Generación de un gran número de progenitores mieloides y células dendríticas precursores de médula Murine usando una célula nueva clasificación estrategia
Summary
Aquí proporcionamos un método para la identificación y aislamiento de grandes cantidades de GM-CSF por células mieloides con clasificación de celda de alta velocidad. Pueden identificarse cinco poblaciones distintas (progenitores mieloides comunes, progenitores de granulocitos/macrófagos, monocitos, macrófagos derivados de monocitos y DCs derivados de monocitos) basado en la expresión Ly6C y CD115.
Abstract
Cultivos de células dendríticas derivadas de monocitos (moDC) generadas a partir de médula ósea de ratón usando Factor de estimulante de Colonia del Granulocyte-macrófago (GM-CSF) han sido reconocidos recientemente para ser más heterogéneos que apreciado previamente. Estas culturas habitualmente contienen moDC derivados de monocitos y macrófagos (moMac) e incluso algunas menos desarrolladas células tales como monocitos. El objetivo de este protocolo es proporcionar un método coherente para la identificación y separación de los diversos tipos de células presentes en estas culturas que se desarrollan, por lo que sus funciones específicas pueden ser investigada más a fondo. La estrategia de clasificación presentada aquí separa las células primero en cuatro poblaciones basadas en expresión de Ly6C y CD115, los cuales se expresan transitoriamente por las células que se desarrollan en la cultura impulsada por el GM-CSF. Estas cuatro poblaciones incluyen comunes progenitores mieloides o CMP (Ly6C, CD115), progenitores de granulocitos/macrófagos o GMP (Ly6C +, CD115), monocitos (Ly6C +, CD115 +) y macrófagos derivados de monocitos o moMac (Ly6C-, CD115 +). CD11c se agrega también a la estrategia de clasificación para distinguir dos poblaciones dentro del Ly6C, CD115-población: CMP (CD11c-) y moDC (CD11c +). Finalmente, dos poblaciones pueden ser distinguidas más lejos dentro del Ly6C, CD115 + población basado en el nivel de expresión II de la clase de MHC. MoMacs expresan bajos niveles de MHC de clase II, mientras que un precursor DC derivados de monocitos (moDP) expresa mayor MHC de clase II. Este método permite el aislamiento fiable de varias poblaciones con distinta en números suficiente para una variedad de análisis funcionales y de desarrollo. Destacamos una tal lectura funcional, la respuesta diferencial de estos tipos celulares a la estimulación con patrones moleculares Pathogen-Associated (PAMPs).
Introduction
Cultivo de células de médula ósea murina con la citoquina Factor de estimulante de Colonia del Granulocyte-macrófago (GM-CSF) es ampliamente utilizado como un método para generar células dendríticas derivadas de monocitos (moDC; también conocido como DC inflamatoria) en gran número 1, 2,3,4,5. Estas células han sido extremadamente útiles en una variedad de estudios de la función de células dendríticas (DC) 6,7,8. Normalmente, estas células de médula ósea murina se cultivan para 6-8 días y luego se utilizan para el estudio de las células dendríticas función 5. Estas culturas habían sido considerado como sobre todo homogéneas, compuesto por una mayoría de moDC diferenciado. Más recientemente, ha quedado claro que al final de este período de cultivo de 6 a 8 días, hay de hecho muchos moDC, así como un subconjunto grande de macrófagos derivados de monocitos diferenciado (moMacs) 9,10,11. Nuestros propios estudios han ampliado estos resultados demostrando que otros subconjuntos de menos células desarrolladas, como precursores de moDC (moDP) y monocitos, siendo en las culturas a baja frecuencia incluso después de 7 días 10. Así, los estudios de la función de células dendríticas (DC) con células generadas por este sistema podrían reflejar las respuestas de una cohorte más amplia de tipos de células que previamente apreciado.
Hemos aprendido mucho del estudio de moDC de GM-CSF-generan relacionadas con la función de estas células en la fase final de diferenciación 12,13,14. Sin embargo, entendemos que significativamente menos por la vía del desarrollo de estas células 2,15,16 y de cómo y cuándo exhibir específicas funciones tales como: capacidad de respuesta a patógenos asociados moleculares Patrones (PAMPs), fagocitosis, procesamiento y presentación de antígeno 13y actividad antibacteriana. Un protocolo para el aislamiento de un gran número de progenitores basada en Flt3L DC convencionales y precursores ha sido reportado 17. Aislamiento de estas poblaciones distintas se logró utilizando carboxyfluorescein succinimidyl éster (CFSE)-tinción de las células de la médula ósea (para seguimiento de células divisorias) y la cultura en Flt3L por 3 días. Las células fueron agotadas de las células positivas de linaje y clasificó en poblaciones progenitoras y precursoras en la expresión de CD11c 17. Otro enfoque por grupo de Leenen identificar progenitores tempranos de DC en la cultura impulsada por el GM-CSF fue ordenar las células partiendo de CD31 y Ly6C 18. El objetivo inicial era crear un método similar para la obtención de progenitores y precursores de moDC de GM-CSF-conducido. Debido a los tipos de células específicos generados por GM-CSF, adaptamos el enfoque y estrategia basada en la expresión de las moléculas que se expresan en etapas tempranas y posteriores de desarrollo de la clasificación. Finalmente determinamos que Ly6C, CD115 (receptor CSF-1), y CD11c fueron los mejores marcadores para distinguir estas células tipos de 10.
Aquí, presentamos un método para el aislamiento de las células en varias etapas distintas de desarrollo a lo largo de la vía de diferenciación impulsada por GM-CSF: monocito Progenitor mieloide común (CMP), Progenitor del Granulocyte-macrófago (GMP), macrófagos derivados de monocitos (MoMac) y DC (MoDC) derivados de monocitos. La población de moMac puede más separada en base a nivel de expresión II, clase de MHC revelando un moDC precursor población (moDP) 10. Utilizamos un celular activado por fluorescencia alta velocidad clasificación estrategia (FACS) para aislar a estas 5 poblaciones basadas en expresión de CD11c, Ly6C y CD115. Entonces demostramos el examen de estas células en ensayos funcionales revelando sus respuestas a la estimulación de PAMP.
Protocol
Representative Results
Discussion
Este protocolo facilita el aislamiento de GM-CSF-conducido progenitoras y precursoras tipos celulares en una cantidad suficiente para varios tipos de análisis incluyendo ensayos bioquímicos, análisis de la función celular in vitro, o la instilación in vivo. Este método representa un avance significativo en el campo del desarrollo de células dendríticas derivadas de monocitos, lo que permite el aislamiento fiable e identificación de células en esta vía de desarrollo, así como los tipos de cé…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Estamos muy agradecidos por la asistencia técnica de Alison iglesia Bird en el Auburn Universidad de medicina veterinaria de flujo citometría de planteles escolares, para la financiación de los NIH para EHS R15 R15 AI107773 y al programa de Biología Molecular en la Universidad de Auburn y celular para la financiación de investigación de verano para PBR.
Materials
| RPMI 1640 | Corning | 15-040-CV | |
| Fetal Calf Serum (FCS) | HyClone | SV30014.04 | to supplement complete medium and FWB |
| GlutaMAX | Gibco | 35050 | to supplement complete medium |
| 2-mercaptoethanol (2-ME) | MP Biomedical | 190242 | to supplement complete medium |
| 75mM Vacuum Filter | Thermo Scientific | 156-4045 | to sterilize complete media |
| ACK Lysis Buffer | Lonza | 10-548E | to lyse red blood cell |
| HEPES buffer | Corning | 21-020-CM | to rescue leukocytes after red blood cell lysis |
| Phosphate Buffered Saline (PBS), Dulbecco's | Lonza | 17-512F | must be endotoxin free; chilled at 4 °C |
| 35µm Cell filter | Falcon | 352235 | to break apart clumps before running through cytometer. |
| GM-CSF | Biosource | PMC2011 | usable concentration of 10ng/mL |
| Tissue cultured treated plate | VWR | 10062-896 | for bone marrow cells after harvest |
| Anti-Ly6C, Clone HK1.4 | Biolegend | 128018 | |
| Anti-CD115, Clone AFS98 | Tonbo Bioscience | 20-1152-U100 | |
| Anti-CD11c, Clone HL3 | BD Biosciences | 557400 | to differeniate CMP and MoDCs |
| MoFlo XPD Flow Cytometer | Beckman Coulter | ML99030 | |
| BD Accuri C6 | BD Biosciences | 660517 | |
| 100% Ethanol | Pharmco-Aaper | 111000200CSPP | |
| 60mm Petri Dish | Corning, Inc | 353002 | |
| 50mL Conical tube | VWR | 21008-242 | |
| C57BL/6 Mice | The Jackson Laboratory | 000664 | Female; 10-20 weeks old |
| Biosafety Hood | Thermo Scientific | 8354-30-0011 | |
| 10mL Syringe | BD Biosciences | 301604 | |
| 23-gauge needle | BD Biosciences | 305145 | |
| Centrifuge 5810 R | eppendorf | 22625501 | |
| FlowJo Software v10 | BD Biosciences | Version 10 | flowjo.com |
References
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