大量の骨髄前駆細胞と新規セルソーティング戦略を使用してマウスの骨髄から樹状細胞前駆体の生成
Summary
ここを識別し、分離 GM-CSF 駆動高速セルの並べ替えを使用して骨髄の細胞数が多いためメソッドを提供します。5 つの異なる集団 (一般的な骨髄前駆細胞、顆粒球/マクロファージ前駆細胞、単球、単球由来マクロファージおよび単球由来の Dc) は、Ly6C と CD115 の式に基づいて識別できます。
Abstract
単球由来樹状細胞の (研) 顆粒球マクロファージコロニー コロニー刺激因子 (GM-CSF) を使用してマウスの骨髄から生成された文化は、前に認めよりコンピューターが混在する最近認識されています。これらの文化は、日常的に、研も単球由来マクロファージ (moMac)、および単球なども、いくつかの発展途上の細胞に含まれています。このプロトコルの目的は、固有の機能をさらに調査する場合がありますので、彼らが発展するにつれてこれらの文化内にある多くの細胞型の分離・同定のため一貫した方法を提供することです。ここに示す並べ替えの戦略は、どちらとして表され、一過性細胞によって彼らは GM 主導 CSF のカルチャーで開発の Ly6C と CD115、式に基づいて 4 つの集団にまず細胞を分離します。これらの 4 つの集団には、一般的な骨髄前駆細胞または CMP (Ly6C-、CD115-)、顆粒球・ マクロファージ前駆細胞または GMP (Ly6C +、CD115-)、(Ly6C +、CD115 +)、単球と単球由来マクロファージ moMac (Ly6C-、CD115 +) が含まれます。CD11c、Ly6C-、CD115-人口内の 2 つの集団を区別するために並べ替え方法も追加されます: CMP (CD11c-) と研 (CD11c +)。最後に、2 つの集団が内 Ly6C-、CD115 + 人口 MHC クラス II 式のレベルに基づいて更に区別されます。MoMacs 単球由来 DC 前駆体 (べき乗剰余 moDP) 表現上の MHC クラス II MHC のクラス II の低レベルを表現します。このメソッドは、様々 な機能と発達的分析のための十分な数字でいくつかの発達の異なる集団の信頼性の高い分離できます。我々 は 1 つのようなの機能読み出し、認識分子パターン (PAMPs) 刺激に対するこれらの細胞型の差動応答を強調表示します。
Introduction
サイトカインによるマウス骨髄細胞培養顆粒球マクロファージコロニー コロニー刺激因子 (GM-CSF) 広くメソッドとして生成される単球由来樹状細胞 (研; として知られている炎症性 DC) 多数1、 2,3,4,5。これらの細胞は、樹状細胞 (DC) 関数6,7,8の研究の様々 な非常に便利されています。通常、これらのマウス骨髄細胞培養は、6-8 日、樹状細胞機能5研究されます。これらの文化くらいと考えられていたほとんど均質な差別化研の大半から成る。最近では、この 6-8 日間の培養期間の終わりに、ある差別化された単球由来マクロファージ (moMacs) 9,10,11の大規模なサブセットと同様に、実際に多くの研が明らかになった。当社独自の調査はさらに研前駆体 (べき乗剰余 moDP)、単球などの以下の先進細胞の他のサブセットは、7 日間10後も低周波で文化に残ることを示すこれらの調査結果を拡張しています。したがって、このシステムによって生成された細胞を用いて樹状細胞 (DC) 機能の研究は感謝して以前よりも種類の細胞のより広範なコホートの応答を反映できます。
GM CSF 生成研分化12,13,14の最終段階でこれらの細胞の機能に関するの研究から多く学びました。しかし、我々 はこれらの発達の経路について以下は細胞の2,,1516と発揮する特定方法と時期のなどの機能大幅理解: 病原体関連分子に対する反応性パターン (PAMPs)、貪食能、抗原処理とプレゼンテーション13、および抗菌活性。従来 Flt3L 駆動 DC 前駆細胞および前駆物質の多数の隔離のためのプロトコルは、報告された17をなっています。Carboxyfluorescein サクシニミジルエステル (CFSE) を使用して、これらの異なる集団の分離が実現された-染色骨髄細胞 (分裂細胞を追跡) して 3 日間の Flt3L 文化。セルされ系統陽性細胞の枯渇、CD11c 式17に基づく前駆細胞および前駆体の個体群に分類します。GM 主導 CSF のカルチャーで DC の初期の前駆細胞を識別するために Leenen のグループによって別アプローチ CD31 と Ly6C 18に基づいてセルを並べ替えることでした。当初の目標は、前駆細胞と GM 主導 CSF 研の前駆体を得るための同様のメソッドを作成することでした。GM-CSF によって生成された特定の細胞の種類によるアプローチと戦略開発の序盤とそれ以降の段階で表現された分子の式に基づいてを並べ替えを適応しました。我々 は最終的にことを決定した Ly6C、CD115 (CSF 1 受容体)、CD11c 10型用のこれらのセルを区別するため最高のマーカー。
ここでは、GM-CSF による分化の経路に沿って開発のいくつかの異なる段階で細胞の分離法を提案する: 一般的な骨髄前駆細胞 (CMP)、顆粒球・ マクロファージ前駆細胞 (GMP)、単球、単球由来マクロファージ(MoMac) および単球由来 DC (研)。MoMac 人口さらに分離できますベース MHC クラス II 式のレベルで明らかに研前駆体人口 (べき乗剰余 moDP) 10。高速蛍光活性化セル (FACS) の Ly6C、CD115、および CD11c 表現に基づくこれらの 5 個体群を分離する戦略を並べ替えを利用します。そう、種緑化刺激への応答を明らかに機能アッセイにおけるこれらの細胞の検討を示します。
Protocol
Representative Results
Discussion
このプロトコルは細胞機能体外、または注入の生体内の生化学的アッセイを含む分析のいくつかのタイプの十分な数の GM 主導 CSF 前駆細胞および前駆細胞型の分離を促進します。このメソッドより一般的に信頼性の高い分離とこの経路のそれらの分化細胞の種類と同様に、開発の早い段階で細胞の同定を可能にする単球由来樹状細胞の開発の分野で重要な進歩を表します先行研?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
アリソン教会鳥で、オーバーン大学学校の獣医流れ Cytometry 施設は、オーバーン大学細胞分子生物学専攻する EHS R15 R15 AI107773 と NIH からの資金からの技術支援に感謝しております夏に PBR に研究資金。
Materials
| RPMI 1640 | Corning | 15-040-CV | |
| Fetal Calf Serum (FCS) | HyClone | SV30014.04 | to supplement complete medium and FWB |
| GlutaMAX | Gibco | 35050 | to supplement complete medium |
| 2-mercaptoethanol (2-ME) | MP Biomedical | 190242 | to supplement complete medium |
| 75mM Vacuum Filter | Thermo Scientific | 156-4045 | to sterilize complete media |
| ACK Lysis Buffer | Lonza | 10-548E | to lyse red blood cell |
| HEPES buffer | Corning | 21-020-CM | to rescue leukocytes after red blood cell lysis |
| Phosphate Buffered Saline (PBS), Dulbecco's | Lonza | 17-512F | must be endotoxin free; chilled at 4 °C |
| 35µm Cell filter | Falcon | 352235 | to break apart clumps before running through cytometer. |
| GM-CSF | Biosource | PMC2011 | usable concentration of 10ng/mL |
| Tissue cultured treated plate | VWR | 10062-896 | for bone marrow cells after harvest |
| Anti-Ly6C, Clone HK1.4 | Biolegend | 128018 | |
| Anti-CD115, Clone AFS98 | Tonbo Bioscience | 20-1152-U100 | |
| Anti-CD11c, Clone HL3 | BD Biosciences | 557400 | to differeniate CMP and MoDCs |
| MoFlo XPD Flow Cytometer | Beckman Coulter | ML99030 | |
| BD Accuri C6 | BD Biosciences | 660517 | |
| 100% Ethanol | Pharmco-Aaper | 111000200CSPP | |
| 60mm Petri Dish | Corning, Inc | 353002 | |
| 50mL Conical tube | VWR | 21008-242 | |
| C57BL/6 Mice | The Jackson Laboratory | 000664 | Female; 10-20 weeks old |
| Biosafety Hood | Thermo Scientific | 8354-30-0011 | |
| 10mL Syringe | BD Biosciences | 301604 | |
| 23-gauge needle | BD Biosciences | 305145 | |
| Centrifuge 5810 R | eppendorf | 22625501 | |
| FlowJo Software v10 | BD Biosciences | Version 10 | flowjo.com |
References
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