Поколение большого числа миелоидного прародителями и дендритных клеток прекурсоров из мышиных костного мозга с помощью Роман ячейку Сортировка стратегия
Summary
Здесь мы предоставляем метод для выявления и изоляции большого числа ГМ-КСФ инициативе миелоидных клеток, используя высокую скорость сортировки клеток. Пять различных популяций (общие миелоидного прародителями, предшественники гранулоцитов/макрофагов, моноциты, моноцитарных макрофагов и моноцитарных DCs) могут быть определены на основе Ly6C и CD115 выражения.
Abstract
Культур моноцитарных дендритных клеток (moDC) из костного мозга мыши с помощью гранулоцитарно-макрофагальный колонии стимулирующий фактор (ГМ-КСФ) недавно были признаны быть более неоднородными, чем ранее высоко. Эти культуры обычно содержат также моноцитарных moDC макрофагов (moMac) и даже некоторые менее развитые клетки, такие как моноцитов. Цель настоящего Протокола заключается в том, предоставить согласованный метод для выявления и отделения многих типов клеток, присутствующие в этих культурах, как они развиваются, так, что их конкретные функции может быть дальнейшее расследование. Стратегию сортировки, представленные здесь разделяет клетки сначала на четыре населения на основе выражения Ly6C и CD115, оба из которых выражаются временно клетками, как они развиваются в ГМ-КСФ driven культуры. Эти четыре группы населения включают общие миелоидного прародителями или CMP (Ly6C-, CD115-), предшественники гранулоцитов/макрофагов или GMP (“Ly6C +”, “CD115-“), моноцитов (Ly6C +, CD115 +) и моноцитарных макрофаги или moMac (Ly6C-, CD115 +). CD11c также добавляется в стратегию сортировки различать две популяции в пределах Ly6C-, CD115-население: CMP (CD11c-) и moDC (CD11c +). Наконец две популяции могут различаться далее в пределах Ly6C-, CD115 + населения, основанные на уровень MHC класса II выражение. MoMacs Экспресс более низкий уровень MHC класса II, в то время как прекурсор моноцитарных DC (moDP) выражает выше MHC класса II. Этот метод позволяет для надежной изоляции несколько развивающих собственный населения в цифрах достаточно для различных анализов, функциональной и развития. Мы выделяем один из таких функциональных индикация, дифференциальной ответы этих типов клеток для стимуляции с Pathogen-Associated молекулярных структур (PAMPs).
Introduction
Культивирование клеток костного мозга мышиных с цитокина гранулоцитарно-макрофагальный колонии стимулирующий фактор (ГМ-КСФ) широко используется как метод для создания моноцитарных дендритных клеток (moDC; также известен как воспалительные DC) в больших количествах 1, 2,3,4,5. Эти клетки были чрезвычайно полезными в различных исследований дендритных клеток (DC) функция 6,,78. Как правило эти клетки костного мозга мышиных культивировали для 6-8 дней и затем используются для изучения дендритные клетки функции 5. Эти культуры давно считается основном однородной, состоящий из большинства дифференцированных moDC. Совсем недавно стало ясно, что в конце этого периода 6-8 день культуры, есть действительно много moDC, а также большое подмножество дифференцированной моноцитарных макрофагов (moMacs) 9,10,11. Далее наши собственные исследования расширили эти результаты демонстрируют, что другие подмножеств менее развитых клеток, таких как moDC прекурсоров (moDP) и моноцитов, остаются в культурах низкой частотой даже после 7 дней 10. Таким образом исследования дендритных клеток (DC) функции с использованием клеток, порожденных этой системы может отражать ответы широкой когорты типов клеток, чем ранее высоко.
Мы узнали многое из сферы исследования ГМ-КСФ генерируется moDC, касающиеся функции этих клеток в заключительной стадии дифференцировки 12,,1314. Однако, мы понимаем значительно меньше о пути развития этих клеток 2,,1516 и как и когда они выставки конкретные функции, такие как: реагировать возбудителя связанные молекулярные Шаблоны (PAMPs), фагоцитоз, обработки и презентации антигена 13и антибактериальная активность. Протокол для изоляции большого числа обычных Flt3L-driven DC прародителями и прекурсоров был сообщил 17. Изоляция этих различных групп населения была достигнута с помощью Карбоксифлуоресцеина succinimidyl эфира (CFSE)-окрашенных клеток костного мозга (для отслеживания деления клеток) и культуры в Flt3L на 3 дня. Клетки затем были истощены построчная оплата позитивных клеток и рассортированы прародителем и прекурсоров населения, основанные на CD11c выражение 17. Другой подход Leenen в группы для выявления ранних прародителями DC в ГМ-КСФ driven культуры был для сортировки клеток, основанные на CD31 и Ly6C 18. Первоначальной целью было создать аналогичный метод для получения прародителями и прекурсоров ГМ-КСФ driven moDC. Из-за определенных ячеек типы, созданные с помощью GM-CSF мы адаптировали подход и сортировка стратегию, основанную на экспрессию молекул, которые были высказаны на ранних и более поздних стадиях развития. Мы в конечном счете определил, что Ly6C, CD115 (РСУ-1 рецепторов), и CD11c были лучшие маркеры для разграничения этих клеток типов 10.
Здесь мы представляем метод для изоляции клеток в несколько различных этапов развития по пути дифференциации, движимый ГМ-КСФ: общие миелоидного Progenitor (CMP), гранулоцитарно-макрофагального Progenitor (GMP), моноцитов, макрофагов, моноцитарных (MoMac) и моноцитарных DC (MoDC). MoMac населения можно далее подразделить на основе на уровень MHC класса II выражение, выявление прекурсоров moDC населения (moDP) 10. Мы используем высокоскоростной флуоресценции активированный ячейку Сортировка (FACS) стратегия изолировать эти 5 населения на основе выражения, Ly6C, CD115 и CD11c. Затем мы показываем изучение этих клеток в функциональных анализов, раскрывая свои ответы PAMP стимуляции.
Protocol
Representative Results
Discussion
Этот протокол способствует изоляции ГМ-КСФ driven прародителем и прекурсоров типов клеток в количествах, достаточных для нескольких видов анализов, включая биохимические анализы, анализов клеточную функцию в пробирке, или инстилляции в естественных условиях. Этот метод предст?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы благодарны за технической помощи от Элисон церковь птица в Auburn университета Школа по ветеринарной медицины потока цитометрии объект, для финансирования из низ EHS R15 R15 AI107773 и клеточной и молекулярной биологии программа в университете Оберн для летних исследований финансирование PBR.
Materials
| RPMI 1640 | Corning | 15-040-CV | |
| Fetal Calf Serum (FCS) | HyClone | SV30014.04 | to supplement complete medium and FWB |
| GlutaMAX | Gibco | 35050 | to supplement complete medium |
| 2-mercaptoethanol (2-ME) | MP Biomedical | 190242 | to supplement complete medium |
| 75mM Vacuum Filter | Thermo Scientific | 156-4045 | to sterilize complete media |
| ACK Lysis Buffer | Lonza | 10-548E | to lyse red blood cell |
| HEPES buffer | Corning | 21-020-CM | to rescue leukocytes after red blood cell lysis |
| Phosphate Buffered Saline (PBS), Dulbecco's | Lonza | 17-512F | must be endotoxin free; chilled at 4 °C |
| 35µm Cell filter | Falcon | 352235 | to break apart clumps before running through cytometer. |
| GM-CSF | Biosource | PMC2011 | usable concentration of 10ng/mL |
| Tissue cultured treated plate | VWR | 10062-896 | for bone marrow cells after harvest |
| Anti-Ly6C, Clone HK1.4 | Biolegend | 128018 | |
| Anti-CD115, Clone AFS98 | Tonbo Bioscience | 20-1152-U100 | |
| Anti-CD11c, Clone HL3 | BD Biosciences | 557400 | to differeniate CMP and MoDCs |
| MoFlo XPD Flow Cytometer | Beckman Coulter | ML99030 | |
| BD Accuri C6 | BD Biosciences | 660517 | |
| 100% Ethanol | Pharmco-Aaper | 111000200CSPP | |
| 60mm Petri Dish | Corning, Inc | 353002 | |
| 50mL Conical tube | VWR | 21008-242 | |
| C57BL/6 Mice | The Jackson Laboratory | 000664 | Female; 10-20 weeks old |
| Biosafety Hood | Thermo Scientific | 8354-30-0011 | |
| 10mL Syringe | BD Biosciences | 301604 | |
| 23-gauge needle | BD Biosciences | 305145 | |
| Centrifuge 5810 R | eppendorf | 22625501 | |
| FlowJo Software v10 | BD Biosciences | Version 10 | flowjo.com |
References
- Zhan, Y., Xu, Y., Lew, A. M. The regulation of the development and function of dendritic cell subsets by GM-CSF: more than a hematopoietic growth factor. Mol Immunol. 52, 30-37 (2012).
- Zhan, Y., et al. The inflammatory cytokine, GM-CSF, alters the developmental outcome of murine dendritic cells. Eur J Immunol. , (2012).
- van de Laar, L., Coffer, P. J., Woltman, A. M. Regulation of dendritic cell development by GM-CSF: molecular control and implications for immune homeostasis and therapy. Blood. 119, 3383-3393 (2012).
- Steinman, R. M., Inaba, K. Myeloid dendritic cells. J Leukoc Biol. 66, 205-208 (1999).
- Inaba, K., et al. Generation of large numbers of dendritic cells from mouse bone marrow cultures supplemented with granulocyte/macrophage colony-stimulating factor. J Exp Med. 176, 1693-1702 (1992).
- Steinman, R. M., Pack, M., Inaba, K. Dendritic cell development and maturation. Adv Exp Med Biol. , 1-6 (1997).
- Pierre, P., et al. Developmental regulation of MHC class II transport in mouse dendritic cells. Nature. 388, 787-792 (1997).
- Steinman, R. M., Witmer-Pack, M., Inaba, K. Dendritic cells: antigen presentation, accessory function and clinical relevance. Adv Exp Med Biol. , 1-9 (1993).
- Na, Y. R., Jung, D., Gu, G. J., Seok, S. H. GM-CSF Grown Bone Marrow Derived Cells Are Composed of Phenotypically Different Dendritic Cells and Macrophages. Mol Cells. 39, 734-741 (2016).
- Rogers, P. B., Driessnack, M. G., Hiltbold Schwartz, E. Analysis of the developmental stages, kinetics, and phenotypes exhibited by myeloid cells driven by GM-CSF in vitro. PLoS One. 12, e0181985 (2017).
- Helft, J., et al. GM-CSF Mouse Bone Marrow Cultures Comprise a Heterogeneous Population of CD11c(+)MHCII(+) Macrophages and Dendritic Cells. Immunity. 42, 1197-1211 (2015).
- Alloatti, A., Kotsias, F., Magalhaes, J. G., Amigorena, S. Dendritic cell maturation and cross-presentation: timing matters!. Immunol Rev. 272, 97-108 (2016).
- Jakubzick, C. V., Randolph, G. J., Henson, P. M. Monocyte differentiation and antigen-presenting functions. Nat Rev Immunol. 17, 349-362 (2017).
- Mbongue, J. C., Nieves, H. A., Torrez, T. W., Langridge, W. H. The Role of Dendritic Cell Maturation in the Induction of Insulin-Dependent Diabetes Mellitus. Frontiers in immunology. 8, 327 (2017).
- Shortman, K., Naik, S. H. Steady-state and inflammatory dendritic-cell development. Nat Rev Immunol. 7, 19-30 (2007).
- Xu, Y., Zhan, Y., Lew, A. M., Naik, S. H., Kershaw, M. H. Differential development of murine dendritic cells by GM-CSF versus Flt3 ligand has implications for inflammation and trafficking. J Immunol. 179, 7577-7584 (2007).
- Naik, S. H. Generation of large numbers of pro-DCs and pre-DCs in vitro. Methods Mol Biol. 595, 177-186 (2010).
- Nikolic, T., de Bruijn, M. F., Lutz, M. B., Leenen, P. J. Developmental stages of myeloid dendritic cells in mouse bone marrow. Int Immunol. 15, 515-524 (2003).
- Hettinger, J., et al. Origin of monocytes and macrophages in a committed progenitor. Nat Immunol. 14, 821-830 (2013).
- Fogg, D. K., et al. A clonogenic bone marrow progenitor specific for macrophages and dendritic cells. Science. 311, 83-87 (2006).
- Traver, D., et al. Development of CD8{alpha}-Positive Dendritic Cells from a Common Myeloid Progenitor. Science. 290, 2152-2154 (2000).
