le sang provenant DCs incomplètement refléter les complexités des contrôleurs de domaine dans les tissus. Nous présentons ici un protocole visant à isoler les contrôleurs de domaine de l’humain appareil reproducteur féminin (FRT) à l’aide de spécimens de l’hystérectomie qui permet des analyses phénotypiques et fonctionnelles. Le protocole se compose de digestion de tissu pour générer une seule cellule mixé suspension cellulaire, suivie par la sélection des billes magnétiques positifs. Notre protocole de digestion du tissu ne pas se fendent de marqueurs de surface, ce qui permet une analyse phénotypique et fonctionnelle des contrôleurs de domaine dans l’état d’équilibre, sans une nuit d’incubation ou cellule d’activation. Ce protocole peut être adapté pour l’isolement des autres types de cellules immunitaires ou l’isolement des contrôleurs de domaine provenant d’autres tissus.

Introduction

La DRF a la double fonction de protection contre les agents pathogènes tout en permettant l’implantation et la grossesse1. Pour ce faire, le TRAF est compartimenté, avec chaque région anatomique affiche des caractéristiques histologiques, immunologiques et fonctionnelle unique1.

DCs présents à surfaces muqueuses prendre contact avec les microbes dans les poumons, le tube digestif et l’appareil génital et assurer la surveillance immunitaire d’éventuels agents pathogènes2. Contrôleurs de domaine ont la capacité unique apprêter naïf T-cellules et de déclencher des réponses immunes adaptatives3. Contrôleurs de domaine dans le TRAF sont également spécialisés pour tolérer les antigènes étrangers, comme ceux que l’on trouve dans le sperme et le développement du fœtus, pour permettre une grossesse réussie4. Par conséquent, selon l’emplacement, le phénotype DC et la fonction seront dérouleront séparément. On sait que DCs sont fortement influencées par l’environnement tissulaire, telle que leur nombre, leur phénotype et fonctions sont modifiées par l’environnement tissulaire dans lequel ils résident3. Par conséquent, pour comprendre le rôle que jouent les FRT DCs en maladies infectieuses, la grossesse et le cancer dans le TRAF, DCs résidents doivent être étudiés, depuis le sang dérivées des modèles cc ne suffisent pas à résoudre les complexités réglementaires trouvées dans les tissus FRT.

La caractérisation des tissus humains DCs résidents est difficile en raison du faible nombre de cellules présentes dans les tissus muqueux et de la difficulté à obtenir des échantillons de tissus humains. Contrôleurs de domaine ont été étudiés dans le TRAF utilisant immunohistochimie5,6, qui renseigne sur l’emplacement de cellules dans les tissus, mais s’oppose à des études fonctionnelles et est limité dans le numéro d’identification de marqueurs de cellules qui peuvent être analysés Tout de suite. Par ailleurs, des protocoles d’isolement cellulaire unique pour cytométrie ont été développés7,8,9. Certains de ces protocoles tirer parti de la capacité migratoire de DCs pour isoler ces cellules qui migrent. Ces méthodes généralement nécessitent des incubations durant la nuit et sélection de DCs activés, mais ne permettent pas pour l’étude des contrôleurs de domaine à l’état stationnaire.

Ici, à l’aide de spécimens de l’hystérectomie, nous avons optimisé un protocole visant à isoler les contrôleurs de domaine de différents sites anatomiques de la FRT, l’endomètre (EM), l’endocol (CX) et l’exocol (ECX), qui permet des analyses phénotypiques et fonctionnelles. En utilisant un protocole non protéolytiques digestion enzymatique, nous pouvons procéder immédiatement après digestion de tissu à la caractérisation des cellule d’isolement et de flux par cytométrie en flux sans activation de la cellule. Cytométrie multicolore et en adaptant des études fonctionnelles pour les faibles nombres de cellules, nous pouvons identifier et caractériser les sous-ensembles rares de contrôleurs de domaine dans les différents sites de la FRT.

Protocol

Études sur des sujets humains ont été menées selon les principes exprimés dans la déclaration d’Helsinki. Études ont été approuvées par le Comité pour la Protection des sujets humains (SSPC) et Dartmouth College Institutional Review Board. Consentement éclairé a été obtenu avant l’intervention de femmes séronégatives subissant des hystérectomies au Dartmouth-Hitchcock Medical Center (Lebanon, NH). Pathologistes formés sélectionné des échantillons de tissus de l’EM, CX et ECX, exempte de lésio…

Representative Results

Digestion de tissus suivant, la sortie des feuilles épithéliales et des glandes peut être observée, comme illustré à la Figure 1 a; Il s’agit d’un contrôle positif qui indique la digestion enzymatique a été un succès. Le nombre de cellules viables totales et DCs récupérés par gramme de tissu est également indiqué dans la Figure 1 b et de la Figure 1, respectivement. Les cellules im…

Discussion

DCs muqueuses sont une population de cellules rares fortement influencée par l’environnement tissulaire, qui change leur phénotype et leurs fonctions une fois qu’ils pénètrent dans les tissus3. Bien que dérivé du sang DCs sont un modèle très utile, ils ne représentent pas complètement la diversité des populations de DC trouvé dans les tissus. Pour comprendre les caractéristiques uniques de muqueuses DCs, isolement de cellules primaires des tissus est donc nécessaire. Isolement de…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

AI102838 et AI117739 (CRW) bourses d’études appuyé par les NIH. Nous remercions Richard Rossoll d’assistance technique. Analyse en cytométrie en flux a été réalisée en DartLab, la ressource partagée au Dartmouthsupported de (P30CA023108-37) et (P30GM103415-15).

Materials

Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) Hyclone SH30015.03
Penicillin-streptomycin Hyclone SV30010
HEPES (1M) Hyclone 15630-080
Collagenase IV Sigma C5138
Deoxyribonuclease I Worthington Biochemical LS002140
D-glucose Sigma Aldritch 50-99-7
0.22 um Stericup 500 mL  filter Millipore SCGPU05RE
100mm x 15mm polystyrene petri dish Fisherbrand FB0875712
150mm x 15mm polystyrene petri dish Fisherbrand FB0875714
150mm x 25mm polystyrene dish Corning 430599 Treated cell culture dish
Isotemp Incubator Fisher Scientific FICO3500TABB 5.0% CO2
American Rotator V American DADE R4140
250 um nylon mesh Sefar 03-250/50
20 um nylon mesh Sefar 03-20/14
Beckman GS-6R Centrifuge Beckman 358702
X-VIVO 15 with Gentamicin L-Gln, Phenol Red, 1 L Lonza 04-418Q
Human AB Serum Valley Biomedical HP1022
Histopaque-1077 Sigma Aldritch 10771
Phosphate Buffer Solution (PBS) National Diagnostics CL-253 pH 7.4
Dead Cell Removal Kit Miltenyi Biotec 130-090-101
Pre-separation filter (30um) Miltenyi Biotec 130-041-407
LS column Miltenyi Biotec 130-042-410
Quadro MACS Separator Miltenyi Biotec 130-090-976
MACS multi-stand Miltenyi Biotec 130-042-303
EDTA USB 15694
CD1a Microbeads, human Miltenyi Biotec 130-051-001
CD14 Microbeads, human Miltenyi Biotec 130-050-201
eFluor 670 cell proliferation dye eBiosciences 65-0840-85
96 well round bottom plate Falcon 9/8/2866
Zombie yellow viability dye Biolegend 423104
CD3 APC/Cy7, anti-human Tonbo Biosciences 25-0038-T100
CD4 PE, anti-human eBiosciences 12-0048-42
CD8a FITC, anti-human Tonbo Biosciences 35-0086-T100
Gallios Flow Cytometer Beckman Coulter Life Sciences B43618 10 color, VBR
MACSquant Analyzer 10 Miltenyi Biotec 130-096-343 8 color, VBR

References

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Cite This Article
Rodriguez-Garcia, M., Fortier, J. M., Barr, F. D., Wira, C. R. Isolation of Dendritic Cells from the Human Female Reproductive Tract for Phenotypical and Functional Studies. J. Vis. Exp. (133), e57100, doi:10.3791/57100 (2018).

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