Generatie van grote aantallen van myeloïde voorlopercellen en dendritische cel precursoren uit lymfkliertest beenmerg met behulp van een nieuwe cel sorteren van strategie
Summary
Hier bieden we een methode voor het vaststellen en isoleren van grote aantallen van GM-CSF gedreven myeloïde cellen met hoge snelheid cel sorteren. Vijf verschillende populaties (gemeenschappelijk myeloïde voorlopercellen, granulocyt/macrofaag progenitoren monocyten, monocyt-afgeleide macrofagen en monocyt-afgeleide DCs) kunnen worden geïdentificeerd op basis van Ly6C en CD115 expressie.
Abstract
Culturen van monocyt-afgeleide dendritische cellen (moDC) gegenereerd uit beenmerg van de muis met behulp van granulocyt-Macrophage kolonie stimulerende Factor (GM-CSF) zijn onlangs bekroond meer een heterogeen beeld vertonen dan eerder gewaardeerd. Deze culturen worden routinematig moDC evenals monocyt-afgeleide macrofagen (moMac) en zelfs sommige minder ontwikkelde cellen zoals monocyten bevatten. Het doel van dit protocol is bedoeld als een consistente methode voor de identificatie en de scheiding van de vele celtypes aanwezig in deze culturen zoals zij ontwikkelen, zodat hun specifieke taken kunnen verder worden onderzocht. De sorteer-strategie gepresenteerde scheidt cellen eerst in vier bevolkingsgroepen op basis van uitdrukking van Ly6C en CD115, die beide worden uitgedruct in Transient door cellen ontwikkelen ze in GM-CSF-gedreven cultuur. Deze vier populaties omvatten gemeenschappelijke myeloïde voorlopercellen of CMP (Ly6C-, CD115-), granulocyt/macrofaag progenitoren of GMP (Ly6C +, CD115-), monocyten (Ly6C +, CD115 +), en macrofagen monocyt-afgeleide of moMac (Ly6C-, CD115 +). CD11c wordt ook toegevoegd aan het sorteren strategie om te onderscheiden van de twee bevolkingsgroepen binnen de Ly6C-, CD115-bevolking: CMP (CD11c-) en moDC (CD11c +). Tot slot kunnen twee populaties verder worden onderscheiden binnen de Ly6C-, CD115 + bevolking op basis van het niveau van de MHC klasse II expressie. MoMacs express lagere niveaus van MHC klasse II, terwijl een monocyt-afgeleide DC voorloper (moDP) hogere MHC klasse II spreekt. Deze methode zorgt voor de betrouwbare isolatie van verschillende ontwikkelingsachterstand verschillende populaties in getallen voldoende voor een scala aan functionele en developmental analyses. We benadrukken dat een dergelijke functionele uitlezing, de differentiële reacties van dit type cel op stimulatie met Pathogen-Associated moleculaire patronen (PAMPs).
Introduction
Kweken van lymfkliertest beenmergcellen met de cytokine wordt granulocyt-Macrophage kolonie stimulerende Factor (GM-CSF) veel gebruikt als een methode voor het genereren van monocyt-afgeleide dendritische cellen (moDC; ook bekend als inflammatoire DC) in grote aantallen 1, 2,3,4,5. Deze cellen zijn uiterst nuttig in een aantal studies van dendritische cellen (DC) functie 6,7,8. Meestal deze lymfkliertest beenmergcellen zijn gekweekte voor 6-8 dagen en worden vervolgens gebruikt voor de studie van dendritische cel functie 5. Deze culturen had lang beschouwd als meestal homogene, bestaande uit een meerderheid van gedifferentieerde moDC. Meer recentelijk is gebleken dat aan het einde van deze periode van 6-8 dagen cultuur, er inderdaad vele moDC, evenals een grote subset van gedifferentieerde monocyt-afgeleide macrofagen (moMacs) 9,10,11 zijn. Onze eigen studies hebben deze bevindingen aan te tonen dat andere deelverzamelingen van minder ontwikkelde cellen, zoals moDC precursoren (moDP) en monocyten, zelfs na 7 dagen 10in de culturen met lage frequentie blijven verder uitgebreid. Aldus, kon studies van dendritische cellen (DC) functie met behulp van cellen die zijn gegenereerd door dit systeem de reacties van een bredere cohort van celtypes weerspiegelen dan eerder gewaardeerd.
We hebben veel geleerd uit de studie van GM-CSF-gegenereerd moDC met betrekking tot de functie van deze cellen in de laatste stadia van differentiatie 12,13,14. Wij begrijpen echter aanzienlijk minder over de ontwikkelings traject van deze cellen 2,15,16 en van hoe en wanneer zij specifieke vertonen functies zoals: Pathogen verbonden moleculaire klantgerichtheid Patronen (PAMPs), fagocytose, antigeen processing en presentatie 13en anti-bacteriële activiteit. Een protocol voor het isoleren van grote aantallen van conventionele Flt3L-gedreven DC progenitoren en precursoren geweest gerapporteerde 17. Isolatie van deze verschillende populaties tot stand gekomen met behulp van carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE)-gekleurd beenmergcellen (voor het bijhouden van scheidslijn cellen) en cultuur in Flt3L voor 3 dagen. Cellen werden dan uitgeput van linage positieve cellen en gesorteerd in voorlopercellen en voorloper populaties op basis van CD11c expressie 17. Een andere benadering van Leenen de Fractie op het identificeren van vroege progenitorcellen van DC in GM-CSF-gedreven cultuur moest sorteren van cellen op basis van CD31 en Ly6C 18. Het oorspronkelijke doel was om een soortgelijke methode voor het verkrijgen van de progenitoren en precursoren van GM-CSF-gedreven moDC. Als gevolg van de specifieke celtypes gegenereerd door GM-CSF, aangepast we de aanpak en sorteren van de strategie die gebaseerd is op de expressie van de moleculen die werden uitgedrukt in vroege en latere stadia van ontwikkeling. We uiteindelijk vastgesteld dat Ly6C, CD115 (CSF-1-receptor), en CD11c waren de beste markers voor 10onderscheiden deze cel typen.
Hier presenteren we een methode voor het isoleren van cellen in meerdere verschillende stadia van ontwikkeling langs het traject van differentiatie gedreven door GM-CSF: gemeenschappelijke myeloïde voorlopercellen (CMP), granulocyt-Macrophage voorlopercellen (GMP), monocyt, monocyt-afgeleide Macrophage (MoMac) en monocyt-afgeleide DC (MoDC). De moMac bevolking kan worden verder gescheiden gebaseerd op niveau van MHC klasse II expressie, onthullend een moDC voorloper bevolking (moDP) 10. Wij gebruiken een high-speed fluorescentie-activated cell sorting (FACS) strategie om te isoleren van deze 5 bevolkingsgroepen op basis van expressie van Ly6C, CD115 en CD11c. Wij tonen dan de behandeling van deze cellen in functionele assays onthullen hun reacties op PAMP stimulatie.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dit protocol vergemakkelijkt isolatie van GM-CSF-driven voorlopercellen en voorloper celtypes in getallen voldoende voor verschillende soorten analyses met inbegrip van biochemische testen, testen van cellulaire functie in vitroof instillation in vivo. Deze methode vertegenwoordigt een belangrijke stap voorwaarts op het gebied van monocyt-afgeleide dendritische cel ontwikkeling, waardoor de betrouwbare isolatie en identificatie van cellen in het begin van dit traject van ontwikkeling, alsook deze gediff…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We zijn dankbaar voor de technische bijstand van Alison kerk Bird op de Auburn University School van diergeneeskunde Stroom Cytometry faciliteit, voor financiering uit de NIH EHS R15 R15 AI107773 en naar de cellulaire en moleculaire biologie programma aan de Universiteit van Auburn voor de zomer onderzoekssteun aan PBR.
Materials
| RPMI 1640 | Corning | 15-040-CV | |
| Fetal Calf Serum (FCS) | HyClone | SV30014.04 | to supplement complete medium and FWB |
| GlutaMAX | Gibco | 35050 | to supplement complete medium |
| 2-mercaptoethanol (2-ME) | MP Biomedical | 190242 | to supplement complete medium |
| 75mM Vacuum Filter | Thermo Scientific | 156-4045 | to sterilize complete media |
| ACK Lysis Buffer | Lonza | 10-548E | to lyse red blood cell |
| HEPES buffer | Corning | 21-020-CM | to rescue leukocytes after red blood cell lysis |
| Phosphate Buffered Saline (PBS), Dulbecco's | Lonza | 17-512F | must be endotoxin free; chilled at 4 °C |
| 35µm Cell filter | Falcon | 352235 | to break apart clumps before running through cytometer. |
| GM-CSF | Biosource | PMC2011 | usable concentration of 10ng/mL |
| Tissue cultured treated plate | VWR | 10062-896 | for bone marrow cells after harvest |
| Anti-Ly6C, Clone HK1.4 | Biolegend | 128018 | |
| Anti-CD115, Clone AFS98 | Tonbo Bioscience | 20-1152-U100 | |
| Anti-CD11c, Clone HL3 | BD Biosciences | 557400 | to differeniate CMP and MoDCs |
| MoFlo XPD Flow Cytometer | Beckman Coulter | ML99030 | |
| BD Accuri C6 | BD Biosciences | 660517 | |
| 100% Ethanol | Pharmco-Aaper | 111000200CSPP | |
| 60mm Petri Dish | Corning, Inc | 353002 | |
| 50mL Conical tube | VWR | 21008-242 | |
| C57BL/6 Mice | The Jackson Laboratory | 000664 | Female; 10-20 weeks old |
| Biosafety Hood | Thermo Scientific | 8354-30-0011 | |
| 10mL Syringe | BD Biosciences | 301604 | |
| 23-gauge needle | BD Biosciences | 305145 | |
| Centrifuge 5810 R | eppendorf | 22625501 | |
| FlowJo Software v10 | BD Biosciences | Version 10 | flowjo.com |
References
- Zhan, Y., Xu, Y., Lew, A. M. The regulation of the development and function of dendritic cell subsets by GM-CSF: more than a hematopoietic growth factor. Mol Immunol. 52, 30-37 (2012).
- Zhan, Y., et al. The inflammatory cytokine, GM-CSF, alters the developmental outcome of murine dendritic cells. Eur J Immunol. , (2012).
- van de Laar, L., Coffer, P. J., Woltman, A. M. Regulation of dendritic cell development by GM-CSF: molecular control and implications for immune homeostasis and therapy. Blood. 119, 3383-3393 (2012).
- Steinman, R. M., Inaba, K. Myeloid dendritic cells. J Leukoc Biol. 66, 205-208 (1999).
- Inaba, K., et al. Generation of large numbers of dendritic cells from mouse bone marrow cultures supplemented with granulocyte/macrophage colony-stimulating factor. J Exp Med. 176, 1693-1702 (1992).
- Steinman, R. M., Pack, M., Inaba, K. Dendritic cell development and maturation. Adv Exp Med Biol. , 1-6 (1997).
- Pierre, P., et al. Developmental regulation of MHC class II transport in mouse dendritic cells. Nature. 388, 787-792 (1997).
- Steinman, R. M., Witmer-Pack, M., Inaba, K. Dendritic cells: antigen presentation, accessory function and clinical relevance. Adv Exp Med Biol. , 1-9 (1993).
- Na, Y. R., Jung, D., Gu, G. J., Seok, S. H. GM-CSF Grown Bone Marrow Derived Cells Are Composed of Phenotypically Different Dendritic Cells and Macrophages. Mol Cells. 39, 734-741 (2016).
- Rogers, P. B., Driessnack, M. G., Hiltbold Schwartz, E. Analysis of the developmental stages, kinetics, and phenotypes exhibited by myeloid cells driven by GM-CSF in vitro. PLoS One. 12, e0181985 (2017).
- Helft, J., et al. GM-CSF Mouse Bone Marrow Cultures Comprise a Heterogeneous Population of CD11c(+)MHCII(+) Macrophages and Dendritic Cells. Immunity. 42, 1197-1211 (2015).
- Alloatti, A., Kotsias, F., Magalhaes, J. G., Amigorena, S. Dendritic cell maturation and cross-presentation: timing matters!. Immunol Rev. 272, 97-108 (2016).
- Jakubzick, C. V., Randolph, G. J., Henson, P. M. Monocyte differentiation and antigen-presenting functions. Nat Rev Immunol. 17, 349-362 (2017).
- Mbongue, J. C., Nieves, H. A., Torrez, T. W., Langridge, W. H. The Role of Dendritic Cell Maturation in the Induction of Insulin-Dependent Diabetes Mellitus. Frontiers in immunology. 8, 327 (2017).
- Shortman, K., Naik, S. H. Steady-state and inflammatory dendritic-cell development. Nat Rev Immunol. 7, 19-30 (2007).
- Xu, Y., Zhan, Y., Lew, A. M., Naik, S. H., Kershaw, M. H. Differential development of murine dendritic cells by GM-CSF versus Flt3 ligand has implications for inflammation and trafficking. J Immunol. 179, 7577-7584 (2007).
- Naik, S. H. Generation of large numbers of pro-DCs and pre-DCs in vitro. Methods Mol Biol. 595, 177-186 (2010).
- Nikolic, T., de Bruijn, M. F., Lutz, M. B., Leenen, P. J. Developmental stages of myeloid dendritic cells in mouse bone marrow. Int Immunol. 15, 515-524 (2003).
- Hettinger, J., et al. Origin of monocytes and macrophages in a committed progenitor. Nat Immunol. 14, 821-830 (2013).
- Fogg, D. K., et al. A clonogenic bone marrow progenitor specific for macrophages and dendritic cells. Science. 311, 83-87 (2006).
- Traver, D., et al. Development of CD8{alpha}-Positive Dendritic Cells from a Common Myeloid Progenitor. Science. 290, 2152-2154 (2000).
