Istituzione del modello murino TK-NOG dualizzato per la patogenesi del fegato associata all'HIV
Summary
Questo protocollo fornisce un metodo affidabile per stabilire topi umanizzati sia con il sistema immunitario umano che con le cellule epatiche. I topi immunodeficienti contemporanei ricostituiti ottenuti tramite iniezione intrasplessica di epotociti umani e CD34– cellule staminali ematopoietiche sono suscettibili di infezione da virus immunodeficienza umana-1 e ricapitolano i danni al fegato osservati pazienti affetti da HIV.
Abstract
Nonostante l’aumento dell’aspettativa di vita dei pazienti infettati da virus dell’immunodeficienza umana-1 (HIV-1), la malattia epatica è emersa come una causa comune della loro morbilità. L’immunopatologia epatica causata dall’HIV-1 rimane sfuggente. Piccoli modelli animali di xenotrapianto con epatociti umani e sistema immunitario umano possono ricapitolare la biologia umana della patogenesi della malattia. In questo caso, viene descritto un protocollo per stabilire un modello murino dual eumanizzato attraverso epatociti umani e CD34– trapianto di cellule staminali/progenitrici ematopoietiche (HPG), per studiare l’immunopatologia epatica osservata nei pazienti affetti da HIV. Per ottenere la doppia ricostituzione, il TK-NOG maschile (NOD. Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Sug Tg(Alb-TK)7-2/ShiJic) topi sono iniettati intraperitonealmente con ganciclovir (GCV) dosi per eliminare le cellule epatiche transgeniche del topo, e con treosulfan per nonmieloalativi, entrambi i quali facilitare l’innesto di epatociti umani (HEP) e lo sviluppo del sistema immunitario umano (HIS). I livelli di albumina umana (ALB) sono valutati per l’innesto epatico, e la presenza di cellule immunitarie umane nel sangue rilevate dalla citometria di flusso conferma la creazione del sistema immunitario umano. Il modello sviluppato utilizzando il protocollo qui descritto assomiglia a molteplici componenti del danno al fegato da infezione da HIV-1. La sua istituzione potrebbe rivelarsi essenziale per gli studi sulla coinfezione del virus dell’epatite e per la valutazione di farmaci antivirali e antiretrovirali.
Introduction
Dall’avvento della terapia antiretrovirale, c’è stata una sostanziale diminuzione delle morti legate alla monoinfezione dell’HIV-1. Tuttavia, la malattia epatica è emersa come una causa comune di morbilità nei pazienti affetti da HIV1,2. Le coinfezioni dei virus dell’epatite con infezione da HIV-1 sono più comuni, rappresentando il 10% – 30% delle persone infettate dall’HIV negli Stati Uniti3,4,5.
La specificità ospite dei virus HIV-1 ed epatite limita l’utilità di piccoli modelli animali per studiare le malattie infettive specifiche dell’uomo o per studiare molteplici aspetti della patogenesi epatica associata all’HIV-1. I topi immunodeficienti che permettono l’innesto di cellule umane e/o tessuti (definite modelli murini umanizzati) sono modelli animali accettabili per studi preclinici6,7,8. Dall’introduzione di topi umanizzati nei primi anni 2000, molteplici studi preclinici sulla tossicità del fegato umano colestatico, patogeni specifici dell’uomo, tra cui HIV-1 e disturbi neurocognitivi associati all’HIV, virus Epstein Barr, epatite e altri malattie infettive, sono state studiate in questi topi6,9,10,11. Sono stati sviluppati da tempo molteplici modelli murini per CD34– HSPC e/o trapianti di epatociti umani e sono migliorati nel tempo per studiare la patogenesi patogena del virus dell’epatite B associata al virus dell’epatite B (HBV)12, 13 del sistema , 14.Diversi modelli per il trapianto di HSPC e epatocito umano (HEP) si basano su ceppi, noti come NOG (NOD. Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Sug/JicTac)8,13, NSG (NOD. Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ)15, Balb/C-Rag2— s-c -/- (Rag2tm1.1Flv Il2rgtm1.1Flv/J)12, e fah-/- NOD rag1-/- il2 -rnull mouse16. Tuttavia, ogni modello ha i propri vantaggi e limitazioni; ad esempio, il doppio effetto di topi umanizzati AFC8 per HEP e cellule staminali umane (HSC) su un fondo AFC8 -C-Rag2-/-c -/- consente il successo dell’innesto di cellule immunitarie e HSC, ma vi è l’assenza di un risposta in questo modello12. Le principali preoccupazioni nella ricostruzione di topi umanizzatidoppiincludono l’innesto non ottimale, la mancanza di modelli adatti per supportare diversi tessuti, condizioni non corrispondenti, il rigetto immunitario o la malattia innesto contro l’ospite (GVHD) e la malattia difficoltà, come manipolazioni rischiose con neonati e alti tassi di mortalità a causa di anomalie metaboliche13.
Anche se i topi umanizzati sono stati utilizzati per la ricerca sull’HIV per molti anni17,18,19, l’uso di topi umanizzati per studiare i danni al fegato causati dall’HIV-1 è stato limitato20. In precedenza abbiamo riferito l’istituzione di un modello murino TK-NOG dualizzato e la sua applicazione nella malattia epatica associata all’HIV8. Questo modello mostra il robusto innesto di fegato e cellule immunitarie e riassume la patogenesi dell’infezione da HIV. Questa discussione presenta un protocollo dettagliato, che include i passaggi più critici nel trapianto di epatociti umani. Viene inoltre presentata una descrizione degli HSPC necessari per un innesto di successo degli HEP e la creazione di un sistema immunitario funzionale nei topi TK-NOG. L’uso di questi topi per studiare l’immunopatogene epatica associata all’HIV è dettagliato. Vengono utilizzati topi maschi TK-NOG che trasportano un virus simplex specifico del fegato di tipo 1 della chinasi di timina (HSV-TK). Le cellule del fegato di topo che esprimono questo transgene possono essere facilmente ablate dopo una breve esposizione a una dose non tossica di GCV. Cellule epatiche umane trapiantate sono stabilmente mantenute all’interno del fegato di topo senza farmaci esogeni21. I topi sono anche precondizionati con dosi non mieloablative di treosulfan per creare una nicchia nel midollo osseo del topo per le cellule umane8. I topi immunodeficienti TK-NOG vengono iniettati intrasplenalmente con HEP e HSPC multipotenti. I topi sono quindi regolarmente monitorati per la ricostituzione del sangue e del fegato mediante immunofenotipizzazione del sangue e misurazioni dei livelli di siero uomo-albumina, rispettivamente. I topi con una ricostituzione di successo di oltre il 15% sia per le cellule immunitarie umane che per gli HEP vengono iniettati intraperitonealmente con HIV-1. L’effetto dell’HIV sul fegato può essere valutato già da 4 – 5 settimane dopo l’infezione. È fondamentale notare che, poiché viene utilizzato l’HIV-1, tutte le precauzioni necessarie devono essere prese durante la gestione del virus e l’iniezione nei topi.
Protocol
Representative Results
Discussion
Il fegato è compromesso e danneggiato nei pazienti affetti da HIV24. Modelli sperimentali di piccoli animali per lo studio delle malattie epatiche umane in presenza di HIV-1 è estremamente limitata, nonostante la disponibilità di alcuni modelli animali cotrapiantati con CD34– HSPC ed epatociti7,12, 25. Negli esperimenti in vitro, gli epatociti hanno dimostrato di avere infezione da HIV-1 di…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato sostenuto dalla sovvenzione dell’Istituto Nazionale di Sanità R24OD018546 (a L.Y.P. e S.G.). Gli autori desiderano ringraziare Weizhe Li, Ph.D., per l’aiuto nelle procedure chirurgiche, Amanda Branch Woods, B.S., Yan Cheng per l’immunohistologia, UNMC flow cytometry ricercatori membri Direttore Phillip Hexley, Ph.D., Victoria B. Smith, B.S., e Samantha Wall, B.S., membri avanzati della struttura di microscopia UNMC Janice A. Taylor, B.S. e James R. Talaska, B.S., per il supporto tecnico. Gli autori riconoscono i dottori Mamoru Ito e Hiroshi Suemizu della CIEA per aver fornito topi TK-NOG e il dr. Joachim Baumgart per la fornitura di treosulfan. Gli autori ringraziano il Dr. Adrian Koesters, UNMC, per il suo contributo editoriale al manoscritto.
Materials
| 27G1/2" needles | BD biosciences | 305109 | |
| 30G1/2" needles | BD biosciences | 305106 | |
| 5 mL polystyrene round-bottom tube 12 x 75 mm style | Corning | 352054 | |
| BD 1 mL Tuberculin Syringe Without Needle | BD biosciences | 309659 | |
| BD FACS array bioanalyzer | BD Biosciences | For purity check of eluted CD34+ cells | |
| BD FACS array software | BD Biosciences | Software to analysis acquired CD34+ cell on FACS array | |
| BD FACS lysing solution | BD Biosciences | 349202 | To lyse red blood cells |
| BD LSR II | BD Biosciences | Instrument for acquisiton of flow cytometry samples | |
| BD Vacutainer Plastic Blood Collection Tube | BD biosciences | BD 367874 | To collect Cord blood |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-aldrich | A9576 | |
| Buprenorphine | Controlled substance and pain-killer | ||
| CD14-PE | BD Biosciences | 555398 | Specific to human |
| CD19-BV605 | BD Biosciences | 562653 | Specific to human |
| CD34 MicroBead Kit, human | Miltenyi Biotec | 130-046-702 | For isoation of CD34+ HSPC |
| CD34-PE, human | Miltenyi Biotec | 130-081-002 | Antibody used for purity check of eluted CD34+ cells |
| CD3-AF700 | BD Biosciences | 557943 | Specific to human |
| CD45-PerCPCy5.5 | BD Biosciences | 564105 | Specific to human |
| CD4-APC | BD Biosciences | 555349 | Specific to human |
| CD8-BV421 | BD Biosciences | 562428 | Specific to human |
| Cell counting slides | Bio-rad | 1450015 | |
| ChargeSwitch gDNA Mini Tissue Kit | Thermofisher scientific | CS11204 | for extraction of genomic DNA from ear piece |
| Cobas Amplicor system v1.5 | Roche Molecular Diagnostics | bioanalyzer to measure viral load | |
| Cotton-tipped applicators | McKesson | 24-106-2S | |
| Cytokeratin-18 (CK18) | DAKO | M7010 | Specific to human |
| DMSO (Dimethyl sulfoxide) | Sigma-aldrich | D2650-5X5ML | |
| Extension set Microbore Slide Clamp(s) Fixed Male Luer Lock. L: 60 in L: 152 cm PV: 0.55 mL Fluid Path Sterile | BD biosciences | 30914 | Attached to dispensing pippet and to load with HSPC and HEP suspesion |
| FACS Diva version 6 | BD Biosciences | flow cytometer software required for acqusition of sample | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco | 10438026 | |
| FLOWJO analysis software v10.2 |
FLOWJO, LLC | flow cytometry analysis software | |
| Ganciclovir | APP Pharmaceuticals, Inc. | 315110 | Prescripition drug |
| Greiner MiniCollect EDTA Tubes | Greiner bio-one | 450475 | |
| Hepatocytes thawing medium | Triangle Research Labs | MCHT50 | |
| Horizon Open Ligating Clip Appliers | Teleflex | 537061 | To hold the ligating clips |
| Hospira Sterile Water for Injection | ACE surgical supply co. Inc. | 001-1187 | For dilution of Buprenorphine (pain-killer) |
| Human Albumin ELISA Quantitation Set | Bethyl laboratories | E80-129 | For assesing human albumin levels in mouse serum |
| Human hepatocyte | Triangle Research Labs | HUCP1 | Cryopreserved human hepatocytes, induction qualified |
| Iris Scissors, Straight | Ted Pella, Inc. | 13295 | |
| Lancet | MEDIpoint | Goldenrod 5 mm | |
| LS columns | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | Used to entrap CD34+ microbeads (positive selection) |
| Lymphocyte Separation Medium (LSM) | MP Biomedicals | 50494 | For isoation of lymphocytes from peripheral blood |
| MACS MultiStand | Miltenyi Biotec | 130-042-303 | holds Qudro MACS seperator and LS columns |
| McPherson-Vannas Micro Dissecting Spring Scissors | Roboz Surgical Instrument Co. | RS-5605 | Used to make an incision on skin to expose spleen |
| Micro Dissecting Forceps | Roboz Surgical Instrument Co. | RS-5157 | to hold and pull out spleen from peritoneal cavity |
| mouse CD45-FITC | BD Biosciences | 553080 | mouse-specific |
| PBS (Phosphate Buffered Saline) | Hyclone | SH30256.02 | |
| Qudro MACS separator | Miltenyi Biotec | 130-090-976 | holds four LS columns |
| RPMI 1640 medium | Gibco | 11875093 | |
| StepOne Plus Real Time PCR | Applied Biosystems | Instrument used to genotype | |
| Stepper Series Repetitive Dispensing Pipette 1ml | DYMAX CORP | T15469 | Used to dispense HSPC and HEP supension in controlled manner |
| Suturevet PGA synthetic absorbale suture | Henry Schein Animal Health | 41178 | Suturing of skin and peritoneum |
| TaqMan Gene Expression Master Mix | Thermofisher scientific | 4369016 | |
| TC20 automated cell counter | Bio-rad | 1450102 | |
| TK-NOG mice | Provided by the Central Institute for Experimental Animals (CIEA, Japan; Drs. Mamoru Ito and Hiroshi Suemizu) | ||
| Treosulfan | Medac GmbH | Provided by Dr. Joachim Baumgart (medac GmbH) | |
| Trypan Blue | Bio-rad | 1450022 | |
| Vannas-type Micro Scissors, Straight, 80mm L | Ted Pella, Inc. | 1346 | Used to make an incision on skin to expose spleen |
| Weck hemoclip traditional titanium ligating clips | Esutures | 523700 | To ligate the spleen post-injection |
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