HIV ile ilişkili Karaciğer Patogenezi için Çift İnsanize TK-NOG Fare Modelinin Oluşturulması
Summary
Bu protokol, hem insan bağışıklık sistemi hem de karaciğer hücreleri ile insanlaşmış fareler kurmak için güvenilir bir yöntem sağlar. İnsan hepatositlerinin intrasplenik enjeksiyonu ve CD34+ hematopoetik kök hücrelerin insplektik enjeksiyonu ile elde edilen çift immünoeksik fareler insan immün yetmezlik virüsü-1 enfeksiyonuna yatkındır ve gözlendiği gibi karaciğer hasarına recapitulate HIV bulaşmış hastalar.
Abstract
İnsan immün yetmezlik virüsü-1 (HIV-1) ile enfekte hastaların artan yaşam beklentisi rağmen, karaciğer hastalığı morbidite ortak bir nedeni olarak ortaya çıkmıştır. HIV-1’in neden olduğu karaciğer immünpatolojisi hala zor. İnsan hepatositleri ve insan bağışıklık sistemi ile küçük ksenogreft hayvan modelleri hastalığın patogenezinin insan biyolojisini özetleyebilir. Burada, insan heatositleri ve CD34+ hematopoetik kök/progenitor hücreleri (HSPCs) transplantasyonu ile hiv hastalarında gözlenen karaciğer immünopatolojisini incelemek için çift insanlaştırılmış fare modeli oluşturmak için bir protokol tanımlanmıştır. Çift reconstitution elde etmek için, erkek TK-NOG (NOD. Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Sug Tg(Alb-TK)7-2/ShiJic) fareler intraperitoneally gansiclovir enjekte edilir (GCV) dozları fare transgenik karaciğer hücrelerini ortadan kaldırmak için, ve nonmiyeoablative klima için treosulfan ile, her ikisi de insan hepatosit (HEP) engraftment ve insan bağışıklık sistemi (HIS) gelişimini kolaylaştırmak. İnsan albumini (ALB) düzeyleri karaciğer engraftment için değerlendirilir, ve kanda insan bağışıklık hücrelerinin varlığı kanda akış sitometri tarafından tespit insan bağışıklık sisteminin kurulmasını doğrular. Burada açıklanan protokol kullanılarak geliştirilen model, HIV-1 enfeksiyonundan kaynaklanan karaciğer hasarının birden fazla bileşenini andırmaktadır. Kurulması hepatit virüsü ortak enfeksiyon çalışmaları ve antiviral ve antiretroviral ilaçların değerlendirilmesi için gerekli olduğunu kanıtlayabilir.
Introduction
Antiretroviral tedavinin gelişinden bu yana, HIV-1 monoenfeksiyona bağlı ölümlerde önemli bir azalma olmuştur. Ancak, karaciğer hastalığı HIV-enfekte hastalarda morbidite ortak bir nedeni olarak ortaya çıkmıştır1,2. HIV-1 enfeksiyonu ile hepatit virüslerinin coenfeksiyonlar daha yaygındır, 10% için muhasebe – 30% ABD’de HIV enfektekişilerin% 30,4,5.
HIV-1 ve hepatit virüslerinin ev sahibi özgüllüğü, küçük hayvan modellerinin insana özgü bulaşıcı hastalıkları incelemek veya HIV-1 ile ilişkili karaciğer patogenesinin çeşitli yönlerini araştırmak için yararsağlar. İnsan hücrelerinin ve/veya dokuların engraftment izin immunodeficient fareler (insanlı fare modelleri olarak da adlandırılır) preklinikçalışmalariçin kabul edilebilir hayvan modelleri 6,7,8. 2000’li yılların başında insanlaşmış farelerin piyasaya sürülmesinden bu yana, kolestatik insan karaciğer toksisitesi, HIV-1 ve HIV ile ilişkili nörobilişsel bozukluklar, Epstein Barr virüsü, hepatit ve diğer dahil olmak üzere insana özgü patojenler, birden fazla preklinik çalışmalar bulaşıcı hastalıklar, bu farelerde araştırılmıştır6,9,10,11. CD34+ HSPCs ve / veya insan hepatosit transplantasyonu için birden fazla fare modelleri uzun geliştirilmiş ve Hepatit B virüsü (HBV) ilişkili karaciğer hastalığı hastalığı patogenezini incelemek için zaman içinde geliştirilmiş12, 13.000 , 14. HSPC ve insan hepatosit (HEP) transplantasyonu için çeşitli modeller NOG (NOD) olarak bilinen suşlara dayanmaktadır. Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Sug/JicTac)8,13, NSG (NOD. Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ)15, Balb/C-Rag2-/- γc-/- (Rag2tm1.1Flv Il2rgtm1.1Flv/J)12ve fah-/- NOD rag1-/- il2rγnull fare16. Ancak, her modelin kendi avantajları ve sınırlamaları vardır; örneğin, Bir Balb/C-Rag2üzerinde HEP’ler ve insan kök hücreleri (HSC’ler) için AFC8 çift insanlaştırılmış fareler , bağışıklık hücreleri ve HSC’lerin başarılı bir şekilde engraftment sağlar, ancak bir antijene özgü T- ve B-hücre yokluğu var bu modelde yanıt12. Çift insanlı farelerin yeniden konumlanmasındaki en önemli endişeler arasında suboptimal engraftment, farklı dokuları destekleyecek uygun modellerin olmaması,uyumsuz koşullar, immün ret veya greft-versus-host hastalığı (GVHD) ve teknik metabolik anormalliklere bağlı olarak yenidoğanlarda riskli manipülasyonlar ve yüksek mortalite oranları gibi güçlükler13.
İnsanlaştırılmış fareler uzun yıllar HIV araştırma için kullanılan olmasına rağmen17,18,19, HIV-1 neden olduğu karaciğer hasarı incelemek için insanlaşmış farelerin kullanımı20sınırlı olmuştur . Biz daha önce bir çift insanlaştırılmış TK-NOG fare modeli ve HIV ilişkili karaciğer hastalığı8onun uygulama kurulması bildirdi. Bu model karaciğer ve bağışıklık hücrelerinin sağlam engraftment gösterir ve HIV enfeksiyonu patogenezini recapitulates. Bu tartışma, insan hepatositlerinin naklinde en kritik adımları içeren ayrıntılı bir protokol sunmaktadır. HEP’lerin başarılı bir şekilde engreftlemesi ve TK-NOG farelerde fonksiyonel bir bağışıklık sisteminin kurulması için gerekli olan HSP’lerin tanımı da sunulmuştur. Bu farelerin HIV ile ilişkili karaciğer immünopatogenezi üzerinde çalışması için kullanımı ayrıntılıdır. Karaciğere özgü herpes simpleks virüsü tip 1 timidin kigaz (HSV-TK) transgeni taşıyan TK-NOG erkek fareler kullanılır. Bu transgeni ifade eden fare karaciğer hücreleri, toksik olmayan bir GCV dozuna kısa bir maruzktan sonra kolayca ablated olabilir. Nakledilen insan karaciğer hücreleri eksojen ilaçlar olmadan fare karaciğeri içinde stably korunur21. Fareler de insan hücreleri için fare kemik iliği bir niş oluşturmak için treosulfan nonmyeloablative dozlarda ön koşulluvardır 8. İmmün eksikliği olan TK-NOG farelere intrasplenik olarak HEP ve çok güçlü HSP’ler enjekte edilir. Fareler daha sonra düzenli olarak kan immünofenotiyonu ve serum insan-albumin düzeyleriölçümleri ile kan ve karaciğer reconstitution için izlenir, sırasıyla. Hem insan bağışıklık hücreleri hem de HEP’ler için %15’ten fazla başarılı bir reconstitution ile fareler intraperitoneally HIV-1 enjekte edilir. HIV’in karaciğer üzerindeki etkisi enfeksiyon sonrası 4- 5 hafta kadar erken değerlendirilebilir. HIV-1 kullanıldığından, virüsün kullanımı ve farelere enjekte edilmesi sırasında gerekli tüm önlemlerin alınması gerektiği ne kadar önemlidir?
Protocol
Representative Results
Discussion
Karaciğer, HIV’li hastalarda24. HIV-1 varlığında insan karaciğer hastalıkları nın incelenmesi için deneysel küçük hayvan modelleri son derece sınırlıdır, CD34 ile birkaç cotransplanted hayvan modelleri durumuna rağmen+ HSPCs ve hepatosit7 ,12, 25. yıl. In vitro deneylerde hepatositlerin düşük seviyeli HIV-1 enfeksiyonu olduğu gösterilmiştir26. ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma Ulusal Sağlık Enstitüsü hibe R24OD018546 (L.Y.P. ve S.G.) tarafından desteklenmiştir. Yazarlar Weizhe Li, Ph.D., cerrahi işlemlerde yardım için teşekkür etmek istiyorum, Amanda Branch Woods, B.S., Yan Cheng immünohistoloji için, UNMC akış sitometri araştırma tesisi üyeleri Direktörü Phillip Hexley, Ph.D., Victoria B. Smith, B.S., ve Samantha Wall, B.S., UNMC gelişmiş mikroskopi çekirdek tesis üyeleri Janice A. Taylor, B.S., ve James R. Talaska, B.S., teknik destek için. Yazarlar Dr Mamoru Ito ve Hiroshi Suemizu CIEA tk-NOG fareler ve Dr Joachim Baumgart treosulfan sağlamak için sağlamak için kabul. Yazarlar Dr Adrian Koesters, UNMC, onun editoryal katkılarından dolayı el yazması teşekkür ederiz.
Materials
| 27G1/2" needles | BD biosciences | 305109 | |
| 30G1/2" needles | BD biosciences | 305106 | |
| 5 mL polystyrene round-bottom tube 12 x 75 mm style | Corning | 352054 | |
| BD 1 mL Tuberculin Syringe Without Needle | BD biosciences | 309659 | |
| BD FACS array bioanalyzer | BD Biosciences | For purity check of eluted CD34+ cells | |
| BD FACS array software | BD Biosciences | Software to analysis acquired CD34+ cell on FACS array | |
| BD FACS lysing solution | BD Biosciences | 349202 | To lyse red blood cells |
| BD LSR II | BD Biosciences | Instrument for acquisiton of flow cytometry samples | |
| BD Vacutainer Plastic Blood Collection Tube | BD biosciences | BD 367874 | To collect Cord blood |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-aldrich | A9576 | |
| Buprenorphine | Controlled substance and pain-killer | ||
| CD14-PE | BD Biosciences | 555398 | Specific to human |
| CD19-BV605 | BD Biosciences | 562653 | Specific to human |
| CD34 MicroBead Kit, human | Miltenyi Biotec | 130-046-702 | For isoation of CD34+ HSPC |
| CD34-PE, human | Miltenyi Biotec | 130-081-002 | Antibody used for purity check of eluted CD34+ cells |
| CD3-AF700 | BD Biosciences | 557943 | Specific to human |
| CD45-PerCPCy5.5 | BD Biosciences | 564105 | Specific to human |
| CD4-APC | BD Biosciences | 555349 | Specific to human |
| CD8-BV421 | BD Biosciences | 562428 | Specific to human |
| Cell counting slides | Bio-rad | 1450015 | |
| ChargeSwitch gDNA Mini Tissue Kit | Thermofisher scientific | CS11204 | for extraction of genomic DNA from ear piece |
| Cobas Amplicor system v1.5 | Roche Molecular Diagnostics | bioanalyzer to measure viral load | |
| Cotton-tipped applicators | McKesson | 24-106-2S | |
| Cytokeratin-18 (CK18) | DAKO | M7010 | Specific to human |
| DMSO (Dimethyl sulfoxide) | Sigma-aldrich | D2650-5X5ML | |
| Extension set Microbore Slide Clamp(s) Fixed Male Luer Lock. L: 60 in L: 152 cm PV: 0.55 mL Fluid Path Sterile | BD biosciences | 30914 | Attached to dispensing pippet and to load with HSPC and HEP suspesion |
| FACS Diva version 6 | BD Biosciences | flow cytometer software required for acqusition of sample | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco | 10438026 | |
| FLOWJO analysis software v10.2 |
FLOWJO, LLC | flow cytometry analysis software | |
| Ganciclovir | APP Pharmaceuticals, Inc. | 315110 | Prescripition drug |
| Greiner MiniCollect EDTA Tubes | Greiner bio-one | 450475 | |
| Hepatocytes thawing medium | Triangle Research Labs | MCHT50 | |
| Horizon Open Ligating Clip Appliers | Teleflex | 537061 | To hold the ligating clips |
| Hospira Sterile Water for Injection | ACE surgical supply co. Inc. | 001-1187 | For dilution of Buprenorphine (pain-killer) |
| Human Albumin ELISA Quantitation Set | Bethyl laboratories | E80-129 | For assesing human albumin levels in mouse serum |
| Human hepatocyte | Triangle Research Labs | HUCP1 | Cryopreserved human hepatocytes, induction qualified |
| Iris Scissors, Straight | Ted Pella, Inc. | 13295 | |
| Lancet | MEDIpoint | Goldenrod 5 mm | |
| LS columns | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | Used to entrap CD34+ microbeads (positive selection) |
| Lymphocyte Separation Medium (LSM) | MP Biomedicals | 50494 | For isoation of lymphocytes from peripheral blood |
| MACS MultiStand | Miltenyi Biotec | 130-042-303 | holds Qudro MACS seperator and LS columns |
| McPherson-Vannas Micro Dissecting Spring Scissors | Roboz Surgical Instrument Co. | RS-5605 | Used to make an incision on skin to expose spleen |
| Micro Dissecting Forceps | Roboz Surgical Instrument Co. | RS-5157 | to hold and pull out spleen from peritoneal cavity |
| mouse CD45-FITC | BD Biosciences | 553080 | mouse-specific |
| PBS (Phosphate Buffered Saline) | Hyclone | SH30256.02 | |
| Qudro MACS separator | Miltenyi Biotec | 130-090-976 | holds four LS columns |
| RPMI 1640 medium | Gibco | 11875093 | |
| StepOne Plus Real Time PCR | Applied Biosystems | Instrument used to genotype | |
| Stepper Series Repetitive Dispensing Pipette 1ml | DYMAX CORP | T15469 | Used to dispense HSPC and HEP supension in controlled manner |
| Suturevet PGA synthetic absorbale suture | Henry Schein Animal Health | 41178 | Suturing of skin and peritoneum |
| TaqMan Gene Expression Master Mix | Thermofisher scientific | 4369016 | |
| TC20 automated cell counter | Bio-rad | 1450102 | |
| TK-NOG mice | Provided by the Central Institute for Experimental Animals (CIEA, Japan; Drs. Mamoru Ito and Hiroshi Suemizu) | ||
| Treosulfan | Medac GmbH | Provided by Dr. Joachim Baumgart (medac GmbH) | |
| Trypan Blue | Bio-rad | 1450022 | |
| Vannas-type Micro Scissors, Straight, 80mm L | Ted Pella, Inc. | 1346 | Used to make an incision on skin to expose spleen |
| Weck hemoclip traditional titanium ligating clips | Esutures | 523700 | To ligate the spleen post-injection |
References
- Smith, C., et al. Factors associated with specific causes of death amongst HIV-positive individuals in the D:A:D Study. AIDS. 24 (10), 1537-1548 (2010).
- Puoti, M., et al. Mortality for liver disease in patients with HIV infection: a cohort study. Journal of Acquired Immune Deficiency Syndromes. 24 (3), 211-217 (2000).
- Rodriguez-Mendez, M. L., Gonzalez-Quintela, A., Aguilera, A., Barrio, E. Prevalence, patterns, and course of past hepatitis B virus infection in intravenous drug users with HIV-1 infection. The American Journal of Gastroenterology. 95 (5), 1316-1322 (2000).
- Scharschmidt, B. F., et al. Hepatitis B in patients with HIV infection: relationship to AIDS and patient survival. Annals of Internal Medicine. 117 (10), 837-838 (1992).
- Lacombe, K., Rockstroh, J. HIV and viral hepatitis coinfections: advances and challenges. Gut. 61, 47-58 (2012).
- Brehm, M. A., Jouvet, N., Greiner, D. L., Shultz, L. D. Humanized mice for the study of infectious diseases. Current Opinion in Immunology. 25 (4), 428-435 (2013).
- Billerbeck, E., et al. Humanized mice efficiently engrafted with fetal hepatoblasts and syngeneic immune cells develop human monocytes and NK cells. The Journal of Hepatology. 65 (2), 334-343 (2016).
- Dagur, R. S., et al. Human hepatocyte depletion in the presence of HIV-1 infection in dual reconstituted humanized mice. Biology Open. 7 (2), (2018).
- Gaska, J. M., Ploss, A. Study of viral pathogenesis in humanized mice. Current Opinion in Virology. 11, 14-20 (2015).
- Gorantla, S., Poluektova, L., Gendelman, H. E. Rodent models for HIV-associated neurocognitive disorders. Trends in Neurosciences. 35 (3), 197-208 (2012).
- Xu, D., et al. Chimeric TK-NOG mice: a predictive model for cholestatic human liver toxicity. The Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 352 (2), 274-280 (2015).
- Washburn, M. L., et al. A humanized mouse model to study hepatitis C virus infection, immune response, and liver disease. Gastroenterology. 140 (4), 1334-1344 (2011).
- Gutti, T. L., et al. Human hepatocytes and hematolymphoid dual reconstitution in treosulfan-conditioned uPA-NOG mice. The American Journal of Pathology. 184 (1), 101-109 (2014).
- Strick-Marchand, H., et al. A novel mouse model for stable engraftment of a human immune system and human hepatocytes. PLoS One. 10 (3), 0119820 (2015).
- Keng, C. T., et al. Characterisation of liver pathogenesis, human immune responses and drug testing in a humanised mouse model of HCV infection. Gut. 65 (10), 1744-1753 (2016).
- Li, F., Nio, K., Yasui, F., Murphy, C. M., Su, L. Studying HBV Infection and Therapy in Immune-Deficient NOD-Rag1-/-IL2RgammaC-null (NRG) Fumarylacetoacetate Hydrolase (Fah) Knockout Mice Transplanted with Human Hepatocytes. Methods in Molecular Biology. 1540, 267-276 (2017).
- Poluektova, L. Y., Garcia, J. V., Koyanagi, Y., Manz, M. G., Tager, A. M. . Humanized Mice for HIV Research. , (2014).
- Cheng, L., Ma, J., Li, G., Su, L. Humanized Mice Engrafted With Human HSC Only or HSC and Thymus Support Comparable HIV-1 Replication, Immunopathology, and Responses to ART and Immune Therapy. Frontiers in Immunology. 9, 817 (2018).
- Zhang, L., Su, L. HIV-1 immunopathogenesis in humanized mouse models. Cellular & Molecular Immunology. 9 (3), 237-244 (2012).
- Nunoya, J., Washburn, M. L., Kovalev, G. I., Su, L. Regulatory T cells prevent liver fibrosis during HIV type 1 infection in a humanized mouse model. The Journal of Infectious Diseases. 209 (7), 1039-1044 (2014).
- Hasegawa, M., et al. The reconstituted ‘humanized liver’ in TK-NOG mice is mature and functional. Biochemical and Biophysical Research Communications. 405 (3), 405-410 (2011).
- Higuchi, Y., et al. The human hepatic cell line HepaRG as a possible cell source for the generation of humanized liver TK-NOG mice. Xenobiotica. 44 (2), 146-153 (2014).
- Kosaka, K., et al. A novel TK-NOG based humanized mouse model for the study of HBV and HCV infections. Biochemical and Biophysical Research Communications. 441 (1), 230-235 (2013).
- Crane, M., Iser, D., Lewin, S. R. Human immunodeficiency virus infection and the liver. World Journal of Hepatology. 4 (3), 91-98 (2012).
- Bility, M. T., Li, F., Cheng, L., Su, L. Liver immune-pathogenesis and therapy of human liver tropic virus infection in humanized mouse models. Journal of Gastroenterology and Hepatology. 28, 120-124 (2013).
- Kong, L., et al. Low-level HIV infection of hepatocytes. Virology Journal. 9, 1-7 (2012).
- Dash, P. K., et al. Long-acting nanoformulated antiretroviral therapy elicits potent antiretroviral and neuroprotective responses in HIV-1-infected humanized mice. AIDS. 26 (17), 2135-2144 (2012).
- Sun, S., Li, J. Humanized chimeric mouse models of hepatitis B virus infection. International Journal of Infectious Diseases. 59, 131-136 (2017).
- Shafritz, D. A., Oertel, M. Model systems and experimental conditions that lead to effective repopulation of the liver by transplanted cells. The International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 43 (2), 198-213 (2011).
- Almeida-Porada, G., Porada, C. D., Chamberlain, J., Torabi, A., Zanjani, E. D. Formation of human hepatocytes by human hematopoietic stem cells in sheep. Blood. 104 (8), 2582-2590 (2004).
- Streetz, K. L., et al. Hepatic parenchymal replacement in mice by transplanted allogeneic hepatocytes is facilitated by bone marrow transplantation and mediated by CD4 cells. Hepatology. 47 (2), 706-718 (2008).
