Summary

Estabelecimento do modelo humanizado duplo do rato de TK-NOG para a patogénese HIV-associada do fígado

Published: September 11, 2019
doi:

Summary

Este protocolo fornece um método confiável para estabelecer camundongos humanizados com o sistema imunológico humano e células hepáticas. Os ratos imunodeficientes reconstituídos duplos conseguidos através da injeção pseudoaneurysms de hepatócitos humanos e de pilhas de haste hematopoietic de CD34+ são suscetíveis à infecção do vírus-1 da imunodeficiência humana e recapitulam dano de fígado como observado em Doentes infectados pelo VIH.

Abstract

Apesar da expectativa de vida aumentada dos pacientes contaminados com o vírus de imunodeficiência humana-1 (HIV-1), a doença de fígado emergiu como uma causa comum de sua morbosidade. A Imunopatologia hepática causada pelo HIV-1 permanece elusiva. Os modelos animais pequenos do xenograft com hepatócitos humanos e o sistema imunitário humano podem recapitular a biologia humana da patogénese da doença. Nisto, um protocolo é descrito para estabelecer um modelo humanizado duplo do rato com os hepatócitos humanos e o transplante de CD34+ hematopoietic/pilhas do progenitor (hspcs), para estudar a Imunopatologia do fígado como observado em pacientes HIV-contaminados. Para conseguir a reconstituição dupla, o macho TK-NOG (NOD. CG-Prkdcscid Il2rgtm1Sug TG (ALB-tk) 7-2/shijic) os camundongos são injetados intraperitonealmente com doses de ganciclovir (GCV) para eliminar as células hepáticas transgênicas do camundongo, e com treosulfano para condicionamento não mieloablativo, ambos facilitar o desenvolvimento de hepatócitos humanos (HEP) e do sistema imunológico humano (HIS). Os níveis da albumina humana (ALB) são avaliados para o Engraftment do fígado, e a presença de pilhas imunes humanas no sangue detectado pela citometria do fluxo confirma o estabelecimento do sistema imunitário humano. O modelo desenvolvido utilizando o protocolo aqui descrito assemelha-se a múltiplos componentes de lesão hepática por infecção pelo HIV-1. Seu estabelecimento poderia revelar-se essencial para estudos da co-infecção do vírus de hepatite e para a avaliação de antivirais e de drogas antiretroviral.

Introduction

Desde o advento da terapia antirretroviral, houve uma diminuição substancial nos óbitos relacionados à monoinfecção pelo HIV-1. Noentanto, adoença hepática surgiu como uma causa comum de morbidade em pacientes infectados pelo HIV1,2. Coinfecções de vírus da hepatite com infecção pelo HIV-1 são mais comuns, representando 10%-30% das pessoas infectadas pelo HIV nos Estados Unidos3,4,5.

A especificidade do hospedeiro do HIV-1 e dos vírus da hepatite limita a utilidade de pequenos modelos animais para estudar doenças infecciosas específicas do homem ou para investigar múltiplos aspectos da patogênese hepática associada ao HIV-1. Camundongos imunodeficientes que permitem o Engraftment de células humanas e/ou tecidos (denominados modelos humanizados do camundongo) são modelos animais aceitáveis para estudos pré-clínicos6,7,8. Desde a introdução de camundongos humanizados no início dos anos 2000, vários estudos pré-clínicos de toxicidade hepática humana colestática, patógenos específicos do homem, incluindo HIV-1 e distúrbios neurocognitivos associados ao HIV, vírus Epstein Barr, hepatite e outros doençasinfecciosas, foraminvestigadas nesses camundongos6,9,10,11. Os modelos múltiplos do rato para CD34+ hspcs e/ou a transplantação humana do hepatócito têm sido desenvolvidos por muito tempo e melhoraram sobre o tempo para estudar a patogénese da doença do vírus de hepatite B (HBV)-doença de fígado associada12, 13 anos de , 14. vários modelos para hspc e hepatócitos humanos (HEP) transplante são baseados em cepas, conhecido como Nog (Nod. CG-prkdcscid Il2rgtm1Sug/jictac)8,13, NSG (Nod. CG-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/Szj)15, Balb/C-Rag2-/- γc-/- (Rag2TM 1.1 FLV Il2rgTM 1.1 FLV/j)12, e Fah-/- Nod rag1-/- il2rγnull mouse16. No entanto, cada modelo tem suas próprias vantagens e limitações; por exemplo, AFC8 camundongos humanizados duplos para HEPs e células-tronco humanas (HSCs) em um Balb/C-Rag2-/- γc-/- background permite o bem sucedido Engraftment de células imunes e hscs, mas há uma ausência de um antígeno-específico T-e B-Cell resposta neste modelo12. As principais preocupações em reconstituir camundongos humanizados duplos incluem o Engraftment suboptimal, a falta de modelos adequados para suportar diferentes tecidos, condições incompatíveis, rejeição imune, ou doença do enxertocontrao hospedeiro (DECH), e técnicas dificuldades, como manipulações de risco com recém-nascidos e altas taxas de mortalidade devido a anormalidades metabólicas13.

Embora os camundongos humanizados tenham sido usados para a pesquisa por HIV há muitos anos17,18,19, o uso de camundongos humanizados para estudar os danos hepáticos causados pelo HIV-1 tem sido limitado20. Nós relatamos previamente o estabelecimento de um modelo humanizado duplo do rato de TK-NOG e de sua aplicação na doença de fígado HIV-associada8. Este modelo mostra o Engraftment robusto do fígado e das pilhas imunes e recapitula a patogénese da infecção do HIV. Esta discussão apresenta um protocolo detalhado, incluindo os passos mais críticos no transplante de hepatócitos humanos. Uma descrição dos HSPCs exigidos para um Engraftment bem sucedido dos HEPs e o estabelecimento de um sistema imune funcional em ratos de TK-NOG é apresentada igualmente. O uso destes ratos para estudar o imunopatogênese HIV-associado do fígado é detalhado. Os ratos masculinos de TK-Nog que carreg um tipo fígado-específico do vírus de palavra simples de herpes-1 transgene da quinase do timidina (HSV-tk) são usados. As células hepáticas do rato que expressam este transgene podem ser facilmente abladas após uma breve exposição a uma dose não tóxica de GCV. As pilhas de fígado humanas transplantadas são mantidas estàvel dentro do fígado do rato sem medicina exógena21. Os camundongos também são pré-condicionados com doses nonmyeloablative de treosulfan para criar um nicho na medula óssea do rato para células humanas8. Os camundongos imunodeficientes TK-NOG são injetados intrasplenicamente com HEPs e HSPCs multipotentes. Os ratos são monitorados regularmente para a reconstituição do sangue e do fígado pelo imunofenotipagem do sangue e pelas medidas de níveis da humano-albumina do soro, respectivamente. Camundongos com uma reconstituição bem-sucedida de mais de 15% para ambas as células imunes humanas e HEPs são injetados intraperitonealmente com HIV-1. O efeito do HIV no fígado pode ser avaliado tão cedo quanto 4-5 semanas pós-infecção. É importante notar que, porque o HIV-1 é usado, todas as precauções necessárias devem ser tomadas durante o manuseio do vírus e injetá-lo em camundongos.

Protocol

Este protocolo foi aprovado pelo Comitê institucional de cuidados e uso de animais (IACUC) no centro médico da Universidade de Nebraska. Nota: Obter a aprovação do IACUC local antes de realizar experimentos em animais. 1. processamento de sangue do cordão umbilical e o isolamento de HSPCs humanos Realize todas as etapas do protocolo condições estéreis em armários de fluxo laminar. Tome o sangue do cordão umbilical (CB) …

Representative Results

O estabelecimento de um modelo humanizado duplo do rato com fígado humano e pilhas imunes pode facilmente ser monitorado em cada etapa com ELISA muito simples e cytometry do fluxo, respectivamente. A citometria de fluxo é realizada regularmente para avaliar o desenvolvimento de um sistema imunológico funcional e para ver o efeito da infecção pelo HIV nas células imunes. Em camundongos humanizados duplos, o desenvolvimento de células imunes funcionais pode variar de 15% a 90% da por…

Discussion

O fígado está comprometido e danificado em pacientes infectados pelo HIV24. Modelos experimentais de animais pequenos para o estudo de doenças hepáticas humanas na presença de HIV-1 é extremamente limitado, apesar da disponibilidade de alguns modelos animais cotransplantados com CD34+ hspcs e hepatócitos7,12, a 25. Em experimentos in vitro, os hepatócitos são mostrados para ter infecç…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Este trabalho foi apoiado pelo Instituto Nacional de saúde conceder R24OD018546 (para L.Y.P. e SG). Os autores gostariam de agradecer a Weizhe li, Ph.D., pela ajuda em procedimentos cirúrgicos, Amanda Branch Woods, B.S., Yan Cheng para imunohistologia, membros da unidade de pesquisa de citometria de fluxo da UNMC diretor Phillip Hexley, Ph.D., Victoria B. Smith, B.S., e Samantha Wall, B.S., UNMC avançada microscopia membros do núcleo da instalação Janice A. Taylor, B.S., e James R. talaska, B.S., para o apoio técnico. Os autores reconhecem os Drs. Mamoru Ito e Hiroshi Suemizu da CIEA por fornecerem camundongos TK-NOG e o Dr. Joachim Baumgart por fornecerem treosulfan. Os autores agradecem ao Dr. Adrian Koesters, UNMC, por sua contribuição editorial para o manuscrito.

Materials

27G1/2" needles BD biosciences 305109
30G1/2" needles BD biosciences 305106
5 mL polystyrene  round-bottom tube 12 x 75 mm style Corning 352054
BD 1 mL Tuberculin Syringe Without Needle BD biosciences 309659
BD FACS array bioanalyzer  BD Biosciences For purity check of eluted CD34+ cells 
BD FACS array software BD Biosciences Software to analysis acquired CD34+ cell on FACS array
BD FACS lysing solution BD Biosciences 349202 To lyse red blood cells
BD LSR II BD Biosciences Instrument for acquisiton of flow cytometry samples
BD Vacutainer Plastic Blood Collection Tube BD biosciences BD 367874 To collect Cord blood
Bovine Serum Albumin  Sigma-aldrich A9576
Buprenorphine Controlled substance and pain-killer
CD14-PE BD Biosciences 555398 Specific to human
CD19-BV605 BD Biosciences 562653 Specific to human
CD34 MicroBead Kit, human Miltenyi Biotec 130-046-702 For isoation of   CD34+ HSPC
CD34-PE, human Miltenyi Biotec 130-081-002 Antibody used for purity check of eluted CD34+ cells 
CD3-AF700 BD Biosciences 557943 Specific to human
CD45-PerCPCy5.5 BD Biosciences 564105 Specific to human
CD4-APC BD Biosciences 555349 Specific to human
CD8-BV421 BD Biosciences 562428 Specific to human
Cell counting slides Bio-rad 1450015
ChargeSwitch gDNA Mini Tissue Kit Thermofisher scientific CS11204 for extraction of genomic DNA from ear piece
Cobas Amplicor system v1.5  Roche Molecular Diagnostics bioanalyzer to measure viral load
Cotton-tipped applicators   McKesson 24-106-2S
Cytokeratin-18 (CK18) DAKO M7010 Specific to human
DMSO (Dimethyl sulfoxide) Sigma-aldrich D2650-5X5ML
Extension set Microbore Slide Clamp(s) Fixed Male Luer Lock. L: 60 in L: 152 cm PV: 0.55 mL Fluid Path Sterile BD biosciences 30914 Attached to dispensing pippet and to load with HSPC and HEP suspesion
FACS Diva version 6 BD Biosciences flow cytometer software required for  acqusition of sample
Fetal Bovine Serum (FBS) Gibco 10438026
FLOWJO analysis software
v10.2
FLOWJO, LLC flow cytometry analysis software
Ganciclovir APP Pharmaceuticals, Inc. 315110 Prescripition drug
Greiner MiniCollect EDTA Tubes Greiner bio-one 450475
Hepatocytes thawing medium  Triangle Research Labs  MCHT50
Horizon Open Ligating Clip Appliers Teleflex 537061 To hold the ligating clips
Hospira Sterile Water for Injection ACE surgical supply co. Inc. 001-1187 For dilution of Buprenorphine (pain-killer)
Human Albumin ELISA Quantitation Set Bethyl laboratories E80-129 For assesing human albumin levels in mouse serum
Human hepatocyte Triangle Research Labs  HUCP1  Cryopreserved human hepatocytes, induction qualified 
Iris Scissors, Straight Ted Pella, Inc. 13295
Lancet MEDIpoint Goldenrod 5 mm
LS columns  Miltenyi Biotec 130-042-401 Used to entrap CD34+ microbeads (positive selection)
Lymphocyte Separation Medium (LSM) MP Biomedicals 50494 For isoation of   lymphocytes from peripheral blood
MACS MultiStand Miltenyi Biotec 130-042-303 holds Qudro MACS seperator and LS columns
McPherson-Vannas Micro Dissecting Spring Scissors Roboz Surgical Instrument Co. RS-5605 Used to make an incision on skin to expose spleen
Micro Dissecting Forceps Roboz Surgical Instrument Co. RS-5157  to hold and pull out spleen from peritoneal cavity
mouse CD45-FITC BD Biosciences 553080 mouse-specific
PBS (Phosphate Buffered Saline) Hyclone SH30256.02
Qudro MACS separator  Miltenyi Biotec 130-090-976 holds four LS columns
RPMI 1640 medium Gibco 11875093
StepOne Plus Real Time PCR  Applied Biosystems Instrument used  to  genotype
Stepper Series Repetitive Dispensing Pipette 1ml DYMAX CORP T15469 Used to  dispense  HSPC and HEP supension in controlled manner
Suturevet PGA synthetic absorbale suture Henry Schein Animal Health 41178 Suturing of skin and peritoneum
TaqMan Gene Expression Master Mix Thermofisher scientific 4369016
TC20 automated cell counter Bio-rad 1450102
TK-NOG mice  Provided by the Central Institute for Experimental Animals (CIEA, Japan; Drs. Mamoru Ito and Hiroshi Suemizu)
Treosulfan Medac GmbH Provided by  Dr. Joachim Baumgart (medac GmbH) 
Trypan Blue Bio-rad 1450022
Vannas-type Micro Scissors, Straight, 80mm L Ted Pella, Inc. 1346 Used to make an incision on skin to expose spleen
Weck hemoclip traditional titanium ligating clips Esutures 523700 To ligate the spleen post-injection

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Dagur, R. S., Wang, W., Makarov, E., Sun, Y., Poluektova, L. Y. Establishment of the Dual Humanized TK-NOG Mouse Model for HIV-associated Liver Pathogenesis. J. Vis. Exp. (151), e58645, doi:10.3791/58645 (2019).

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