דור מספר גדול של תאים מיאלואידים אבות ו מבשרי תא דנדריטי ממח העצם מאתר באמצעות תא הרומן מיון אסטרטגיה
Summary
כאן אנו מספקים שיטה לזיהוי ובידוד מספר גדול של GM-CSF מונע התאים מיאלואידית באמצעות מיון תא במהירות גבוהה. ניתן לזהות חמש אוכלוסיות נפרדות (אבות מיאלואידית נפוצות גרנולוציט/מקרופאג אבות, ומונוציטים, נגזר מונוציט מקרופאגים, נגזר מונוציט DCs) מבוסס על הביטוי Ly6C ו- CD115.
Abstract
תרבויות נגזר מונוציט תאים דנדריטים (moDC) המופקים מח עצם העכבר באמצעות גרנולוציט-מקרופאג המושבה מגרה פקטור (GM-CSF) הוכרו לאחרונה להיות הטרוגניות יותר מאשר בעבר מוערך. תרבויות אלה מכילים באופן שגרתי moDC גם נגזר מונוציט מקרופאגים (moMac), ואפילו כמה תאים פחות מפותחת כמו ומונוציטים. המטרה של פרוטוקול זה נועד לספק שיטה עקבית עבור זיהוי והפרדה של סוגי תאים רבים נוכח בתרבויות אלו כפי שהם מפתחים, כך הפונקציות הספציפיות שלהם עשויים ייחקר בהמשך. האסטרטגיה מיון המוצגים כאן מפריד תאים תחילה לתוך ארבע אוכלוסיות בהתבסס על הביטוי של Ly6C ו CD115, אשר שניהם באים לידי ביטוי transiently על ידי תאים כפי שהם מפתחים בתרבות מונחה-GM-CSF. אוכלוסיות אלה ארבעה כוללות אבות מיאלואידית נפוצות או CMP (Ly6C-, CD115-.), אבות גרנולוציט/מקרופאג או GMP (Ly6C +, CD115-.), ומונוציטים (Ly6C +, CD115 +), ו מקרופאגים נגזר מונוציט או moMac (Ly6C-, CD115 +.). CD11c נוספה גם אסטרטגיית המיון כדי להבחין בין שתי האוכלוסיות בתוך ה Ly6C-, CD115-האוכלוסייה: CMP (CD11c-), moDC (CD11c +). לבסוף, שתי האוכלוסיות עשויים להבחין נוסף בתוך ה Ly6C-, CD115 + אוכלוסייה בהתבסס על הרמה של מחלקה MHC II הביטוי. MoMacs אקספרס רמות נמוכות יותר של מחלקה MHC II, בעוד הקדמה DC נגזר מונוציט (moDP) מבטא גבוה יותר מחלקה MHC II. שיטה זו מאפשרת בידוד אמין מספר אוכלוסיות שונות מבחינת במספרים מספיק עבור מגוון רחב של ניתוחים פונקציונליים וההתפתחותי. אנחנו מדגישים אחד כזה פונקציונלי את המחוון דיפרנציאלית התגובות אחד מסוגי התאים גירוי עם דפוסים מולקולרית של Pathogen-Associated (PAMPs).
Introduction
Culturing תאי מח עצם מאתר עם ציטוקינים גרנולוציט-מקרופאג המושבה מגרה פקטור (GM-CSF) נעשה שימוש נרחב ככל שיטה לייצר נגזר מונוציט תאים דנדריטים (moDC; ידוע גם בשם DC דלקתיות) מספרים גדולים 1, 2,3,4,5. תאים אלה היה שימושי ביותר במגוון רחב של מחקרים של תא דנדריטי (DC) פונקציה 6,7,8. בדרך כלל, אלו תאים במח העצם מאתר בתרבית למשך 6-8 ימים הינם ואז משמשים למחקר של הפונקציה תא דנדריטי 5. תרבויות אלה היו מזמן נחשב בעיקר הומוגנית, המורכב רוב moDC הבדיל. לאחרונה, כבר ברור כי בסוף תקופה זו תרבות 6-8 יום, ישנם רבים אכן moDC, כמו גם משנה גדולה מתוך הבדיל נגזר מונוציט מקרופאגים (moMacs) 9,10,11. מחקרים שלנו עוד יותר הרחיבו ממצאים אלה מדגימים כי קבוצות אחרות משנה של תאים פחות מפותח, כמו סימנים מקדימים moDC (moDP) ומונוציטים, יישארו בתרבויות בתדר נמוך גם לאחר 7 ימים 10. לכן, מחקרים של תאים דנדריטים (DC) פונקציה באמצעות תאים שנוצרו על-ידי מערכת זו יכול לשקף את התגובות של קבוצה רחבה יותר של סוגי תאים מאשר בעבר מוערך.
למדנו הרבה מאוד מן המחקר של GM-CSF-שנוצר moDC הנוגעים הפונקציה של תאים אלה בשלבים האחרונים של בידול 12,13,14. עם זאת, אנו מבינים באופן משמעותי פחות על מסלול התפתחותי אלה תאים15, 2,16 , של איך ומתי הם מציגים ספציפי פונקציות כגון: היענות הפתוגן הקשורים מולקולרית דפוסי (PAMPs), phagocytosis, עיבוד והצגת אנטיגן 13ועל פעילות אנטי בקטריאלי. פרוטוקול עבור בידוד של מספרים גדולים של אבות DC מבוססת Flt3L המקובלת, מבשרי כבר דווח על 17. בידוד של אוכלוסיות שונות אלה הושג באמצעות אסתר succinimidyl carboxyfluorescein (CFSE)-צבעונית תאים במח העצם (כדי לעקוב אחר תאים החלוקה) ותרבות Flt3L במשך 3 ימים. התאים היו אז דלה של תאים חיובית linage, מתמיינים קדמון לאוכלוסייה קודמן בהתבסס על הביטוי CD11c 17. גישה אחרת על ידי הקבוצה של Leenen כדי לזהות מוקדם המוצא לאגס התרבותי DC בתרבות מונחה-GM-CSF היה כדי למיין התאים בהתאם CD31 ו- Ly6C 18. המטרה הראשונית היתה ליצור שיטה דומה עבור קבלת אבות סימנים מקדימים של moDC מונחה-GM-CSF. בשל סוגי תאים מסוים שנוצר על ידי GM-CSF, שינינו את הגישה ומיון אסטרטגיה המבוססת על הביטוי של מולקולות שבאו לידי ביטוי מוקדם ומאוחר יותר שלבי ההתפתחות. בסופו של דבר קבענו את זה Ly6C, CD115 (קולטן CSF-1), CD11c היו הסמנים הטוב ביותר עבור הבחנה תא אלו סוגי 10.
כאן, אנו מציגים שיטה עבור בידוד של תאים-מספר שלבים של פיתוח לאורך מסלול של בידול מונע על ידי GM-CSF: נפוץ מיאלואידית קדמון (CMP), גרנולוציט-מקרופאג קדמון (GMP), מונוציט, נגזר מונוציט מקרופאג (MoMac), נגזר מונוציט DC (MoDC). האוכלוסייה moMac יכול להיות עוד יותר הפרדה המבוססת על רמה של מחלקה MHC II ביטוי, חשיפת האוכלוסייה (moDP) קודמן 10moDC. אנו מנצלים במהירות גבוהה תא לפעיל על-ידי קרינה פלואורסצנטית מיון (FACS) אסטרטגיה כדי לבודד אוכלוסיות אלה 5 מבוסס על הביטוי של Ly6C, CD115 ו- CD11c. ואז נדגים את הבדיקה של תאים אלה במבחני פונקציונלי חושף את התגובות שלהם PAMP גירוי.
Protocol
Representative Results
Discussion
פרוטוקול זה מאפשר בידוד של מונחי-GM-CSF קדמון, קודמן סוגי תאים במספרים מספיק עבור מספר סוגי ניתוחים כולל מבחני הביוכימי, מבחני תפקוד התאים בתוך חוץ גופיתאו החדרה בתוך vivo. שיטה זו מייצגת התקדמות משמעותית בתחום של פיתוח נגזר מונוציט תא דנדריטי, המאפשר את אמין בידוד וזיהוי של תאים בתחי…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנחנו אסירי תודה על הסיוע הטכני של אליסון הכנסייה ציפור-אובורן אוניברסיטת בית הספר של רפואה וטרינרית לזרום Cytometry המתקן, עבור מימון NIH EHS R15 R15 AI107773, סלולר וביולוגיה מולקולרית לתוכנית ב אוניברסיטת אובורן במשך הקיץ מחקר מימון PBR.
Materials
| RPMI 1640 | Corning | 15-040-CV | |
| Fetal Calf Serum (FCS) | HyClone | SV30014.04 | to supplement complete medium and FWB |
| GlutaMAX | Gibco | 35050 | to supplement complete medium |
| 2-mercaptoethanol (2-ME) | MP Biomedical | 190242 | to supplement complete medium |
| 75mM Vacuum Filter | Thermo Scientific | 156-4045 | to sterilize complete media |
| ACK Lysis Buffer | Lonza | 10-548E | to lyse red blood cell |
| HEPES buffer | Corning | 21-020-CM | to rescue leukocytes after red blood cell lysis |
| Phosphate Buffered Saline (PBS), Dulbecco's | Lonza | 17-512F | must be endotoxin free; chilled at 4 °C |
| 35µm Cell filter | Falcon | 352235 | to break apart clumps before running through cytometer. |
| GM-CSF | Biosource | PMC2011 | usable concentration of 10ng/mL |
| Tissue cultured treated plate | VWR | 10062-896 | for bone marrow cells after harvest |
| Anti-Ly6C, Clone HK1.4 | Biolegend | 128018 | |
| Anti-CD115, Clone AFS98 | Tonbo Bioscience | 20-1152-U100 | |
| Anti-CD11c, Clone HL3 | BD Biosciences | 557400 | to differeniate CMP and MoDCs |
| MoFlo XPD Flow Cytometer | Beckman Coulter | ML99030 | |
| BD Accuri C6 | BD Biosciences | 660517 | |
| 100% Ethanol | Pharmco-Aaper | 111000200CSPP | |
| 60mm Petri Dish | Corning, Inc | 353002 | |
| 50mL Conical tube | VWR | 21008-242 | |
| C57BL/6 Mice | The Jackson Laboratory | 000664 | Female; 10-20 weeks old |
| Biosafety Hood | Thermo Scientific | 8354-30-0011 | |
| 10mL Syringe | BD Biosciences | 301604 | |
| 23-gauge needle | BD Biosciences | 305145 | |
| Centrifuge 5810 R | eppendorf | 22625501 | |
| FlowJo Software v10 | BD Biosciences | Version 10 | flowjo.com |
References
- Zhan, Y., Xu, Y., Lew, A. M. The regulation of the development and function of dendritic cell subsets by GM-CSF: more than a hematopoietic growth factor. Mol Immunol. 52, 30-37 (2012).
- Zhan, Y., et al. The inflammatory cytokine, GM-CSF, alters the developmental outcome of murine dendritic cells. Eur J Immunol. , (2012).
- van de Laar, L., Coffer, P. J., Woltman, A. M. Regulation of dendritic cell development by GM-CSF: molecular control and implications for immune homeostasis and therapy. Blood. 119, 3383-3393 (2012).
- Steinman, R. M., Inaba, K. Myeloid dendritic cells. J Leukoc Biol. 66, 205-208 (1999).
- Inaba, K., et al. Generation of large numbers of dendritic cells from mouse bone marrow cultures supplemented with granulocyte/macrophage colony-stimulating factor. J Exp Med. 176, 1693-1702 (1992).
- Steinman, R. M., Pack, M., Inaba, K. Dendritic cell development and maturation. Adv Exp Med Biol. , 1-6 (1997).
- Pierre, P., et al. Developmental regulation of MHC class II transport in mouse dendritic cells. Nature. 388, 787-792 (1997).
- Steinman, R. M., Witmer-Pack, M., Inaba, K. Dendritic cells: antigen presentation, accessory function and clinical relevance. Adv Exp Med Biol. , 1-9 (1993).
- Na, Y. R., Jung, D., Gu, G. J., Seok, S. H. GM-CSF Grown Bone Marrow Derived Cells Are Composed of Phenotypically Different Dendritic Cells and Macrophages. Mol Cells. 39, 734-741 (2016).
- Rogers, P. B., Driessnack, M. G., Hiltbold Schwartz, E. Analysis of the developmental stages, kinetics, and phenotypes exhibited by myeloid cells driven by GM-CSF in vitro. PLoS One. 12, e0181985 (2017).
- Helft, J., et al. GM-CSF Mouse Bone Marrow Cultures Comprise a Heterogeneous Population of CD11c(+)MHCII(+) Macrophages and Dendritic Cells. Immunity. 42, 1197-1211 (2015).
- Alloatti, A., Kotsias, F., Magalhaes, J. G., Amigorena, S. Dendritic cell maturation and cross-presentation: timing matters!. Immunol Rev. 272, 97-108 (2016).
- Jakubzick, C. V., Randolph, G. J., Henson, P. M. Monocyte differentiation and antigen-presenting functions. Nat Rev Immunol. 17, 349-362 (2017).
- Mbongue, J. C., Nieves, H. A., Torrez, T. W., Langridge, W. H. The Role of Dendritic Cell Maturation in the Induction of Insulin-Dependent Diabetes Mellitus. Frontiers in immunology. 8, 327 (2017).
- Shortman, K., Naik, S. H. Steady-state and inflammatory dendritic-cell development. Nat Rev Immunol. 7, 19-30 (2007).
- Xu, Y., Zhan, Y., Lew, A. M., Naik, S. H., Kershaw, M. H. Differential development of murine dendritic cells by GM-CSF versus Flt3 ligand has implications for inflammation and trafficking. J Immunol. 179, 7577-7584 (2007).
- Naik, S. H. Generation of large numbers of pro-DCs and pre-DCs in vitro. Methods Mol Biol. 595, 177-186 (2010).
- Nikolic, T., de Bruijn, M. F., Lutz, M. B., Leenen, P. J. Developmental stages of myeloid dendritic cells in mouse bone marrow. Int Immunol. 15, 515-524 (2003).
- Hettinger, J., et al. Origin of monocytes and macrophages in a committed progenitor. Nat Immunol. 14, 821-830 (2013).
- Fogg, D. K., et al. A clonogenic bone marrow progenitor specific for macrophages and dendritic cells. Science. 311, 83-87 (2006).
- Traver, D., et al. Development of CD8{alpha}-Positive Dendritic Cells from a Common Myeloid Progenitor. Science. 290, 2152-2154 (2000).
