توليد عدد كبير من فروعه النقوي وسلائف الخلايا الجذعية من نخاع العظام مورين باستخدام خلية رواية فرز استراتيجية
Summary
هنا نقدم طريقة لتحديد وعزل عدد كبير من GM-CSF مدفوعة النقوي الخلايا باستخدام فرز الخلايا عالية السرعة. ويمكن تحديد خمس السكان متميزة (المتكفل النقوي المشتركة وفروعه المحببات/بلعم ووحيدات، الضامة المشتقة من الوحيدات والمشتقة من الوحيدات DCs) استناداً إلى تعبير Ly6C و CD115.
Abstract
مؤخرا تم الاعتراف بثقافات المشتقة من الوحيدات الخلايا الجذعية (مودك) التي تم إنشاؤها من نخاع العظام الماوس باستخدام “عامل تحفيز مستعمرة” بلعم المحببات (GM-CSF) لتكون غير متجانسة أكثر مما كانت موضع تقدير. وتتضمن هذه الثقافات بشكل روتيني مودك كذلك الوحيدات المستمدة الضامة (موماك)، وحتى بعض الخلايا الأقل نمواً مثل وحيدات. والهدف من هذا البروتوكول توفير أسلوب متناسق لتحديد الهوية، والفصل بين العديد من أنواع الخلايا الموجودة في هذه الثقافات كما أنها تضع، حتى أن وظائفها المحددة قد يكون مزيدا من التحقيق. الاستراتيجية الفرز المعروضة هنا يفصل الخلايا أولاً إلى السكان أربعة استناداً إلى التعبير عن Ly6C و CD115، اللذين يتم أعرب عابر من الخلايا كما أنها تضع في ثقافة يحركها من السائل الدماغي النخاعي الآلية العالمية. تشمل هؤلاء السكان أربعة المتكفل النقوي المشتركة أو CMP (Ly6C و CD115)، المتكفل المحببات/بلعم أو GMP (Ly6C +، CD115-)، وحيدات (Ly6C +، CD115 +)، والمشتقة من الوحيدات الضامة أو موماك (Ly6C-، CD115 +). يتم أيضا إضافة CD11c إلى استراتيجية الفرز التمييز بين اثنين من السكان داخل Ly6C-، CD115-السكان: اجتماع الأطراف (CD11c-) ومودك (CD11c +). وأخيراً، اثنين من السكان يمكن تمييز كذلك داخل Ly6C-، CD115 + السكان استناداً إلى مستوى الطبقة MHC التعبير الثاني. موماكس التعبير عن المستويات الدنيا من الطبقة MHC الثاني، بينما سليفة DC المشتقة من الوحيدات (مودب) تعرب عن أعلى MHC الدرجة الثانية. يسمح هذا الأسلوب لعزل عدة السكان تنمويا متميزاً في أرقام موثوقة كافية لمجموعة متنوعة من التحليلات الفنية والإنمائية. نسلط الضوء على أحد قراءات وظيفية مثل، التفاضلية ردود هذه أنواع الخلايا على التحفيز مع “أنماط الجزيئية باثوجيناسوسياتيد” (بامبس).
Introduction
استزراع خلايا نخاع العظام مورين مع سيتوكين “عامل تحفيز مستعمرة” بلعم المحببات (GM-CSF) يستخدم على نطاق واسع كوسيلة لتوليد الخلايا الجذعية المشتقة من الوحيدات (مودك؛ ويعرف أيضا باسم DC التحريضية) في، إعداد كبيرة 1 2،3،،من45. هذه الخلايا كانت مفيدة للغاية في مجموعة متنوعة من الدراسات المتعلقة بالخلايا الجذعية (DC) الدالة 6،،من78. بشكل عام، هذه الخلايا نخاع العظام مورين تربى لمدة 6-8 أيام وتستخدم فيما بعد لدراسة الخلية الجذعية الدالة 5. هذه الثقافات منذ فترة طويلة وقد نظر معظمها متجانسة، تتكون من أغلبية مودك المتباينة. في الآونة الأخيرة، أصبح من الواضح أن في نهاية هذه الفترة 6-8 يوم الثقافة، هناك في الواقع العديد من مودك، فضلا عن مجموعة فرعية كبيرة من المتباينة الضامة المشتقة من الوحيدات (موماكس) 9،،من1011. وقد مدد الدراسات الخاصة بنا هذه النتائج تبين أن مجموعات فرعية أخرى من خلايا أقل نمواً، مثل مودك السلائف (مودب) ووحيدات، تظل في الثقافات في الترددات المنخفضة حتى بعد 7 أيام 10. وهكذا، يمكن أن تعكس الدراسات المتعلقة بالخلايا الجذعية (DC) دالة باستخدام الخلايا التي تم إنشاؤها بواسطة هذا النظام الردود الواردة من مجموعة أوسع من أنواع الخلايا مما سبق تقدير.
لقد تعلمنا الكثير من دراسة مودك GM-CSF-ولدت المتصلة بوظيفة هذه الخلايا في المراحل النهائية للمفاضلة 12،،من1314. بيد أننا نفهم إلى حد كبير أقل حول المسار التنموي لهذه الخلايا 2،،من1516 ومن كيف ومتى هم يعرضون محددة المهام مثل: القدرة على الاستجابة “مسببات الأمراض المرتبطة الجزيئية” أنماط (بامبس)، البلعمه، مستضد تجهيز وعرض 13، والأنشطة المضادة للبكتيريا. بروتوكول لعزل عدد كبير من فروعه DC يحركها Flt3L التقليدية والسلائف قد أبلغ عنها 17. عزل هؤلاء السكان متميزة تحقق استخدام إستر سوكسينيميديل “كاربوكسيفلوريسسين” (CFSE)-الملون خلايا نخاع العظام (لتعقب تقسيم الخلايا) والثقافة في Flt3L لمدة 3 أيام. الخلايا ثم استنفاد الخلايا إيجابية لينج وفرزها إلى السلف والسلائف من السكان استناداً إلى تعبير CD11c 17. وكان نهج آخر لينين للفريق لتحديد المتكفل المبكر من العاصمة في ثقافة يحركها من السائل الدماغي النخاعي الآلية العالمية لفرز الخلايا استناداً إلى CD31 و Ly6C 18. وكان الهدف الأولى لإنشاء أسلوب مماثل للحصول على فروعها والسلائف من مودك يحركها من السائل الدماغي النخاعي الآلية العالمية. بسبب أنواع الخلايا المحددة التي تم إنشاؤها بواسطة GM-CSF، نحن تكييف النهج وفرز استراتيجية تستند إلى التعبير عن الجزيئات التي تم الإعراب عنها في مراحل مبكرة ولاحق للتنمية. ونحن في نهاية المطاف قرر أن Ly6C، CD115 (مستقبلات السائل الدماغي النخاعي-1)، وكانوا CD11c على علامات أفضل للتمييز بين هذه الخلية أنواع 10.
وهنا نقدم طريقة لعزل الخلايا على عدة مراحل متميزة للتنمية على طول الطريق من التمايز يقودها جنرال موتورز-CSF: المشترك النقوي السلف (CMP)، بلعم المحببات السلف (GMP)، الوحيدات، المشتقة من الوحيدات بلعم (موماك) والمشتقة من الوحيدات DC (مودك). السكان موماك يمكن كذلك عزلهم يستند إلى على مستوى الطبقة MHC التعبير الثاني، يكشف عن مودك سلائف سكان (مودب) 10. فنحن نستخدم خلية تنشيط الفلورية عالية السرعة الفرز استراتيجية (نظام مراقبة الأصول الميدانية) لعزل هؤلاء السكان 5 استناداً إلى التعبير عن Ly6C و CD115 و CD11c. ثم نظهر في دراسة هذه الخلايا بالوظيفية فحوصات الكشف عن استجاباتها لتحفيز بمب.
Protocol
Representative Results
Discussion
ويسهل هذا البروتوكول عزلة يحركها من السائل الدماغي النخاعي جنرال موتورز السلف والسلائف أنواع الخلايا بإعداد كافية لعدة أنواع من التحليلات بما في ذلك فحوصات الكيمياء الحيوية، فحوصات وظيفة الخلوية في المختبر، أو تقطير في فيفو. هذا الأسلوب يمثل تقدما كبيرا في مجال تطوير الخلايا ا…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ونحن ممتنون للمساعدة التقنية من “أليسون الكنيسة الطيور” في أوبورن جامعة مدرسة من الطب البيطري التدفق الخلوي المرفق، لتمويل من المعاهد الوطنية للصحة EHS R15 R15 AI107773 والخلوية وبرنامج البيولوجيا الجزيئية في جامعة أوبورن لفصل الصيف تمويل البحوث لاستعراض البرامج والميزانية.
Materials
| RPMI 1640 | Corning | 15-040-CV | |
| Fetal Calf Serum (FCS) | HyClone | SV30014.04 | to supplement complete medium and FWB |
| GlutaMAX | Gibco | 35050 | to supplement complete medium |
| 2-mercaptoethanol (2-ME) | MP Biomedical | 190242 | to supplement complete medium |
| 75mM Vacuum Filter | Thermo Scientific | 156-4045 | to sterilize complete media |
| ACK Lysis Buffer | Lonza | 10-548E | to lyse red blood cell |
| HEPES buffer | Corning | 21-020-CM | to rescue leukocytes after red blood cell lysis |
| Phosphate Buffered Saline (PBS), Dulbecco's | Lonza | 17-512F | must be endotoxin free; chilled at 4 °C |
| 35µm Cell filter | Falcon | 352235 | to break apart clumps before running through cytometer. |
| GM-CSF | Biosource | PMC2011 | usable concentration of 10ng/mL |
| Tissue cultured treated plate | VWR | 10062-896 | for bone marrow cells after harvest |
| Anti-Ly6C, Clone HK1.4 | Biolegend | 128018 | |
| Anti-CD115, Clone AFS98 | Tonbo Bioscience | 20-1152-U100 | |
| Anti-CD11c, Clone HL3 | BD Biosciences | 557400 | to differeniate CMP and MoDCs |
| MoFlo XPD Flow Cytometer | Beckman Coulter | ML99030 | |
| BD Accuri C6 | BD Biosciences | 660517 | |
| 100% Ethanol | Pharmco-Aaper | 111000200CSPP | |
| 60mm Petri Dish | Corning, Inc | 353002 | |
| 50mL Conical tube | VWR | 21008-242 | |
| C57BL/6 Mice | The Jackson Laboratory | 000664 | Female; 10-20 weeks old |
| Biosafety Hood | Thermo Scientific | 8354-30-0011 | |
| 10mL Syringe | BD Biosciences | 301604 | |
| 23-gauge needle | BD Biosciences | 305145 | |
| Centrifuge 5810 R | eppendorf | 22625501 | |
| FlowJo Software v10 | BD Biosciences | Version 10 | flowjo.com |
References
- Zhan, Y., Xu, Y., Lew, A. M. The regulation of the development and function of dendritic cell subsets by GM-CSF: more than a hematopoietic growth factor. Mol Immunol. 52, 30-37 (2012).
- Zhan, Y., et al. The inflammatory cytokine, GM-CSF, alters the developmental outcome of murine dendritic cells. Eur J Immunol. , (2012).
- van de Laar, L., Coffer, P. J., Woltman, A. M. Regulation of dendritic cell development by GM-CSF: molecular control and implications for immune homeostasis and therapy. Blood. 119, 3383-3393 (2012).
- Steinman, R. M., Inaba, K. Myeloid dendritic cells. J Leukoc Biol. 66, 205-208 (1999).
- Inaba, K., et al. Generation of large numbers of dendritic cells from mouse bone marrow cultures supplemented with granulocyte/macrophage colony-stimulating factor. J Exp Med. 176, 1693-1702 (1992).
- Steinman, R. M., Pack, M., Inaba, K. Dendritic cell development and maturation. Adv Exp Med Biol. , 1-6 (1997).
- Pierre, P., et al. Developmental regulation of MHC class II transport in mouse dendritic cells. Nature. 388, 787-792 (1997).
- Steinman, R. M., Witmer-Pack, M., Inaba, K. Dendritic cells: antigen presentation, accessory function and clinical relevance. Adv Exp Med Biol. , 1-9 (1993).
- Na, Y. R., Jung, D., Gu, G. J., Seok, S. H. GM-CSF Grown Bone Marrow Derived Cells Are Composed of Phenotypically Different Dendritic Cells and Macrophages. Mol Cells. 39, 734-741 (2016).
- Rogers, P. B., Driessnack, M. G., Hiltbold Schwartz, E. Analysis of the developmental stages, kinetics, and phenotypes exhibited by myeloid cells driven by GM-CSF in vitro. PLoS One. 12, e0181985 (2017).
- Helft, J., et al. GM-CSF Mouse Bone Marrow Cultures Comprise a Heterogeneous Population of CD11c(+)MHCII(+) Macrophages and Dendritic Cells. Immunity. 42, 1197-1211 (2015).
- Alloatti, A., Kotsias, F., Magalhaes, J. G., Amigorena, S. Dendritic cell maturation and cross-presentation: timing matters!. Immunol Rev. 272, 97-108 (2016).
- Jakubzick, C. V., Randolph, G. J., Henson, P. M. Monocyte differentiation and antigen-presenting functions. Nat Rev Immunol. 17, 349-362 (2017).
- Mbongue, J. C., Nieves, H. A., Torrez, T. W., Langridge, W. H. The Role of Dendritic Cell Maturation in the Induction of Insulin-Dependent Diabetes Mellitus. Frontiers in immunology. 8, 327 (2017).
- Shortman, K., Naik, S. H. Steady-state and inflammatory dendritic-cell development. Nat Rev Immunol. 7, 19-30 (2007).
- Xu, Y., Zhan, Y., Lew, A. M., Naik, S. H., Kershaw, M. H. Differential development of murine dendritic cells by GM-CSF versus Flt3 ligand has implications for inflammation and trafficking. J Immunol. 179, 7577-7584 (2007).
- Naik, S. H. Generation of large numbers of pro-DCs and pre-DCs in vitro. Methods Mol Biol. 595, 177-186 (2010).
- Nikolic, T., de Bruijn, M. F., Lutz, M. B., Leenen, P. J. Developmental stages of myeloid dendritic cells in mouse bone marrow. Int Immunol. 15, 515-524 (2003).
- Hettinger, J., et al. Origin of monocytes and macrophages in a committed progenitor. Nat Immunol. 14, 821-830 (2013).
- Fogg, D. K., et al. A clonogenic bone marrow progenitor specific for macrophages and dendritic cells. Science. 311, 83-87 (2006).
- Traver, D., et al. Development of CD8{alpha}-Positive Dendritic Cells from a Common Myeloid Progenitor. Science. 290, 2152-2154 (2000).
