إنشاء نموذج الماوس ثنائي الأنسنة TK-NOG لمسببات أمراض الكبد المرتبطة بفيروس نقص المناعة البشرية
Summary
يوفر هذا البروتوكول طريقة موثوقة لإنشاء الفئران أنسنة مع كل من الجهاز المناعي البشري وخلايا الكبد. الفئران المزدوجة التي تعاني من نقص المناعة التي تحققت عن طريق الحقن داخل الطحال من خلايا الكبد البشرية وCD34+ الخلايا الجذعية المكونة للدم عرضة للعدوى بفيروس نقص المناعة البشرية-1 وتلخيص تلف الكبد كما لوحظ في المرضى المصابون بفيروس نقص المناعة البشرية.
Abstract
وعلى الرغم من زيادة العمر المتوقع للمرضى المصابين بفيروس نقص المناعة البشرية-1 (HIV-1)، فقد برز مرض الكبد كسبب شائع لاعتلالهم. ولا يزال علم أمراض المناعة في الكبد الناجم عن فيروس نقص المناعة البشرية-1 بعيد المنال. يمكن للنماذج الحيوانية الصغيرة xenograft مع خلايا الكبد البشرية والجهاز المناعي البشري تلخيص البيولوجيا البشرية من مسببات الأمراض المرض. هنا، يتم وصف بروتوكول لإنشاء نموذج الماوس المزدوج أنسنة من خلال خلايا الكبد البشرية وCD34+ الخلايا الجذعية المكونة للدم / الخلايا السلف (HSPCs) زرع، لدراسة أمراض المناعة الكبد كما لوحظ في المرضى المصابين بفيروس نقص المناعة البشرية. ولتحقيق إعادة تشكيل مزدوجة، فإن الذكور من المعارف التقليدية – NOG (NOD. Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Sug Tg(Alb-TK) يتم حقن الفئران داخل الحالبة بجرعات غانسيكلوفير (GCV) للقضاء على خلايا الكبد المعدلة وراثيا الماوس، ومع treosulfan لتكييف nonmyeloablative، وكلاهما تسهيل نمو خلايا الكبد البشرية (HEP) وتطوير الجهاز المناعي البشري (HIS). يتم تقييم مستويات الزلال البشري (ALB) لتطعيم الكبد، ووجود الخلايا المناعية البشرية في الدم التي تم الكشف عنها عن طريق قياس التدفق يؤكد إنشاء الجهاز المناعي البشري. النموذج الذي تم تطويره باستخدام البروتوكول الموضح هنا يشبه مكونات متعددة من تلف الكبد من عدوى فيروس نقص المناعة البشرية-1. ويمكن أن يثبت أن إنشائها ضروري لإجراء دراسات عن العدوى المشتركة بفيروس التهاب الكبد ولتقييم العقاقير المضادة للفيروسات ومضادات الفيروسات العكوسة.
Introduction
ومنذ ظهور العلاج المضاد للفيروسات العكوسة، حدث انخفاض كبير في الوفيات المتصلة بالعدوى الأحادية لفيروس نقص المناعة البشرية -1. ومع ذلك، فقد برز مرض الكبد كسبب شائع للاعتلال في المرضى المصابين بفيروس نقصالمناعةالبشرية1،2. العدوى المشتركة لفيروسات التهاب الكبد مع فيروس نقص المناعة البشرية-1 هي أكثر شيوعا، مما يمثل 10٪ – 30٪ من الأشخاص المصابين بفيروس نقص المناعة البشرية في الولايات المتحدة3،4،5.
وتحد خصوصية المضيف لفيروسات فيروس نقص المناعة البشرية-1 والتهاب الكبد من فائدة النماذج الحيوانية الصغيرة في دراسة الأمراض المعدية الخاصة بالإنسان أو للتحقيق في جوانب متعددة من مسببات أمراض الكبد المرتبطة بفيروس نقص المناعة البشرية-1. الفئران التي تعاني من نقص المناعة التي تسمح بتطعيم الخلايا البشرية و / أو الأنسجة (تسمى نماذج الماوس أنسنة) هي نماذج حيوانية مقبولة للدراسات ما قبل السريرية6،7،8. منذ إدخال الفئران الأنسنة في أوائل 2000s، دراسات ما قبل السريرية متعددة من سمية الكبد البشري cholestatic، مسببات الأمراض الخاصة بالإنسان، بما في ذلك فيروس نقص المناعة البشرية-1 والاضطرابات العصبية المعرفية المرتبطة بفيروس نقص المناعة البشرية، فيروس ابشتاين بار، التهاب الكبد، وغيرها الأمراض المعدية، وقد تم التحقيق في هذه الفئران6،9،10،11. وقد وضعت نماذج الماوس متعددة لCD34+ HSPCs و / أو زرع خلايا الكبد البشرية منذ فترة طويلة، وقد تحسنت مع مرور الوقت لدراسة مسببات الأمراض من فيروس التهاب الكبد B (HBV) المرتبطة بمرض الكبد12، 13 , 14.وتستند عدة نماذج لزراعة HSPC وخلايا الكبد البشرية (HEP) على سلالات، والمعروفة باسم NOG (NOD. Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Sug/JicTac)8,13,NSG (NOD. Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ)15,Balb/C-Rag2-/- γc-/- (Rag2tm1.1Flv Il2rgtm1.1Flv/J)12,and fah-/- NOD rag1-/- [إيل2رغهمل] فأرة16. ومع ذلك، فإن لكل نموذج مزاياه وقيوده الخاصة؛ على سبيل المثال، الفئران ذات الأنسنة المزدوجة AFC8 لـ HEPs والخلايا الجذعية البشرية (HSCs) على خلفية Balb/C-Rag2-/- γc-/- الخلفية تمكن من تطعيم الخلايا المناعية وHSCs بنجاح، ولكن هناك غياب مستضد محدد T- و B-الخلية استجابة في هذا النموذج12. وتشمل الشواغل الرئيسية في إعادة تشكيل الفئران ذات الأنسنة المزدوجة الطعوم دون المستوى الأمثل، وعدم وجود نماذج مناسبة لدعم الأنسجة المختلفة، والظروف غير المتطابقة، ورفض المناعة، أو مرض الكسب غير المشروعمقابلالمضيف (GVHD)، والتقنية الصعوبات، مثل التلاعب محفوفة بالمخاطر مع حديثي الولادة وارتفاع معدلات الوفيات بسبب تشوهات التمثيل الغذائي13.
على الرغم من أن الفئران أنسنة قد استخدمت لبحوث فيروس نقص المناعة البشرية لسنوات عديدة17،18،19، واستخدام الفئران أنسنة لدراسة تلف الكبد الناجم عن فيروس نقص المناعة البشرية-1 كان محدودا20. أبلغنا سابقا إنشاء نموذج الماوس TK-NOG المزدوج أنسنة وتطبيقها في أمراض الكبد المرتبطة بفيروس نقص المناعة البشرية8. هذا النموذج يظهر الطعوم قوية من الكبد والخلايا المناعية ويلخص مسببات الأمراض عدوى فيروس نقص المناعة البشرية. تقدم هذه المناقشة بروتوكولًا مفصلًا، بما في ذلك الخطوات الأكثر أهمية في زرع خلايا الكبد البشرية. كما يُقدَّم وصف للمركبات ذات الـ HSPCs اللازمة لنجاح عملية الطعوم من الملوثات التي تكون خالية من الحشرات وإنشاء نظام مناعي وظيفي في فئران TK-NOG. يتم تفصيل استخدام هذه الفئران لدراسة مسببات الأمراض المناعية الكبد المرتبطة بفيروس نقص المناعة البشرية. يتم استخدام الفئران الذكور TK-NOG تحمل فيروس الهربس البسيط محددة نوع 1 كيناز الثيميدين (HSV-TK) transgene. خلايا كبد الماوس التي تعبر عن هذا الترانسجين يمكن بسهولة أن تُقال بعد التعرض لفترة وجيزة لجرعة غير سامة من GCV. يتم الحفاظ على خلايا الكبد البشرية المزروعة بشكل مستمر داخل كبد الفأر دون أدوية خارجية21. كما يتم شروط مسبقة الفئران مع جرعات nonmyeloablative من treosulfan لخلق مكانة في نخاع العظام الماوس للخلايا البشرية8. يتم حقن الفئران TK-NOG نقص المناعة داخل مع HEPs وHSPCs متعددة القوى. ثم يتم رصد الفئران بانتظام لإعادة تشكيل الدم والكبد عن طريق علم الدم المناعي وقياسات مستويات المصل الإنسان الزلال، على التوالي. يتم حقن الفئران مع إعادة تشكيل ناجحة لأكثر من 15٪ لكل من الخلايا المناعية البشرية وHEPs داخل احصام الله مع فيروس نقص المناعة البشرية-1. يمكن تقييم تأثير فيروس نقص المناعة البشرية على الكبد في وقت مبكر من 4 – 5 أسابيع بعد العدوى. ومن الأهمية بمكان ملاحظة أنه، نظرا لاستخدام فيروس نقص المناعة البشرية-1، يجب اتخاذ جميع الاحتياطات اللازمة أثناء التعامل مع الفيروس وحقنه في الفئران.
Protocol
Representative Results
Discussion
الكبد يتعرض للخطر وتلف في المرضى المصابين بفيروس نقص المناعة البشرية24. النماذج الحيوانية الصغيرة التجريبية لدراسة أمراض الكبد البشري في وجود فيروس نقص المناعة البشرية-1 محدودة للغاية، على الرغم من توافر عدد قليل من النماذج الحيوانية المزروعة بصورة مشتركة مع CD34+ HSPCs وخل…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وقد دعم هذا العمل منحة المعهد الوطني للصحة R24OD018546 (إلى L.Y.P. وS.G.). يود المؤلفون أن يشكروا ويزي لي، دكتوراه، للمساعدة في الإجراءات الجراحية، أماندا برانش وودز، بي.س.، يان تشنغ لعلم المناعة، أعضاء مرفق أبحاث قياس الخلايا التابع للأمم المتحدة المدير فيليب هليسلي، دكتوراه، فيكتوريا ب. سميث، ب. س. وسامانثا وول، ب. س. ، أعضاء مرفق الفحص المجهري المتقدم جانيس أ. تايلور، ب. س. وجيمس ر. تالاسكا، B.S.، للحصول على الدعم التقني. ويقر المؤلفان بالدكتورمامورو يتو وهيروشي سوميزو من وكالة الأحوال الجوية الدولية لتوفيرالفئران TK-NOG والدكتور يواكيم بومغارت لتوفير هالة التريوسولفان. ويشكر المؤلفون الدكتور أدريان كوسترز، من اللجنة، على مساهمتها التحريرية في المخطوطة.
Materials
| 27G1/2" needles | BD biosciences | 305109 | |
| 30G1/2" needles | BD biosciences | 305106 | |
| 5 mL polystyrene round-bottom tube 12 x 75 mm style | Corning | 352054 | |
| BD 1 mL Tuberculin Syringe Without Needle | BD biosciences | 309659 | |
| BD FACS array bioanalyzer | BD Biosciences | For purity check of eluted CD34+ cells | |
| BD FACS array software | BD Biosciences | Software to analysis acquired CD34+ cell on FACS array | |
| BD FACS lysing solution | BD Biosciences | 349202 | To lyse red blood cells |
| BD LSR II | BD Biosciences | Instrument for acquisiton of flow cytometry samples | |
| BD Vacutainer Plastic Blood Collection Tube | BD biosciences | BD 367874 | To collect Cord blood |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-aldrich | A9576 | |
| Buprenorphine | Controlled substance and pain-killer | ||
| CD14-PE | BD Biosciences | 555398 | Specific to human |
| CD19-BV605 | BD Biosciences | 562653 | Specific to human |
| CD34 MicroBead Kit, human | Miltenyi Biotec | 130-046-702 | For isoation of CD34+ HSPC |
| CD34-PE, human | Miltenyi Biotec | 130-081-002 | Antibody used for purity check of eluted CD34+ cells |
| CD3-AF700 | BD Biosciences | 557943 | Specific to human |
| CD45-PerCPCy5.5 | BD Biosciences | 564105 | Specific to human |
| CD4-APC | BD Biosciences | 555349 | Specific to human |
| CD8-BV421 | BD Biosciences | 562428 | Specific to human |
| Cell counting slides | Bio-rad | 1450015 | |
| ChargeSwitch gDNA Mini Tissue Kit | Thermofisher scientific | CS11204 | for extraction of genomic DNA from ear piece |
| Cobas Amplicor system v1.5 | Roche Molecular Diagnostics | bioanalyzer to measure viral load | |
| Cotton-tipped applicators | McKesson | 24-106-2S | |
| Cytokeratin-18 (CK18) | DAKO | M7010 | Specific to human |
| DMSO (Dimethyl sulfoxide) | Sigma-aldrich | D2650-5X5ML | |
| Extension set Microbore Slide Clamp(s) Fixed Male Luer Lock. L: 60 in L: 152 cm PV: 0.55 mL Fluid Path Sterile | BD biosciences | 30914 | Attached to dispensing pippet and to load with HSPC and HEP suspesion |
| FACS Diva version 6 | BD Biosciences | flow cytometer software required for acqusition of sample | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco | 10438026 | |
| FLOWJO analysis software v10.2 |
FLOWJO, LLC | flow cytometry analysis software | |
| Ganciclovir | APP Pharmaceuticals, Inc. | 315110 | Prescripition drug |
| Greiner MiniCollect EDTA Tubes | Greiner bio-one | 450475 | |
| Hepatocytes thawing medium | Triangle Research Labs | MCHT50 | |
| Horizon Open Ligating Clip Appliers | Teleflex | 537061 | To hold the ligating clips |
| Hospira Sterile Water for Injection | ACE surgical supply co. Inc. | 001-1187 | For dilution of Buprenorphine (pain-killer) |
| Human Albumin ELISA Quantitation Set | Bethyl laboratories | E80-129 | For assesing human albumin levels in mouse serum |
| Human hepatocyte | Triangle Research Labs | HUCP1 | Cryopreserved human hepatocytes, induction qualified |
| Iris Scissors, Straight | Ted Pella, Inc. | 13295 | |
| Lancet | MEDIpoint | Goldenrod 5 mm | |
| LS columns | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | Used to entrap CD34+ microbeads (positive selection) |
| Lymphocyte Separation Medium (LSM) | MP Biomedicals | 50494 | For isoation of lymphocytes from peripheral blood |
| MACS MultiStand | Miltenyi Biotec | 130-042-303 | holds Qudro MACS seperator and LS columns |
| McPherson-Vannas Micro Dissecting Spring Scissors | Roboz Surgical Instrument Co. | RS-5605 | Used to make an incision on skin to expose spleen |
| Micro Dissecting Forceps | Roboz Surgical Instrument Co. | RS-5157 | to hold and pull out spleen from peritoneal cavity |
| mouse CD45-FITC | BD Biosciences | 553080 | mouse-specific |
| PBS (Phosphate Buffered Saline) | Hyclone | SH30256.02 | |
| Qudro MACS separator | Miltenyi Biotec | 130-090-976 | holds four LS columns |
| RPMI 1640 medium | Gibco | 11875093 | |
| StepOne Plus Real Time PCR | Applied Biosystems | Instrument used to genotype | |
| Stepper Series Repetitive Dispensing Pipette 1ml | DYMAX CORP | T15469 | Used to dispense HSPC and HEP supension in controlled manner |
| Suturevet PGA synthetic absorbale suture | Henry Schein Animal Health | 41178 | Suturing of skin and peritoneum |
| TaqMan Gene Expression Master Mix | Thermofisher scientific | 4369016 | |
| TC20 automated cell counter | Bio-rad | 1450102 | |
| TK-NOG mice | Provided by the Central Institute for Experimental Animals (CIEA, Japan; Drs. Mamoru Ito and Hiroshi Suemizu) | ||
| Treosulfan | Medac GmbH | Provided by Dr. Joachim Baumgart (medac GmbH) | |
| Trypan Blue | Bio-rad | 1450022 | |
| Vannas-type Micro Scissors, Straight, 80mm L | Ted Pella, Inc. | 1346 | Used to make an incision on skin to expose spleen |
| Weck hemoclip traditional titanium ligating clips | Esutures | 523700 | To ligate the spleen post-injection |
References
- Smith, C., et al. Factors associated with specific causes of death amongst HIV-positive individuals in the D:A:D Study. AIDS. 24 (10), 1537-1548 (2010).
- Puoti, M., et al. Mortality for liver disease in patients with HIV infection: a cohort study. Journal of Acquired Immune Deficiency Syndromes. 24 (3), 211-217 (2000).
- Rodriguez-Mendez, M. L., Gonzalez-Quintela, A., Aguilera, A., Barrio, E. Prevalence, patterns, and course of past hepatitis B virus infection in intravenous drug users with HIV-1 infection. The American Journal of Gastroenterology. 95 (5), 1316-1322 (2000).
- Scharschmidt, B. F., et al. Hepatitis B in patients with HIV infection: relationship to AIDS and patient survival. Annals of Internal Medicine. 117 (10), 837-838 (1992).
- Lacombe, K., Rockstroh, J. HIV and viral hepatitis coinfections: advances and challenges. Gut. 61, 47-58 (2012).
- Brehm, M. A., Jouvet, N., Greiner, D. L., Shultz, L. D. Humanized mice for the study of infectious diseases. Current Opinion in Immunology. 25 (4), 428-435 (2013).
- Billerbeck, E., et al. Humanized mice efficiently engrafted with fetal hepatoblasts and syngeneic immune cells develop human monocytes and NK cells. The Journal of Hepatology. 65 (2), 334-343 (2016).
- Dagur, R. S., et al. Human hepatocyte depletion in the presence of HIV-1 infection in dual reconstituted humanized mice. Biology Open. 7 (2), (2018).
- Gaska, J. M., Ploss, A. Study of viral pathogenesis in humanized mice. Current Opinion in Virology. 11, 14-20 (2015).
- Gorantla, S., Poluektova, L., Gendelman, H. E. Rodent models for HIV-associated neurocognitive disorders. Trends in Neurosciences. 35 (3), 197-208 (2012).
- Xu, D., et al. Chimeric TK-NOG mice: a predictive model for cholestatic human liver toxicity. The Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 352 (2), 274-280 (2015).
- Washburn, M. L., et al. A humanized mouse model to study hepatitis C virus infection, immune response, and liver disease. Gastroenterology. 140 (4), 1334-1344 (2011).
- Gutti, T. L., et al. Human hepatocytes and hematolymphoid dual reconstitution in treosulfan-conditioned uPA-NOG mice. The American Journal of Pathology. 184 (1), 101-109 (2014).
- Strick-Marchand, H., et al. A novel mouse model for stable engraftment of a human immune system and human hepatocytes. PLoS One. 10 (3), 0119820 (2015).
- Keng, C. T., et al. Characterisation of liver pathogenesis, human immune responses and drug testing in a humanised mouse model of HCV infection. Gut. 65 (10), 1744-1753 (2016).
- Li, F., Nio, K., Yasui, F., Murphy, C. M., Su, L. Studying HBV Infection and Therapy in Immune-Deficient NOD-Rag1-/-IL2RgammaC-null (NRG) Fumarylacetoacetate Hydrolase (Fah) Knockout Mice Transplanted with Human Hepatocytes. Methods in Molecular Biology. 1540, 267-276 (2017).
- Poluektova, L. Y., Garcia, J. V., Koyanagi, Y., Manz, M. G., Tager, A. M. . Humanized Mice for HIV Research. , (2014).
- Cheng, L., Ma, J., Li, G., Su, L. Humanized Mice Engrafted With Human HSC Only or HSC and Thymus Support Comparable HIV-1 Replication, Immunopathology, and Responses to ART and Immune Therapy. Frontiers in Immunology. 9, 817 (2018).
- Zhang, L., Su, L. HIV-1 immunopathogenesis in humanized mouse models. Cellular & Molecular Immunology. 9 (3), 237-244 (2012).
- Nunoya, J., Washburn, M. L., Kovalev, G. I., Su, L. Regulatory T cells prevent liver fibrosis during HIV type 1 infection in a humanized mouse model. The Journal of Infectious Diseases. 209 (7), 1039-1044 (2014).
- Hasegawa, M., et al. The reconstituted ‘humanized liver’ in TK-NOG mice is mature and functional. Biochemical and Biophysical Research Communications. 405 (3), 405-410 (2011).
- Higuchi, Y., et al. The human hepatic cell line HepaRG as a possible cell source for the generation of humanized liver TK-NOG mice. Xenobiotica. 44 (2), 146-153 (2014).
- Kosaka, K., et al. A novel TK-NOG based humanized mouse model for the study of HBV and HCV infections. Biochemical and Biophysical Research Communications. 441 (1), 230-235 (2013).
- Crane, M., Iser, D., Lewin, S. R. Human immunodeficiency virus infection and the liver. World Journal of Hepatology. 4 (3), 91-98 (2012).
- Bility, M. T., Li, F., Cheng, L., Su, L. Liver immune-pathogenesis and therapy of human liver tropic virus infection in humanized mouse models. Journal of Gastroenterology and Hepatology. 28, 120-124 (2013).
- Kong, L., et al. Low-level HIV infection of hepatocytes. Virology Journal. 9, 1-7 (2012).
- Dash, P. K., et al. Long-acting nanoformulated antiretroviral therapy elicits potent antiretroviral and neuroprotective responses in HIV-1-infected humanized mice. AIDS. 26 (17), 2135-2144 (2012).
- Sun, S., Li, J. Humanized chimeric mouse models of hepatitis B virus infection. International Journal of Infectious Diseases. 59, 131-136 (2017).
- Shafritz, D. A., Oertel, M. Model systems and experimental conditions that lead to effective repopulation of the liver by transplanted cells. The International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 43 (2), 198-213 (2011).
- Almeida-Porada, G., Porada, C. D., Chamberlain, J., Torabi, A., Zanjani, E. D. Formation of human hepatocytes by human hematopoietic stem cells in sheep. Blood. 104 (8), 2582-2590 (2004).
- Streetz, K. L., et al. Hepatic parenchymal replacement in mice by transplanted allogeneic hepatocytes is facilitated by bone marrow transplantation and mediated by CD4 cells. Hepatology. 47 (2), 706-718 (2008).
