בידוד של תאים דנדריטים האדם באיברי הרבייה הנקביים ללימודי פנוטיפיות שהיו קיימות בעבר ופונקציונלי
Summary
נתאר כאן שיטה כדי לבודד ולטהר תאים דנדריטים שונים אנטומי בתאים אנושיים באיברי הרבייה הנקביים על ההערכה של תכונות פנוטיפיות שהיו קיימות בעבר ופונקציונליים שלהם. בשיטה זו ניתן להתאים כדי לבודד תאים חיסוניים אחרים או תאים דנדריטים של רקמות הרירית אחרות.
Abstract
האפיון של האדם התאים הדנדריטים (Dc) תושב ברקמות הרירית מאתגר עקב הקושי בהשגת דגימות, המספרים נמוכים בדרור להציג לכל רקמות. ובכל זאת, כמו פנוטיפ והתפקוד של בקרי קבוצת מחשבים משתנה על ידי הסביבה רקמות, זה הכרחי לנתח אוכלוסיות DC תושב רקמות, מאז דם נגזר DCs שהיישום לשקף את המורכבות של בקרי קבוצת מחשבים ברקמות. כאן אנו מציגים פרוטוקול כדי לבודד DCs מ האדם באיברי הרבייה הנקביים (והשפלתם) באמצעות דגימות כריתת רחם המאפשרת ניתוח פנוטיפיות שהיו קיימות בעבר וגם פונקציונלי. הפרוטוקול מורכב עיכול רקמת ליצירת תא בודד מעורב תא ההשעיה, ואחריו הבחירה חרוז מגנטי חיובי. פרוטוקול מערכת העיכול שלנו רקמות לא קליב סמני פני השטח, מה שמאפשר ניתוח פנוטיפיות שהיו קיימות בעבר ופונקציונליים של בקרי קבוצת מחשבים במצב יציב, ללא הפעלה דגירה או תא לילה. פרוטוקול זה ניתן להתאים עבור בידוד של סוגי תאים חיסוניים אחרים או בידוד של בקרי קבוצת מחשבים של רקמות אחרות.
Introduction
והשפלתם יש את הפונקציה כפול של הגנה מפני פתוגנים תוך מתן אפשרות השרשה והריון1. כדי לעשות זאת, והשפלתם באופן ממודר, עם כל אזור אנטומי מציג מאפיינים ייחודיים היסטולוגית, חיסונית, פונקציונלי1.
DCs נוכח משטחים הרירית לעשות קשר עם החיידקים הריאה, הבטן, ואת מערכת איברי המין, או לספק מעקב המערכת החיסונית פתוגנים פוטנציאליים2. בקרי קבוצת מחשבים יש יכולת ייחודית פריים תמים תאי-T ו לעורר תגובות מערכת החיסון מסתגלת3. בקרי קבוצת מחשבים והשפלתם מתמחה גם לסבול אנטיגנים זרים, כגון אלה שנמצאו הזרע ואת העובר המתפתח, כדי לאפשר הריון מוצלח4. לכן, בהתאם למיקום, פנוטיפ DC פונקציה יהיו ברורים. זה ידוע DCs מושפעים מאוד הסביבה רקמות, כך מספר שלהם, פנוטיפ ופונקציות עוברות שינוי על ידי הסביבה רקמות שבו הן שוכנות3. לכן, כדי להבין את התפקיד כי והשפלתם DCs לשחק ב מחלות זיהומיות, הריון ו סרטן והשפלתם, DCs תושב צריך להילמד, מאז דם מודלים DC הנגזר אינם הולמים לטפל המורכבות רגולטורי מצאו ברקמות והשפלתם.
האפיון של רקמה אנושית DCs תושב הוא מאתגר בשל המספרים הנמוכים של תאים נוכח רקמות הרירית ואת הקושי קבלת דגימות רקמה אנושית. DCs נחקרו על והשפלתם באמצעות אימונוהיסטוכימיה5,6, אשר מודיע על המיקום תאים בתוך הרקמה, אבל מונע מחקרים פונקציונלי, מוגבל במספר זיהוי סמנים התא מסוגל לנתח בעת ובעונה אחת. יתר על כן, תא בודד בידוד פרוטוקולים עבור ניתוח תזרים cytometric כבר מפותחת7,8,9. כמה מהפרוטוקולים האלה לנצל יכולת הנדידה של בקרי קבוצת מחשבים לבודד תאים אלה זה להעביר. שיטות אלה בדרך כלל דורשים incubations לילה ומבחר DCs מופעל, אך אינם מאפשרים את המחקר של בקרי קבוצת מחשבים במצב יציב.
כאן, אנחנו באמצעות דגימות כריתת רחם, אופטימיזציה פרוטוקול כדי לבודד DCs מאתרי אנטומי שונה והשפלתם, רירית הרחם (EM), בלוטת endocervix (CX), ectocervix (ECX), המאפשרת ניתוח פנוטיפיות שהיו קיימות בעבר וגם פונקציונלי. באמצעות פרוטוקול שאינו הפרוטאוליטי עיכול אנזימטי, נוכל להתקדם מיד לאחר מערכת העיכול הרקמה תא בידוד ואת זרימת cytometric אפיון ללא הפעלה תא באמצעות cytometry זרימה ססגוניות והתאמת פונקציונלי ללימודי מספר נמוך של תאים, אנחנו יכולים לזהות ולאפיין נדיר קבוצות משנה של בקרי קבוצת מחשבים באתרים שונים של FRT.
Protocol
Representative Results
Discussion
DCs הרירית הם אוכלוסיה תא נדיר מאוד מושפעת הסביבה רקמות, אשר משנה פנוטיפ והתפקוד שלהם, ברגע שהם מזינים את הרקמות3. בעוד דם נגזר DCs הם מודל שימושי מאוד, הם אינם מייצגים את המגוון של אוכלוסיות DC נמצאו ברקמות באופן מלא. לכן, כדי להבין את המאפיינים הייחודיים של הרירית DCs, בידוד תאי העיק…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המחקר נתמך על ידי NIH מעניקה AI102838 ו- AI117739 (CRW). אנו מודים Rossoll ריצ’רד לקבלת סיוע טכני. ניתוח תזרים cytometric בוצע ב DartLab, המשאב המשותף בשעה Dartmouthsupported על ידי (P30CA023108-37) ו- (P30GM103415-15).
Materials
| Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) | Hyclone | SH30015.03 | |
| Penicillin-streptomycin | Hyclone | SV30010 | |
| HEPES (1M) | Hyclone | 15630-080 | |
| Collagenase IV | Sigma | C5138 | |
| Deoxyribonuclease I | Worthington Biochemical | LS002140 | |
| D-glucose | Sigma Aldritch | 50-99-7 | |
| 0.22 um Stericup 500 mL filter | Millipore | SCGPU05RE | |
| 100mm x 15mm polystyrene petri dish | Fisherbrand | FB0875712 | |
| 150mm x 15mm polystyrene petri dish | Fisherbrand | FB0875714 | |
| 150mm x 25mm polystyrene dish | Corning | 430599 | Treated cell culture dish |
| Isotemp Incubator | Fisher Scientific | FICO3500TABB | 5.0% CO2 |
| American Rotator V | American DADE | R4140 | |
| 250 um nylon mesh | Sefar | 03-250/50 | |
| 20 um nylon mesh | Sefar | 03-20/14 | |
| Beckman GS-6R Centrifuge | Beckman | 358702 | |
| X-VIVO 15 with Gentamicin L-Gln, Phenol Red, 1 L | Lonza | 04-418Q | |
| Human AB Serum | Valley Biomedical | HP1022 | |
| Histopaque-1077 | Sigma Aldritch | 10771 | |
| Phosphate Buffer Solution (PBS) | National Diagnostics | CL-253 | pH 7.4 |
| Dead Cell Removal Kit | Miltenyi Biotec | 130-090-101 | |
| Pre-separation filter (30um) | Miltenyi Biotec | 130-041-407 | |
| LS column | Miltenyi Biotec | 130-042-410 | |
| Quadro MACS Separator | Miltenyi Biotec | 130-090-976 | |
| MACS multi-stand | Miltenyi Biotec | 130-042-303 | |
| EDTA | USB | 15694 | |
| CD1a Microbeads, human | Miltenyi Biotec | 130-051-001 | |
| CD14 Microbeads, human | Miltenyi Biotec | 130-050-201 | |
| eFluor 670 cell proliferation dye | eBiosciences | 65-0840-85 | |
| 96 well round bottom plate | Falcon | 9/8/2866 | |
| Zombie yellow viability dye | Biolegend | 423104 | |
| CD3 APC/Cy7, anti-human | Tonbo Biosciences | 25-0038-T100 | |
| CD4 PE, anti-human | eBiosciences | 12-0048-42 | |
| CD8a FITC, anti-human | Tonbo Biosciences | 35-0086-T100 | |
| Gallios Flow Cytometer | Beckman Coulter Life Sciences | B43618 | 10 color, VBR |
| MACSquant Analyzer 10 | Miltenyi Biotec | 130-096-343 | 8 color, VBR |
References
- Wira, C. R., Rodriguez-Garcia, M., Patel, M. V. The role of sex hormones in immune protection of the female reproductive tract. Nat Rev Immunol. 15 (4), 217-230 (2015).
- Banchereau, J., Steinman, R. M. Dendritic cells and the control of immunity. Nature. 392 (6673), 245-252 (1998).
- Schlitzer, A., McGovern, N., Ginhoux, F. Dendritic cells and monocyte-derived cells: Two complementary and integrated functional systems. Semin Cell Dev Biol. 41, 9-22 (2015).
- Tagliani, E., Erlebacher, A. Dendritic cell function at the maternal-fetal interface. Expert Rev Clin Immunol. 7 (5), 593-602 (2011).
- Kaldensjo, T., et al. Detection of intraepithelial and stromal Langerin and CCR5 positive cells in the human endometrium: potential targets for HIV infection. PLoS One. 6 (6), e21344 (2011).
- Schulke, L., Manconi, F., Markham, R., Fraser, I. S. Endometrial dendritic cell populations during the normal menstrual cycle. Hum Reprod. 23 (7), 1574-1580 (2008).
- Ballweber, L., et al. Vaginal langerhans cells nonproductively transporting HIV-1 mediate infection of T cells. J Virol. 85 (24), 13443-13447 (2011).
- Hladik, F., et al. Initial events in establishing vaginal entry and infection by human immunodeficiency virus type-1. Immunity. 26 (2), 257-270 (2007).
- Duluc, D., et al. Functional diversity of human vaginal APC subsets in directing T-cell responses. Mucosal Immunol. 6 (3), 626-638 (2013).
- Herzenberg, L. A., Tung, J., Moore, W. A., Parks, D. R. Interpreting flow cytometry data: a guide for the perplexed. Nat Immunol. 7 (7), 681-685 (2006).
- Juno, J. A., Boily-Larouche, G., Lajoie, J., Fowke, K. R. Collection, isolation, and flow cytometric analysis of human endocervical samples. J Vis Exp. (89), (2014).
- Givan, A. L., et al. Flow cytometric analysis of leukocytes in the human female reproductive tract: comparison of fallopian tube, uterus, cervix, and vagina. Am J Reprod Immunol. 38 (5), 350-359 (1997).
- Rodriguez-Garcia, M., et al. Dendritic cells from the human female reproductive tract rapidly capture and respond to HIV. Mucosal Immunol. 10 (2), 531-544 (2017).
- Rodriguez-Garcia, M., Barr, F. D., Crist, S. G., Fahey, J. V., Wira, C. R. Phenotype and susceptibility to HIV infection of CD4+ Th17 cells in the human female reproductive tract. Mucosal Immunol. 7 (6), 1375-1385 (2014).
- Shen, Z., Rodriguez-Garcia, M., Ochsenbauer, C., Wira, C. R. Characterization of immune cells and infection by HIV in human ovarian tissues. Am J Reprod Immunol. , (2017).
