Çok sayıda miyeloid ataları ve dendritik hücre öncüleri fare kemik iliği strateji sıralama bir roman hücre kullanarak gelen nesil
Summary
Burada biz belirlenmesi ve GM-CSF myeloid hücrelerin hücre yüksek hızlı sıralama kullanarak tahrik çok sayıda ayırma için bir yöntem sağlar. Beş ayrı nüfus (ortak miyeloid ataları, granülosit/makrofaj ataları, monosit, monosit kaynaklı makrofajlar ve monosit kaynaklı DCs) Ly6C ve CD115 ifade üzerinde göre tespit edilebilir.
Abstract
Fare kemik iliği granülosit-makrofaj koloni uyarıcı faktör (GM-CSF) kullanılarak üretilen monosit kaynaklı dendritik hücreler (moDC) kültürleri son zamanlarda daha önceden takdir daha heterojen olduğu kabul. Bu kültürler rutin de monosit türetilmiş moDC makrofaj (moMac) ve monosit gibi hatta bazı az gelişmiş hücreler içerir. Bu iletişim kuralı gibi onlar geliştirmek, böylece özel işlevleriyle daha fazla soruşturma tutarlı bir yöntem kimlik ve birçok hücre tipleri bu kültürlerde mevcut ayrılması için sağlamak için hedeftir. Burada sunulan sıralama strateji hücreleri ilk dört nüfus Ly6C ve CD115, ifadeye dayalı GM-CSF-driven kültür geliştirdikçe ikisi de geçici hücreleri tarafından ifade edilir içine ayırır. Bu dört nüfus ortak miyeloid ataları veya Cumhuriyetçi millet Partisi (Ly6C-, CD115-), granülosit/makrofaj ataları veya GMP (Ly6C +, CD115-), monosit (Ly6C +, CD115 +) ve monosit kaynaklı makrofajlar veya moMac (Ly6C-, CD115 +) içerir. CD11c da içinde Ly6C-, CD115-nüfus iki popülasyonun ayırt etmek için sıralama strateji ekledi: CMP (CD11c-) ve moDC (CD11c +). Son olarak, iki örneğin alınma olasılığını daha da içinde Ly6C-, MHC sınıf II ifade düzeyine göre CD115 + nüfus ayırt. Monosit kaynaklı bir DC habercisi (moDP) daha yüksek MHC sınıf II ifade ederken MoMacs alt düzeyleri MHC sınıf II, hızlı. Bu yöntemi birkaç gelişimsel olarak ayrı nüfus sayıları güvenilir yalıtım fonksiyonel ve gelişimsel analizleri çeşitli için yeterli olanak sağlar. Biz bir tür işlevsel okuma, stimülasyon Pathogen-Associated moleküler desenleri (PAMPs) ile fark yanıtlarını bu hücre tiplerinin vurgulayın.
Introduction
Sitokin ile fare kemik iliği hücre kültürü çalışmalarının granülosit-makrofaj koloni uyarıcı faktör (GM-CSF) yaygın bir yöntem olarak monosit kaynaklı dendritik hücreler (moDC; da inflamatuar DC) çok sayıda 1‘oluşturmak için kullanılır, 2,3,4,5. Bu hücreler içinde a değişiklik-in dendritik hücre (DC) işlevi 6,7,8çalışmaların son derece yararlı olmuştur. Genellikle, bu fare kemik iliği hücreleri 6-8 gün boyunca kültürlü ve daha sonra dendritik hücre işlevi 5çalışma için kullanılır. Bu kültürler uzun çoğunlukla farklılaşmış moDC çoğunluğu oluşan homojen olarak kabul edilmiştir. Son zamanlarda, bu 6-8 gün kültür dönemin sonunda, orada gerçekten çok moDC, hem de büyük bir alt kümesini farklılaştırılmış monosit kaynaklı makrofajlar (moMacs) 9,10,11açık hale gelmiştir. Kendi çalışmaları diğer alt kümeleri moDC öncüleri (moDP) ve monosit, gibi daha az gelişmiş hücre kültürlerinde düşük frekansta sonra bile 107 gün kalmasını gösteren bu bulgular daha da genişletmiştir. Böylece, çalışmalar bu sistem tarafından oluşturulan hücreler kullanarak dendritik hücreler (DC) işlevinin yanıt-e doğru daha geniş bir kohort hücre tiplerinin daha önceden takdir yansıtmak.
GM-CSF-oluşturulan moDC farklılaşma 12,13,14son aşamasında bu hücreler işleve ilişkin çalışma çok şey öğrendik. Bununla birlikte, önemli ölçüde bu gelişimsel yolu hakkında daha az 2,15,16 hücreleri ve nasıl ve ne zaman onlar özel sergi gibi işlevleri anlamak: patojen ilişkili moleküler yanıt Desenler (PAMPs), fagositoz, antijen işleme ve sunum 13ve anti-bakteriyel etkinlik. Yalıtım geleneksel Flt3L tahrik DC ataları ve hareketlenme öncesi ilk belirtiler çok sayıda için bir protokol bildirilen 17oldu. Yalıtım bu farklı nüfus elde kullanarak carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE)-(sayesinde bunun bölünen hücreler izlemek için) kemik iliği hücreleri lekeli ve Flt3L kültür 3 gündür. Hücreleri sonra hiza pozitif hücrelerinin tükenmiş ve içine yaratıcı ve öncü nüfus CD11c ifade 17tarihinde göre sıralanır. CD31 ve Ly6C 18tarihinde dayalı hücreleri sıralamak için DC erken ataları GM-CSF-driven kültür tanımlamak için Leenen’ın Grup tarafından başka bir yaklaşımı oldu. Ataları ve GM-CSF-driven moDC nın elde etmek için benzer bir yöntem oluşturmak için ilk hedefi oldu. GM-CSF tarafından oluşturulan belirli hücre tipleri nedeniyle, yaklaşım ve strateji geliştirme erken ve daha sonraki aşamalarında ifade edildi molekülleri ifade dayalı sıralama uyarlanmış. Biz sonuçta belirlenen Ly6C, CD115 (CSF-1 reseptör), ve CD11c bu hücre ayırt 10türleri için en iyi işaretler vardı.
Burada, birkaç farklı gelişimin yolu boyunca GM-CSF tarafından tahrik farklılaşma, hücre izolasyon için bir yöntem mevcut: ortak Myeloid dede (CMP), granülosit-makrofaj dede (GMP), monosit, monosit kaynaklı makrofaj (MoMac) ve monosit kaynaklı DC (MoDC). MoMac nüfus daha fazla dayalı MHC sınıf II ifade, düzeyde moDC habercisi nüfus (moDP) 10açığa ayrılmış olabilir. Biz Ly6C, CD115 ve CD11c ifade üzerinde göre bu 5 nüfus yalıtmak için (FACS) strateji sıralama yüksek hızlı bir floresan aktif hücre kullanmaktadır. O zaman bu hücrelerin fonksiyonel deneyleri PAMP stimülasyon yanıtlarını ifşa olarak muayene göstermektedir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bu iletişim kuralı yalıtım GM-CSF-driven yaratıcı ve öncü hücre tiplerinin çeşitli biyokimyasal deneyleri, hücresel işlev içinde vitroveya korumak içinde vivodeneyleri de dahil olmak üzere analizleri için yeterli sayıda kolaylaştırır. Bu yöntem güvenilir izolasyon ve erken geliştirme hem de bu farklı hücre tipleri para nereye hücrelerinin kimlik daha yaygın olarak etkinleştirme monosit kaynaklı dendritik hücre gelişimi alanında önemli bir ilerleme temsil eder. önceki ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Alison kilise kuş, Auburn Üniversitesi Okul, hayvan hastalıklarıyla ilgili ilaç akış sitometresi NIH cep ve Auburn Üniversitesi Moleküler Biyoloji programı için EHS R15 R15 AI107773 ve fon için tesis, teknik yardım için minnettarız Yaz PBR için araştırma fonu için.
Materials
| RPMI 1640 | Corning | 15-040-CV | |
| Fetal Calf Serum (FCS) | HyClone | SV30014.04 | to supplement complete medium and FWB |
| GlutaMAX | Gibco | 35050 | to supplement complete medium |
| 2-mercaptoethanol (2-ME) | MP Biomedical | 190242 | to supplement complete medium |
| 75mM Vacuum Filter | Thermo Scientific | 156-4045 | to sterilize complete media |
| ACK Lysis Buffer | Lonza | 10-548E | to lyse red blood cell |
| HEPES buffer | Corning | 21-020-CM | to rescue leukocytes after red blood cell lysis |
| Phosphate Buffered Saline (PBS), Dulbecco's | Lonza | 17-512F | must be endotoxin free; chilled at 4 °C |
| 35µm Cell filter | Falcon | 352235 | to break apart clumps before running through cytometer. |
| GM-CSF | Biosource | PMC2011 | usable concentration of 10ng/mL |
| Tissue cultured treated plate | VWR | 10062-896 | for bone marrow cells after harvest |
| Anti-Ly6C, Clone HK1.4 | Biolegend | 128018 | |
| Anti-CD115, Clone AFS98 | Tonbo Bioscience | 20-1152-U100 | |
| Anti-CD11c, Clone HL3 | BD Biosciences | 557400 | to differeniate CMP and MoDCs |
| MoFlo XPD Flow Cytometer | Beckman Coulter | ML99030 | |
| BD Accuri C6 | BD Biosciences | 660517 | |
| 100% Ethanol | Pharmco-Aaper | 111000200CSPP | |
| 60mm Petri Dish | Corning, Inc | 353002 | |
| 50mL Conical tube | VWR | 21008-242 | |
| C57BL/6 Mice | The Jackson Laboratory | 000664 | Female; 10-20 weeks old |
| Biosafety Hood | Thermo Scientific | 8354-30-0011 | |
| 10mL Syringe | BD Biosciences | 301604 | |
| 23-gauge needle | BD Biosciences | 305145 | |
| Centrifuge 5810 R | eppendorf | 22625501 | |
| FlowJo Software v10 | BD Biosciences | Version 10 | flowjo.com |
References
- Zhan, Y., Xu, Y., Lew, A. M. The regulation of the development and function of dendritic cell subsets by GM-CSF: more than a hematopoietic growth factor. Mol Immunol. 52, 30-37 (2012).
- Zhan, Y., et al. The inflammatory cytokine, GM-CSF, alters the developmental outcome of murine dendritic cells. Eur J Immunol. , (2012).
- van de Laar, L., Coffer, P. J., Woltman, A. M. Regulation of dendritic cell development by GM-CSF: molecular control and implications for immune homeostasis and therapy. Blood. 119, 3383-3393 (2012).
- Steinman, R. M., Inaba, K. Myeloid dendritic cells. J Leukoc Biol. 66, 205-208 (1999).
- Inaba, K., et al. Generation of large numbers of dendritic cells from mouse bone marrow cultures supplemented with granulocyte/macrophage colony-stimulating factor. J Exp Med. 176, 1693-1702 (1992).
- Steinman, R. M., Pack, M., Inaba, K. Dendritic cell development and maturation. Adv Exp Med Biol. , 1-6 (1997).
- Pierre, P., et al. Developmental regulation of MHC class II transport in mouse dendritic cells. Nature. 388, 787-792 (1997).
- Steinman, R. M., Witmer-Pack, M., Inaba, K. Dendritic cells: antigen presentation, accessory function and clinical relevance. Adv Exp Med Biol. , 1-9 (1993).
- Na, Y. R., Jung, D., Gu, G. J., Seok, S. H. GM-CSF Grown Bone Marrow Derived Cells Are Composed of Phenotypically Different Dendritic Cells and Macrophages. Mol Cells. 39, 734-741 (2016).
- Rogers, P. B., Driessnack, M. G., Hiltbold Schwartz, E. Analysis of the developmental stages, kinetics, and phenotypes exhibited by myeloid cells driven by GM-CSF in vitro. PLoS One. 12, e0181985 (2017).
- Helft, J., et al. GM-CSF Mouse Bone Marrow Cultures Comprise a Heterogeneous Population of CD11c(+)MHCII(+) Macrophages and Dendritic Cells. Immunity. 42, 1197-1211 (2015).
- Alloatti, A., Kotsias, F., Magalhaes, J. G., Amigorena, S. Dendritic cell maturation and cross-presentation: timing matters!. Immunol Rev. 272, 97-108 (2016).
- Jakubzick, C. V., Randolph, G. J., Henson, P. M. Monocyte differentiation and antigen-presenting functions. Nat Rev Immunol. 17, 349-362 (2017).
- Mbongue, J. C., Nieves, H. A., Torrez, T. W., Langridge, W. H. The Role of Dendritic Cell Maturation in the Induction of Insulin-Dependent Diabetes Mellitus. Frontiers in immunology. 8, 327 (2017).
- Shortman, K., Naik, S. H. Steady-state and inflammatory dendritic-cell development. Nat Rev Immunol. 7, 19-30 (2007).
- Xu, Y., Zhan, Y., Lew, A. M., Naik, S. H., Kershaw, M. H. Differential development of murine dendritic cells by GM-CSF versus Flt3 ligand has implications for inflammation and trafficking. J Immunol. 179, 7577-7584 (2007).
- Naik, S. H. Generation of large numbers of pro-DCs and pre-DCs in vitro. Methods Mol Biol. 595, 177-186 (2010).
- Nikolic, T., de Bruijn, M. F., Lutz, M. B., Leenen, P. J. Developmental stages of myeloid dendritic cells in mouse bone marrow. Int Immunol. 15, 515-524 (2003).
- Hettinger, J., et al. Origin of monocytes and macrophages in a committed progenitor. Nat Immunol. 14, 821-830 (2013).
- Fogg, D. K., et al. A clonogenic bone marrow progenitor specific for macrophages and dendritic cells. Science. 311, 83-87 (2006).
- Traver, D., et al. Development of CD8{alpha}-Positive Dendritic Cells from a Common Myeloid Progenitor. Science. 290, 2152-2154 (2000).
