Создание двойной гуманизированной модели мыши TK-NOG для ВИЧ-ассоциированного патогенеза печени
Summary
Этот протокол обеспечивает надежный метод для создания гуманизированных мышей с иммунной системой человека и клетками печени. Двойной восстановленный иммунодефицитных мышей, достигнутых с помощью интраспелинической инъекции человеческих гепатоцитов и CD34 гематопоиетических стволовых клеток восприимчивы к вирусу иммунодефицита человека-1 инфекции и повторение повреждения печени, как наблюдается в ВИЧ-инфицированных пациентов.
Abstract
Несмотря на увеличение продолжительности жизни пациентов, инфицированных вирусом иммунодефицита человека-1 (ВИЧ-1), заболевание печени стало распространенной причиной их заболеваемости. Иммунопатология печени, вызванная ВИЧ-1, остается неуловимой. Малые модели животных ксенотрансплантата с гепатоцитами человека и иммунной системой человека могут резюмировать биологию человека патогенеза болезни. При этом описывается протокол для создания двойной гуманизированной модели мыши с помощью человеческих гепатоцитов и CD34 гематопоиетических стволовых /клеток-прародителей (HSPCs) трансплантации, для изучения иммунопатологии печени, как наблюдается у ВИЧ-инфицированных пациентов. Для достижения двойной реконституции, мужчины ТЗ-НОГ (NOD. Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Sug Tg (Alb-TK)7-2/ShiJic) мышей интраперитоно вводят с ганциклозир (GCV) дозы для устранения мыши трансгенных клеток печени, и с treosulfan для немиелоаблятивного кондиционирования, оба из которых из которых оба из которых облегчить гепатоциты человека (HEP) прививок и иммунной системы человека (HIS) развития. Уровень альбумина человека (ALB) оценивается для прививок печени, а наличие иммунных клеток человека в крови, обнаруженных цитометрией потока, подтверждает установление иммунной системы человека. Модель, разработанная с использованием описанного здесь протокола, напоминает несколько компонентов повреждения печени от ВИЧ-1. Его создание может оказаться необходимым для исследований совместной инфекции вируса гепатита и для оценки противовирусных и антиретровирусных препаратов.
Introduction
С момента появления антиретровирусной терапии произошло значительное снижение смертности от моноинфекции ВИЧ-1. Тем не менее, заболевания печени стала распространенной причиной заболеваемости у ВИЧ-инфицированных пациентов1,2. Инфекции вирусов гепатита с ВИЧ-1 встречаются чаще, на долю 10% – 30% ВИЧ-инфицированных в США3,4,5.
Специфика вирусов ВИЧ-1 и гепатита ограничивает полезность малых моделей животных для изучения специфических инфекционных заболеваний человека или для изучения многочисленных аспектов патогенеза печени, связанного с ВИЧ-1. Иммунодефицитные мыши, которые позволяют прививать человеческие клетки и / или ткани (так называют гуманизированных моделей мыши) являются приемлемыми животными модели для доклинических исследований6,7,8. С момента появления гуманизированных мышей в начале 2000-х годов, многочисленные доклинические исследования токсичности холестатической печени человека, специфических для человека патогенов, включая ВИЧ-1 и ВИЧ-ассоциированные нейрокогнитивные расстройства, вирус Эпштейна Барра, гепатит и другие инфекционных заболеваний, были исследованы в этих мышей6,9,10,11. Несколько моделей мыши для CD34и HSPCs и / или трансплантации гепатоцитов человека уже давно разработаны и улучшились с течением времени для изучения болезни патогенеза вируса гепатита В (HBV)-связанных заболеваний печени12, 13 Год , 14. Несколько моделей для трансплантации гепатоцитов и человека (HEP) основаны на штаммах, известных как NOG (NOD). CG-Prkdcscid Il2rgtm1Sug/JicTac)8,13, NSG (NOD. CG-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ)15, Balb/C-Rag2-/- кк-/- (Rag2tm1.1Flv Il2rgtm1.1Flv/J)12, и fah-/- NOD rag1-/- il2r null мышь16. Однако каждая модель имеет свои преимущества и ограничения; например, AFC8 двойных гуманизированных мышей для HEPs и стволовых клеток человека (HSCs) на Balb/C-Rag2-/- Кк-/- фон позволяет успешно привить иммунных клеток и HSCs, но есть отсутствие антигена конкретных Т- и В-клеток ответ в этой модели12. Основные проблемы в восстановлении двойной гуманизированных мышей включают субоптимальный прививок, отсутствие подходящих моделей для поддержки различных тканей, несовпадающие условия, иммунный отторженный, или трансплантат –по сравнениюс -хост болезни (GVHD), и технические трудности, такие как рискованные манипуляции с новорожденными и высокие показатели смертности из-за метаболических нарушений13.
Хотя гуманизированные мыши были использованы для исследования ВИЧ в течение многих лет17,18,19, использование гуманизированных мышей для изучения повреждения печени, вызванные ВИЧ-1 была ограничена20. Ранее мы сообщали о создании двойной гуманизированной модели мыши TK-NOG и ее применении при ВИЧ-ассоциированном заболевании печени8. Эта модель показывает надежное прививочение печени и иммунных клеток и резюмирует патогенез ВИЧ-инфекции. В ходе этой дискуссии представлен подробный протокол, включав в себя наиболее важные шаги в области трансплантации гепатоцитов человека. Представлено также описание HSPCs, необходимых для успешного прививки От hePs и создания функциональной иммунной системы у мышей ТК-NOG. Использование этих мышей для изучения ВИЧ-ассоциированного иммунопатогенеза печени подробно. TK-NOG мышей, перевозящих печени конкретных вирус простого герпеса типа 1 тимидин киназы (HSV-TK) трансгениспользуютиспользуются. Клетки печени мыши выражая этот transgene можно легко ablated после краткого подвержения к nontoxic дозе GCV. Пересаженные клетки печени человека устойчиво поддерживаются в печени мыши без экзогенных препаратов21. Мышей также предусловные с nonmyeloablative дозы треосульфана для создания ниши в костном мозге мыши для человеческих клеток8. Иммунодефицитные мыши ТК-НОГ интраспленически вводятся с помощью HePs и многопотентных HSPCs. Затем мышей регулярно контролируют на наличие в крови и печени восстановления с помощью иммунофенотипирования крови и измерений уровня сыворотки человека и альбумина, соответственно. Мыши с успешной реконституцией более 15% как для иммунных клеток человека, так и для HEPs интраперитоно вводят ВИЧ-1. Влияние ВИЧ на печень можно оценить уже через 4 – 5 недель после инфицирования. Важно отметить, что, поскольку ВИЧ-1 используется, все необходимые меры предосторожности должны быть приняты при обработке вируса и инъекционных его на мышей.
Protocol
Representative Results
Discussion
Печень скомпрометирована и повреждена у ВИЧ-инфицированных пациентов24. Экспериментальные модели малых животных для изучения заболеваний печени человека в присутствии ВИЧ-1 крайне ограничены, несмотря на наличие нескольких скотрансажированных моделей животных с CD34и</s…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана Национальным институтом здравоохранения грант R24OD018546 (в L.Y.P. и S.G.). Авторы хотели бы поблагодарить Вайчжэ Ли, доктор философии, за помощь в хирургических процедурах, Аманда Бранч Вудс, B.S., Ян Ченг для иммуногистологии, UNMC потока цитометрии членов научно-исследовательского центра директор Филипп Хексли, доктор философии, Виктория Б. Смит, B.S., и Саманта Уолл, B.S., UNMC передовые микроскопии основных членов объекта Дженис А. Тейлор, B.S., и Джеймс Р. Таласка, B.S., для технической поддержки. Авторы признают д-ра Мамору Ито и Хироси Суамидзу из CIEA за предоставление мышей ТК-НОГ и д-ра Иоахима Баумгарта за предоставление треосульфана. Авторы благодарят д-ра Адриана Кестерса, UNMC, за ее редакционный вклад в рукопись.
Materials
| 27G1/2" needles | BD biosciences | 305109 | |
| 30G1/2" needles | BD biosciences | 305106 | |
| 5 mL polystyrene round-bottom tube 12 x 75 mm style | Corning | 352054 | |
| BD 1 mL Tuberculin Syringe Without Needle | BD biosciences | 309659 | |
| BD FACS array bioanalyzer | BD Biosciences | For purity check of eluted CD34+ cells | |
| BD FACS array software | BD Biosciences | Software to analysis acquired CD34+ cell on FACS array | |
| BD FACS lysing solution | BD Biosciences | 349202 | To lyse red blood cells |
| BD LSR II | BD Biosciences | Instrument for acquisiton of flow cytometry samples | |
| BD Vacutainer Plastic Blood Collection Tube | BD biosciences | BD 367874 | To collect Cord blood |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-aldrich | A9576 | |
| Buprenorphine | Controlled substance and pain-killer | ||
| CD14-PE | BD Biosciences | 555398 | Specific to human |
| CD19-BV605 | BD Biosciences | 562653 | Specific to human |
| CD34 MicroBead Kit, human | Miltenyi Biotec | 130-046-702 | For isoation of CD34+ HSPC |
| CD34-PE, human | Miltenyi Biotec | 130-081-002 | Antibody used for purity check of eluted CD34+ cells |
| CD3-AF700 | BD Biosciences | 557943 | Specific to human |
| CD45-PerCPCy5.5 | BD Biosciences | 564105 | Specific to human |
| CD4-APC | BD Biosciences | 555349 | Specific to human |
| CD8-BV421 | BD Biosciences | 562428 | Specific to human |
| Cell counting slides | Bio-rad | 1450015 | |
| ChargeSwitch gDNA Mini Tissue Kit | Thermofisher scientific | CS11204 | for extraction of genomic DNA from ear piece |
| Cobas Amplicor system v1.5 | Roche Molecular Diagnostics | bioanalyzer to measure viral load | |
| Cotton-tipped applicators | McKesson | 24-106-2S | |
| Cytokeratin-18 (CK18) | DAKO | M7010 | Specific to human |
| DMSO (Dimethyl sulfoxide) | Sigma-aldrich | D2650-5X5ML | |
| Extension set Microbore Slide Clamp(s) Fixed Male Luer Lock. L: 60 in L: 152 cm PV: 0.55 mL Fluid Path Sterile | BD biosciences | 30914 | Attached to dispensing pippet and to load with HSPC and HEP suspesion |
| FACS Diva version 6 | BD Biosciences | flow cytometer software required for acqusition of sample | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco | 10438026 | |
| FLOWJO analysis software v10.2 |
FLOWJO, LLC | flow cytometry analysis software | |
| Ganciclovir | APP Pharmaceuticals, Inc. | 315110 | Prescripition drug |
| Greiner MiniCollect EDTA Tubes | Greiner bio-one | 450475 | |
| Hepatocytes thawing medium | Triangle Research Labs | MCHT50 | |
| Horizon Open Ligating Clip Appliers | Teleflex | 537061 | To hold the ligating clips |
| Hospira Sterile Water for Injection | ACE surgical supply co. Inc. | 001-1187 | For dilution of Buprenorphine (pain-killer) |
| Human Albumin ELISA Quantitation Set | Bethyl laboratories | E80-129 | For assesing human albumin levels in mouse serum |
| Human hepatocyte | Triangle Research Labs | HUCP1 | Cryopreserved human hepatocytes, induction qualified |
| Iris Scissors, Straight | Ted Pella, Inc. | 13295 | |
| Lancet | MEDIpoint | Goldenrod 5 mm | |
| LS columns | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | Used to entrap CD34+ microbeads (positive selection) |
| Lymphocyte Separation Medium (LSM) | MP Biomedicals | 50494 | For isoation of lymphocytes from peripheral blood |
| MACS MultiStand | Miltenyi Biotec | 130-042-303 | holds Qudro MACS seperator and LS columns |
| McPherson-Vannas Micro Dissecting Spring Scissors | Roboz Surgical Instrument Co. | RS-5605 | Used to make an incision on skin to expose spleen |
| Micro Dissecting Forceps | Roboz Surgical Instrument Co. | RS-5157 | to hold and pull out spleen from peritoneal cavity |
| mouse CD45-FITC | BD Biosciences | 553080 | mouse-specific |
| PBS (Phosphate Buffered Saline) | Hyclone | SH30256.02 | |
| Qudro MACS separator | Miltenyi Biotec | 130-090-976 | holds four LS columns |
| RPMI 1640 medium | Gibco | 11875093 | |
| StepOne Plus Real Time PCR | Applied Biosystems | Instrument used to genotype | |
| Stepper Series Repetitive Dispensing Pipette 1ml | DYMAX CORP | T15469 | Used to dispense HSPC and HEP supension in controlled manner |
| Suturevet PGA synthetic absorbale suture | Henry Schein Animal Health | 41178 | Suturing of skin and peritoneum |
| TaqMan Gene Expression Master Mix | Thermofisher scientific | 4369016 | |
| TC20 automated cell counter | Bio-rad | 1450102 | |
| TK-NOG mice | Provided by the Central Institute for Experimental Animals (CIEA, Japan; Drs. Mamoru Ito and Hiroshi Suemizu) | ||
| Treosulfan | Medac GmbH | Provided by Dr. Joachim Baumgart (medac GmbH) | |
| Trypan Blue | Bio-rad | 1450022 | |
| Vannas-type Micro Scissors, Straight, 80mm L | Ted Pella, Inc. | 1346 | Used to make an incision on skin to expose spleen |
| Weck hemoclip traditional titanium ligating clips | Esutures | 523700 | To ligate the spleen post-injection |
References
- Smith, C., et al. Factors associated with specific causes of death amongst HIV-positive individuals in the D:A:D Study. AIDS. 24 (10), 1537-1548 (2010).
- Puoti, M., et al. Mortality for liver disease in patients with HIV infection: a cohort study. Journal of Acquired Immune Deficiency Syndromes. 24 (3), 211-217 (2000).
- Rodriguez-Mendez, M. L., Gonzalez-Quintela, A., Aguilera, A., Barrio, E. Prevalence, patterns, and course of past hepatitis B virus infection in intravenous drug users with HIV-1 infection. The American Journal of Gastroenterology. 95 (5), 1316-1322 (2000).
- Scharschmidt, B. F., et al. Hepatitis B in patients with HIV infection: relationship to AIDS and patient survival. Annals of Internal Medicine. 117 (10), 837-838 (1992).
- Lacombe, K., Rockstroh, J. HIV and viral hepatitis coinfections: advances and challenges. Gut. 61, 47-58 (2012).
- Brehm, M. A., Jouvet, N., Greiner, D. L., Shultz, L. D. Humanized mice for the study of infectious diseases. Current Opinion in Immunology. 25 (4), 428-435 (2013).
- Billerbeck, E., et al. Humanized mice efficiently engrafted with fetal hepatoblasts and syngeneic immune cells develop human monocytes and NK cells. The Journal of Hepatology. 65 (2), 334-343 (2016).
- Dagur, R. S., et al. Human hepatocyte depletion in the presence of HIV-1 infection in dual reconstituted humanized mice. Biology Open. 7 (2), (2018).
- Gaska, J. M., Ploss, A. Study of viral pathogenesis in humanized mice. Current Opinion in Virology. 11, 14-20 (2015).
- Gorantla, S., Poluektova, L., Gendelman, H. E. Rodent models for HIV-associated neurocognitive disorders. Trends in Neurosciences. 35 (3), 197-208 (2012).
- Xu, D., et al. Chimeric TK-NOG mice: a predictive model for cholestatic human liver toxicity. The Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 352 (2), 274-280 (2015).
- Washburn, M. L., et al. A humanized mouse model to study hepatitis C virus infection, immune response, and liver disease. Gastroenterology. 140 (4), 1334-1344 (2011).
- Gutti, T. L., et al. Human hepatocytes and hematolymphoid dual reconstitution in treosulfan-conditioned uPA-NOG mice. The American Journal of Pathology. 184 (1), 101-109 (2014).
- Strick-Marchand, H., et al. A novel mouse model for stable engraftment of a human immune system and human hepatocytes. PLoS One. 10 (3), 0119820 (2015).
- Keng, C. T., et al. Characterisation of liver pathogenesis, human immune responses and drug testing in a humanised mouse model of HCV infection. Gut. 65 (10), 1744-1753 (2016).
- Li, F., Nio, K., Yasui, F., Murphy, C. M., Su, L. Studying HBV Infection and Therapy in Immune-Deficient NOD-Rag1-/-IL2RgammaC-null (NRG) Fumarylacetoacetate Hydrolase (Fah) Knockout Mice Transplanted with Human Hepatocytes. Methods in Molecular Biology. 1540, 267-276 (2017).
- Poluektova, L. Y., Garcia, J. V., Koyanagi, Y., Manz, M. G., Tager, A. M. . Humanized Mice for HIV Research. , (2014).
- Cheng, L., Ma, J., Li, G., Su, L. Humanized Mice Engrafted With Human HSC Only or HSC and Thymus Support Comparable HIV-1 Replication, Immunopathology, and Responses to ART and Immune Therapy. Frontiers in Immunology. 9, 817 (2018).
- Zhang, L., Su, L. HIV-1 immunopathogenesis in humanized mouse models. Cellular & Molecular Immunology. 9 (3), 237-244 (2012).
- Nunoya, J., Washburn, M. L., Kovalev, G. I., Su, L. Regulatory T cells prevent liver fibrosis during HIV type 1 infection in a humanized mouse model. The Journal of Infectious Diseases. 209 (7), 1039-1044 (2014).
- Hasegawa, M., et al. The reconstituted ‘humanized liver’ in TK-NOG mice is mature and functional. Biochemical and Biophysical Research Communications. 405 (3), 405-410 (2011).
- Higuchi, Y., et al. The human hepatic cell line HepaRG as a possible cell source for the generation of humanized liver TK-NOG mice. Xenobiotica. 44 (2), 146-153 (2014).
- Kosaka, K., et al. A novel TK-NOG based humanized mouse model for the study of HBV and HCV infections. Biochemical and Biophysical Research Communications. 441 (1), 230-235 (2013).
- Crane, M., Iser, D., Lewin, S. R. Human immunodeficiency virus infection and the liver. World Journal of Hepatology. 4 (3), 91-98 (2012).
- Bility, M. T., Li, F., Cheng, L., Su, L. Liver immune-pathogenesis and therapy of human liver tropic virus infection in humanized mouse models. Journal of Gastroenterology and Hepatology. 28, 120-124 (2013).
- Kong, L., et al. Low-level HIV infection of hepatocytes. Virology Journal. 9, 1-7 (2012).
- Dash, P. K., et al. Long-acting nanoformulated antiretroviral therapy elicits potent antiretroviral and neuroprotective responses in HIV-1-infected humanized mice. AIDS. 26 (17), 2135-2144 (2012).
- Sun, S., Li, J. Humanized chimeric mouse models of hepatitis B virus infection. International Journal of Infectious Diseases. 59, 131-136 (2017).
- Shafritz, D. A., Oertel, M. Model systems and experimental conditions that lead to effective repopulation of the liver by transplanted cells. The International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 43 (2), 198-213 (2011).
- Almeida-Porada, G., Porada, C. D., Chamberlain, J., Torabi, A., Zanjani, E. D. Formation of human hepatocytes by human hematopoietic stem cells in sheep. Blood. 104 (8), 2582-2590 (2004).
- Streetz, K. L., et al. Hepatic parenchymal replacement in mice by transplanted allogeneic hepatocytes is facilitated by bone marrow transplantation and mediated by CD4 cells. Hepatology. 47 (2), 706-718 (2008).
