Generazione di un gran numero di progenitori mieloidi e precursori delle cellule dendritiche dal midollo osseo murino utilizzando una romanzo cella ordinamento strategia
Summary
Qui forniamo un metodo per identificare e isolare un numero elevato di GM-CSF guidato cellule mieloidi utilizzando l’ordinamento delle cellule ad alta velocità. Cinque popolazioni distinte (comune dei progenitori mieloidi, progenitori del granulocita/macrofago, monociti, macrofagi monocito-derivati e DCs monocito-derivato) possono essere identificati sulla base di Ly6C e CD115 espressione.
Abstract
Colture di cellule dentritiche monocito-derivate (moDC) generate dal midollo osseo di topo usando fattore stimolante della Colonia del Granulocyte-macrofago (GM-CSF) recentemente sono stati riconosciuti per essere più eterogeneo quanto precedentemente apprezzato. Queste culture contengono ordinariamente moDC pure monocito-derivate macrofagi (moMac) e anche alcune cellule meno sviluppate come monociti. L’obiettivo del presente protocollo è quello di fornire un metodo coerente per l’identificazione e la separazione tra i molti tipi di cellule presenti in queste culture come si sviluppano, in modo che loro specifiche funzioni possono essere ulteriormente approfonditi. L’ordinamento strategia presentata qui separa cellule in primo luogo in quattro popolazioni basati sull’espressione di Ly6C e CD115, entrambi i quali sono espressi transitoriamente dalle cellule come si sviluppano nella cultura di GM-CSF-guidato. Questi quattro popolazioni includono comuni dei progenitori mieloidi o CMP (Ly6C-, CD115-), dei progenitori del granulocita/macrofago o GMP (Ly6C +, CD115-), monociti (Ly6C +, CD115 +) e macrofagi monocito-derivati o moMac (Ly6C-, CD115 +). CD11c viene aggiunto anche alla strategia di ordinamento per distinguere due popolazioni entro il Ly6C-, CD115-popolazione: CMP (CD11c-) e moDC (CD11c +). Infine, due popolazioni possono essere ulteriormente distinto all’interno del Ly6C-, CD115 + popolazione sulla base del livello di espressione II MHC di classe. MoMacs esprimere livelli più bassi di MHC di classe II, mentre un precursore di DC monocito-derivate (moDP) esprime maggiore MHC di classe II. Questo metodo consente l’isolamento affidabile delle diverse popolazioni inerente allo sviluppo distinte nei numeri sufficiente per una varietà di analisi funzionale e sviluppo. Evidenziamo una tale lettura funzionale, le risposte differenziali di questi tipi di cellule alla stimolazione con Pathogen-Associated Molecular Patterns (PAMPs).
Introduction
Coltura delle cellule del midollo osseo murino con la citochina fattore stimolante della Colonia del Granulocyte-macrofago (GM-CSF) è ampiamente usato come un metodo per generare cellule dentritiche monocito-derivate (moDC; anche conosciuto come infiammatorie DC) in gran numero 1, 2,3,4,5. Queste cellule sono stati estremamente utili in una varietà di studi di cellule dendritiche (DC) funzione 6,7,8. In genere, queste cellule del midollo osseo murino sono coltivate per 6-8 giorni e vengono quindi utilizzate per lo studio di cellule dendritiche funzione 5. Queste culture erano stato a lungo considerate per lo più omogenee, costituito da una maggioranza di moDC differenziato. Più recentemente, è diventato chiaro che alla fine di questo periodo di cultura di 6 – 8 giorni, ci sono infatti molti moDC, come pure un grande sottoinsieme di macrofagi monocito-derivati differenziati (moMacs) 9,10,11. Nostri studi hanno esteso ulteriormente questi risultati dimostrando che altri sottoinsiemi di meno cellule sviluppate, quali precursori moDC (moDP) e monociti, rimangono nelle culture a bassa frequenza anche dopo 7 giorni 10. Così, gli studi di funzione di cellule dendritiche (DC) utilizzando le cellule generate da questo sistema potrebbero riflettere le risposte di una coorte più ampia di tipi di cellule che precedentemente apprezzato.
Abbiamo imparato molto dallo studio di GM-CSF-generato moDC relativa alla funzione di queste cellule nelle fasi finali di differenziazione 12,13,14. Tuttavia, ci rendiamo conto significativamente meno circa la via dello sviluppo di queste cellule 2,15,16 e di come e quando essi presentano specifiche funzioni come: la risposta di Pathogen Associated Molecular Modelli (PAMPs), fagocitosi, antigene elaborazione e presentazione 13e attività anti-batterica. Un protocollo per l’isolamento di un gran numero di convenzionali basate su Flt3L DC progenitori e precursori è stato segnalato 17. Isolamento di queste popolazioni distinte è stata ottenuta utilizzando carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE)-macchiato le cellule del midollo osseo (per tenere traccia di divisione delle cellule) e la cultura in Flt3L per 3 giorni. Le cellule erano quindi impoverite di cellule positive linage e ordinate in popolazioni progenitore e precursore basati su CD11c espressione 17. Un altro approccio di gruppo di vittoria per identificare i primi progenitori di DC in GM-CSF-driven cultura doveva ordinare celle basate su CD31 e Ly6C 18. L’obiettivo iniziale era quello di creare un metodo simile per l’ottenimento dei progenitori e precursori di GM-CSF-driven moDC. A causa dei tipi cellulari specifici generati da GM-CSF, abbiamo adattato l’approccio e l’ordinamento di strategia basata sull’espressione di molecole che sono state espresse alle fasi iniziali e successive di sviluppo. Abbiamo determinato in ultima analisi, che Ly6C, CD115 (recettore CSF-1), e CD11c erano i migliori marcatori per distinguere queste cellule tipi 10.
Qui, presentiamo un metodo per l’isolamento delle cellule alle diverse fasi di sviluppo lungo la via della differenziazione guidato da GM-CSF: monocito progenitore mieloide comune (CMP), progenitore del Granulocyte-macrofago (GMP), dei macrofagi monocito-derivati (MoMac) e monocito-derivate DC (MoDC). La popolazione di moMac possa essere ulteriormente suddivise basata sul livello di MHC classe espressione II, rivelando un moDC precursore della popolazione (moDP) 10. Utilizziamo una cella ad alta velocità di fluorescenza-attivato l’ordinamento di strategia (FACS) per isolare questi 5 popolazioni basate sull’espressione di Ly6C e CD115 CD11c. Dimostriamo quindi l’esame di queste cellule in saggi funzionali, rivelando le loro risposte alla stimolazione di PAMP.
Protocol
Representative Results
Discussion
Questo protocollo facilita l’isolamento di tipi GM-CSF-driven progenitore e precursore delle cellule in numero sufficiente per diversi tipi di analisi tra cui analisi biochimiche, analisi di funzione cellulare in vitroo in vivodi instillazione. Questo metodo rappresenta un significativo passo avanti nel campo dello sviluppo delle cellule dendritiche monocito-derivate, consentendo l’affidabile isolamento e identificazione di cellule presto in questa via di sviluppo, come pure quei tipi di cellula differe…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Siamo grati per l’assistenza tecnica da Alison Chiesa uccello alla Auburn University scuola di medicina veterinaria flusso Cytometry Facility, per finanziamenti dal NIH per EHS R15 R15 AI107773 e per il cellulare e il programma di biologia molecolare all’Università di Auburn di estate finanziamento della ricerca di PBR.
Materials
| RPMI 1640 | Corning | 15-040-CV | |
| Fetal Calf Serum (FCS) | HyClone | SV30014.04 | to supplement complete medium and FWB |
| GlutaMAX | Gibco | 35050 | to supplement complete medium |
| 2-mercaptoethanol (2-ME) | MP Biomedical | 190242 | to supplement complete medium |
| 75mM Vacuum Filter | Thermo Scientific | 156-4045 | to sterilize complete media |
| ACK Lysis Buffer | Lonza | 10-548E | to lyse red blood cell |
| HEPES buffer | Corning | 21-020-CM | to rescue leukocytes after red blood cell lysis |
| Phosphate Buffered Saline (PBS), Dulbecco's | Lonza | 17-512F | must be endotoxin free; chilled at 4 °C |
| 35µm Cell filter | Falcon | 352235 | to break apart clumps before running through cytometer. |
| GM-CSF | Biosource | PMC2011 | usable concentration of 10ng/mL |
| Tissue cultured treated plate | VWR | 10062-896 | for bone marrow cells after harvest |
| Anti-Ly6C, Clone HK1.4 | Biolegend | 128018 | |
| Anti-CD115, Clone AFS98 | Tonbo Bioscience | 20-1152-U100 | |
| Anti-CD11c, Clone HL3 | BD Biosciences | 557400 | to differeniate CMP and MoDCs |
| MoFlo XPD Flow Cytometer | Beckman Coulter | ML99030 | |
| BD Accuri C6 | BD Biosciences | 660517 | |
| 100% Ethanol | Pharmco-Aaper | 111000200CSPP | |
| 60mm Petri Dish | Corning, Inc | 353002 | |
| 50mL Conical tube | VWR | 21008-242 | |
| C57BL/6 Mice | The Jackson Laboratory | 000664 | Female; 10-20 weeks old |
| Biosafety Hood | Thermo Scientific | 8354-30-0011 | |
| 10mL Syringe | BD Biosciences | 301604 | |
| 23-gauge needle | BD Biosciences | 305145 | |
| Centrifuge 5810 R | eppendorf | 22625501 | |
| FlowJo Software v10 | BD Biosciences | Version 10 | flowjo.com |
References
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