Oprichting van de dubbele gehumaniseerde TK-nog muis model voor HIV-geassocieerde lever pathogenese
Summary
Dit protocol biedt een betrouwbare methode om gehumaniseerde muizen te vestigen met zowel menselijk immuunsysteem als levercellen. Dubbele gereconstitueerde immunodeficiënte muizen bereikt via intrasplenische injectie van humane hepatocyten en CD34+ hematopoietische stamcellen zijn vatbaar voor humaan immunodeficiëntie virus-1 infectie en even leverschade zoals waargenomen in HIV-geïnfecteerde patiënten.
Abstract
Ondanks de toegenomen levensverwachting van patiënten die geïnfecteerd zijn met humaan immunodeficiëntie virus-1 (HIV-1), is de leverziekte ontstaan als een veelvoorkomende oorzaak van hun morbiditeit. De lever Immunopathologie veroorzaakt door HIV-1 blijft ongrijpbaar. Kleine xenotransplantaatmodellen is diermodellen met humane hepatocyten en menselijk immuunsysteem kunnen de menselijke biologie van de pathogenese van de ziekte recapituleren. Hierin wordt een protocol beschreven om een dubbel gehumaniseerd muismodel tot stand te brengen door humane hepatocyten en CD34+ hematopoietische stam/voorlopercellen (HSPCs) transplantatie, om lever Immunopathologie te bestuderen zoals WAARGENOMEN bij HIV-geïnfecteerde patiënten. Om dubbele reconstitutie te bereiken, mannelijke TK-nog (NOD. CG-Prkdcscid Il2rgtm1Sug TG (Alb-tk) 7-2/shijic) muizen zijn intraperitoneaal geïnjecteerd met ganciclovir (gcv) doses te elimineren muis transgene levercellen, en met treosulfan voor nonmyeloablative conditionering, die beide vergemakkelijking van humane hepatocyten (HEP) engraftment en menselijk immuunsysteem (zijn) ontwikkeling. Humaan albumine (ALB) niveaus worden geëvalueerd voor lever engraftment, en de aanwezigheid van menselijke immuuncellen in bloed gedetecteerd doorstroming cytometrie bevestigt de oprichting van menselijk immuunsysteem. Het model ontwikkeld met behulp van het protocol beschreven hier lijkt op meerdere componenten van leverschade van HIV-1-infectie. De inrichting ervan kan essentieel blijken te zijn voor onderzoeken naar co-infectie met Hepatitis virus en voor de evaluatie van antivirale en antiretrovirale geneesmiddelen.
Introduction
Sinds de komst van antiretrovirale therapie, is er een aanzienlijke afname van sterfgevallen gerelateerd aan HIV-1 monoinfectie. Echter, leverziekte is ontstaan als een veel voorkomende oorzaak van morbiditeit bij HIV-geïnfecteerde patiënten1,2. Coinfecties van hepatitis virussen met HIV-1-infectie komen vaker voor dan 10%-30% van de HIV-geïnfecteerde personen in de Verenigde Staten3,4,5.
De gastheer-specificiteit van HIV-1 en hepatitis virussen beperkt het nut van kleine diermodellen om humane-specifieke infectieziekten te bestuderen of om meerdere aspecten van HIV-1-geassocieerde lever pathogenese onderzoeken. Immunodeficiënte muizen die het engraftment van menselijke cellen en/of weefsels (aangeduid als gehumaniseerde Muismodellen) toelaten, zijn acceptabele diermodellen voor preklinische studies6,7,8. Sinds de introductie van gehumaniseerde muizen in de vroege jaren 2000, meerdere Preklinische studies van cholestatische menselijke lever toxiciteit, humaan-specifieke pathogenen, met inbegrip van HIV-1 en HIV-geassocieerde Neurocognitieve stoornissen, Epstein Barr virus, hepatitis, en andere infectieziekten, zijn onderzocht bij deze muizen6,9,10,11. Meerdere Muismodellen voor CD34+ hspc’s en/of humane hepatocyten transplantatie zijn al lang ontwikkeld en zijn na verloop van tijd verbeterd om de pathogenese van de ziekte van het hepatitis B-virus (HBV)-geassocieerde leverziekte12te bestuderen, 13 , 14. verschillende modellen voor hspc en humane hepatocyte (HEP) transplantatie zijn gebaseerd op stammen, bekend als nog (NOD. CG-prkdcscid Il2rgtm1Sug/jictac)8,13, NSG (NOD. CG-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/Szj)15, Balb/C-Rag2-/- γc-/- (Rag2TM 1.1 FLV Il2rgTM 1.1 FLV/j)12, en Fah-/- NOD rag1-/- il2rγnull muis16. Elk model heeft echter zijn eigen voordelen en beperkingen; bijvoorbeeld, AFC8 dubbele gehumaniseerde muizen voor HEPs en menselijke stamcellen (HSCs) op een Balb/C-Rag2-/- γc-/- achtergrond maakt de succesvolle engraftment van immune cellen en hscs, maar er is een afwezigheid van een antigeen-specifieke T-en B-cel antwoord in dit model12. De belangrijkste zorgen bij het reconstitueren van dubbele gehumaniseerde muizen zijn suboptimale engraftment, een gebrek aan geschikte modellen ter ondersteuning van verschillende weefsels, niet-overeenkomende aandoeningen, immuunafstoting of transplantaat-versus-hostziekte (gvhd), en technische moeilijkheden, zoals riskante manipulaties met pasgeborenen en hoge sterftecijfers als gevolg van metabole afwijkingen13.
Hoewel gehumaniseerd muizen zijn gebruikt voor HIV-onderzoek voor vele jaren17,18,19, het gebruik van gehumaniseerde muizen te bestuderen van leverschade veroorzaakt door HIV-1 is beperkt20. We eerder gemeld de oprichting van een dubbele gehumaniseerd TK-nog muismodel en de toepassing ervan in HIV-geassocieerde leverziekte8. Dit model toont de robuuste engraftment van lever en immune cellen en aan HIV infectie pathogenese. Deze discussie presenteert een gedetailleerd protocol, met inbegrip van de meest kritische stappen in de transplantatie van menselijke hepatocyten. Een beschrijving van de Hspc’s die nodig zijn voor een geslaagde engraftment van HEPs en de oprichting van een functioneel immuunsysteem bij TK-nog muizen wordt ook gepresenteerd. Het gebruik van deze muizen om HIV-geassocieerde lever immunopathogenese te bestuderen is gedetailleerd. TK-nog mannelijke muizen met een lever-specifieke herpes simplexvirus type 1 thymidine kinase (HSV-tk) transgen worden gebruikt. Muis levercellen die dit transgen uitdrukken, kunnen gemakkelijk worden ablatie na een korte blootstelling aan een niet-toxische dosis van gcv. Getransplanteerde humane levercellen worden stabiel onderhouden binnen de muis lever zonder exogene drugs21. De muizen zijn ook voorgeconditioneerd met niet-myeloablatieve doses van treosulfan om een niche te creëren in het beenmerg van de muis voor menselijke cellen8. Immunodeficiënte TK-nog-muizen zijn intrasplenisch geïnjecteerd met HEPs en multipotente Hspc’s. De muizen worden vervolgens regelmatig gecontroleerd op bloed en lever reconstitutie door immunofhenootypering in het bloed en metingen van respectievelijk serum humaan-albuminespiegels. Muizen met een succesvolle reconstitutie van meer dan 15% voor zowel menselijke immuuncellen als HEPs zijn intraperitoneaal geïnjecteerd met HIV-1. Het effect van HIV op de lever kan worden beoordeeld al in 4-5 weken na infectie. Het is van cruciaal belang om op te merken dat, omdat HIV-1 wordt gebruikt, alle nodige voorzorgsmaatregelen moeten worden genomen bij het hanteren van het virus en het injecteren in muizen.
Protocol
Representative Results
Discussion
De lever is aangetast en beschadigd bij HIV-geïnfecteerde patiënten24. Experimentele kleine diermodellen voor het bestuderen van menselijke leverziekten in de aanwezigheid van HIV-1 is zeer beperkt, ondanks de beschikbaarheid van een paar gecotransplanteerde diermodellen met CD34+ hspcs en hepatocyten7,12, 25. In in vitro experimenten, hepatocyten worden aangetoond dat een laag niveau HIV-1-…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd gesteund door het National Institute of Health Grant R24OD018546 (to L.Y.P. and S.G.). De auteurs willen graag Weizhe Li, Ph.D. bedanken voor de hulp bij chirurgische ingrepen, Amanda Branch Woods, B.S., Yan Cheng voor immunohistologie, UNMC flow cytometrie Research Facility leden Director Phillip Hexley, Ph.D., Victoria B. Smith, B.S. en Samantha Wall, b.s., unmc Advanced microscopie kern faciliteit leden Janice A. Taylor, b.s., en James R. talaska, b.s., voor de technische ondersteuning. De auteurs erkennen drs. Mamoru Ito en Hiroshi Suemizu van CIEA voor het verstrekken van TK-nog muizen en Dr. Joachim Baumgart voor het verstrekken van treosulfan. De auteurs danken Dr. Adrian Koesters, UNMC, voor haar redactionele bijdrage aan het manuscript.
Materials
| 27G1/2" needles | BD biosciences | 305109 | |
| 30G1/2" needles | BD biosciences | 305106 | |
| 5 mL polystyrene round-bottom tube 12 x 75 mm style | Corning | 352054 | |
| BD 1 mL Tuberculin Syringe Without Needle | BD biosciences | 309659 | |
| BD FACS array bioanalyzer | BD Biosciences | For purity check of eluted CD34+ cells | |
| BD FACS array software | BD Biosciences | Software to analysis acquired CD34+ cell on FACS array | |
| BD FACS lysing solution | BD Biosciences | 349202 | To lyse red blood cells |
| BD LSR II | BD Biosciences | Instrument for acquisiton of flow cytometry samples | |
| BD Vacutainer Plastic Blood Collection Tube | BD biosciences | BD 367874 | To collect Cord blood |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-aldrich | A9576 | |
| Buprenorphine | Controlled substance and pain-killer | ||
| CD14-PE | BD Biosciences | 555398 | Specific to human |
| CD19-BV605 | BD Biosciences | 562653 | Specific to human |
| CD34 MicroBead Kit, human | Miltenyi Biotec | 130-046-702 | For isoation of CD34+ HSPC |
| CD34-PE, human | Miltenyi Biotec | 130-081-002 | Antibody used for purity check of eluted CD34+ cells |
| CD3-AF700 | BD Biosciences | 557943 | Specific to human |
| CD45-PerCPCy5.5 | BD Biosciences | 564105 | Specific to human |
| CD4-APC | BD Biosciences | 555349 | Specific to human |
| CD8-BV421 | BD Biosciences | 562428 | Specific to human |
| Cell counting slides | Bio-rad | 1450015 | |
| ChargeSwitch gDNA Mini Tissue Kit | Thermofisher scientific | CS11204 | for extraction of genomic DNA from ear piece |
| Cobas Amplicor system v1.5 | Roche Molecular Diagnostics | bioanalyzer to measure viral load | |
| Cotton-tipped applicators | McKesson | 24-106-2S | |
| Cytokeratin-18 (CK18) | DAKO | M7010 | Specific to human |
| DMSO (Dimethyl sulfoxide) | Sigma-aldrich | D2650-5X5ML | |
| Extension set Microbore Slide Clamp(s) Fixed Male Luer Lock. L: 60 in L: 152 cm PV: 0.55 mL Fluid Path Sterile | BD biosciences | 30914 | Attached to dispensing pippet and to load with HSPC and HEP suspesion |
| FACS Diva version 6 | BD Biosciences | flow cytometer software required for acqusition of sample | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco | 10438026 | |
| FLOWJO analysis software v10.2 |
FLOWJO, LLC | flow cytometry analysis software | |
| Ganciclovir | APP Pharmaceuticals, Inc. | 315110 | Prescripition drug |
| Greiner MiniCollect EDTA Tubes | Greiner bio-one | 450475 | |
| Hepatocytes thawing medium | Triangle Research Labs | MCHT50 | |
| Horizon Open Ligating Clip Appliers | Teleflex | 537061 | To hold the ligating clips |
| Hospira Sterile Water for Injection | ACE surgical supply co. Inc. | 001-1187 | For dilution of Buprenorphine (pain-killer) |
| Human Albumin ELISA Quantitation Set | Bethyl laboratories | E80-129 | For assesing human albumin levels in mouse serum |
| Human hepatocyte | Triangle Research Labs | HUCP1 | Cryopreserved human hepatocytes, induction qualified |
| Iris Scissors, Straight | Ted Pella, Inc. | 13295 | |
| Lancet | MEDIpoint | Goldenrod 5 mm | |
| LS columns | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | Used to entrap CD34+ microbeads (positive selection) |
| Lymphocyte Separation Medium (LSM) | MP Biomedicals | 50494 | For isoation of lymphocytes from peripheral blood |
| MACS MultiStand | Miltenyi Biotec | 130-042-303 | holds Qudro MACS seperator and LS columns |
| McPherson-Vannas Micro Dissecting Spring Scissors | Roboz Surgical Instrument Co. | RS-5605 | Used to make an incision on skin to expose spleen |
| Micro Dissecting Forceps | Roboz Surgical Instrument Co. | RS-5157 | to hold and pull out spleen from peritoneal cavity |
| mouse CD45-FITC | BD Biosciences | 553080 | mouse-specific |
| PBS (Phosphate Buffered Saline) | Hyclone | SH30256.02 | |
| Qudro MACS separator | Miltenyi Biotec | 130-090-976 | holds four LS columns |
| RPMI 1640 medium | Gibco | 11875093 | |
| StepOne Plus Real Time PCR | Applied Biosystems | Instrument used to genotype | |
| Stepper Series Repetitive Dispensing Pipette 1ml | DYMAX CORP | T15469 | Used to dispense HSPC and HEP supension in controlled manner |
| Suturevet PGA synthetic absorbale suture | Henry Schein Animal Health | 41178 | Suturing of skin and peritoneum |
| TaqMan Gene Expression Master Mix | Thermofisher scientific | 4369016 | |
| TC20 automated cell counter | Bio-rad | 1450102 | |
| TK-NOG mice | Provided by the Central Institute for Experimental Animals (CIEA, Japan; Drs. Mamoru Ito and Hiroshi Suemizu) | ||
| Treosulfan | Medac GmbH | Provided by Dr. Joachim Baumgart (medac GmbH) | |
| Trypan Blue | Bio-rad | 1450022 | |
| Vannas-type Micro Scissors, Straight, 80mm L | Ted Pella, Inc. | 1346 | Used to make an incision on skin to expose spleen |
| Weck hemoclip traditional titanium ligating clips | Esutures | 523700 | To ligate the spleen post-injection |
References
- Smith, C., et al. Factors associated with specific causes of death amongst HIV-positive individuals in the D:A:D Study. AIDS. 24 (10), 1537-1548 (2010).
- Puoti, M., et al. Mortality for liver disease in patients with HIV infection: a cohort study. Journal of Acquired Immune Deficiency Syndromes. 24 (3), 211-217 (2000).
- Rodriguez-Mendez, M. L., Gonzalez-Quintela, A., Aguilera, A., Barrio, E. Prevalence, patterns, and course of past hepatitis B virus infection in intravenous drug users with HIV-1 infection. The American Journal of Gastroenterology. 95 (5), 1316-1322 (2000).
- Scharschmidt, B. F., et al. Hepatitis B in patients with HIV infection: relationship to AIDS and patient survival. Annals of Internal Medicine. 117 (10), 837-838 (1992).
- Lacombe, K., Rockstroh, J. HIV and viral hepatitis coinfections: advances and challenges. Gut. 61, 47-58 (2012).
- Brehm, M. A., Jouvet, N., Greiner, D. L., Shultz, L. D. Humanized mice for the study of infectious diseases. Current Opinion in Immunology. 25 (4), 428-435 (2013).
- Billerbeck, E., et al. Humanized mice efficiently engrafted with fetal hepatoblasts and syngeneic immune cells develop human monocytes and NK cells. The Journal of Hepatology. 65 (2), 334-343 (2016).
- Dagur, R. S., et al. Human hepatocyte depletion in the presence of HIV-1 infection in dual reconstituted humanized mice. Biology Open. 7 (2), (2018).
- Gaska, J. M., Ploss, A. Study of viral pathogenesis in humanized mice. Current Opinion in Virology. 11, 14-20 (2015).
- Gorantla, S., Poluektova, L., Gendelman, H. E. Rodent models for HIV-associated neurocognitive disorders. Trends in Neurosciences. 35 (3), 197-208 (2012).
- Xu, D., et al. Chimeric TK-NOG mice: a predictive model for cholestatic human liver toxicity. The Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 352 (2), 274-280 (2015).
- Washburn, M. L., et al. A humanized mouse model to study hepatitis C virus infection, immune response, and liver disease. Gastroenterology. 140 (4), 1334-1344 (2011).
- Gutti, T. L., et al. Human hepatocytes and hematolymphoid dual reconstitution in treosulfan-conditioned uPA-NOG mice. The American Journal of Pathology. 184 (1), 101-109 (2014).
- Strick-Marchand, H., et al. A novel mouse model for stable engraftment of a human immune system and human hepatocytes. PLoS One. 10 (3), 0119820 (2015).
- Keng, C. T., et al. Characterisation of liver pathogenesis, human immune responses and drug testing in a humanised mouse model of HCV infection. Gut. 65 (10), 1744-1753 (2016).
- Li, F., Nio, K., Yasui, F., Murphy, C. M., Su, L. Studying HBV Infection and Therapy in Immune-Deficient NOD-Rag1-/-IL2RgammaC-null (NRG) Fumarylacetoacetate Hydrolase (Fah) Knockout Mice Transplanted with Human Hepatocytes. Methods in Molecular Biology. 1540, 267-276 (2017).
- Poluektova, L. Y., Garcia, J. V., Koyanagi, Y., Manz, M. G., Tager, A. M. . Humanized Mice for HIV Research. , (2014).
- Cheng, L., Ma, J., Li, G., Su, L. Humanized Mice Engrafted With Human HSC Only or HSC and Thymus Support Comparable HIV-1 Replication, Immunopathology, and Responses to ART and Immune Therapy. Frontiers in Immunology. 9, 817 (2018).
- Zhang, L., Su, L. HIV-1 immunopathogenesis in humanized mouse models. Cellular & Molecular Immunology. 9 (3), 237-244 (2012).
- Nunoya, J., Washburn, M. L., Kovalev, G. I., Su, L. Regulatory T cells prevent liver fibrosis during HIV type 1 infection in a humanized mouse model. The Journal of Infectious Diseases. 209 (7), 1039-1044 (2014).
- Hasegawa, M., et al. The reconstituted ‘humanized liver’ in TK-NOG mice is mature and functional. Biochemical and Biophysical Research Communications. 405 (3), 405-410 (2011).
- Higuchi, Y., et al. The human hepatic cell line HepaRG as a possible cell source for the generation of humanized liver TK-NOG mice. Xenobiotica. 44 (2), 146-153 (2014).
- Kosaka, K., et al. A novel TK-NOG based humanized mouse model for the study of HBV and HCV infections. Biochemical and Biophysical Research Communications. 441 (1), 230-235 (2013).
- Crane, M., Iser, D., Lewin, S. R. Human immunodeficiency virus infection and the liver. World Journal of Hepatology. 4 (3), 91-98 (2012).
- Bility, M. T., Li, F., Cheng, L., Su, L. Liver immune-pathogenesis and therapy of human liver tropic virus infection in humanized mouse models. Journal of Gastroenterology and Hepatology. 28, 120-124 (2013).
- Kong, L., et al. Low-level HIV infection of hepatocytes. Virology Journal. 9, 1-7 (2012).
- Dash, P. K., et al. Long-acting nanoformulated antiretroviral therapy elicits potent antiretroviral and neuroprotective responses in HIV-1-infected humanized mice. AIDS. 26 (17), 2135-2144 (2012).
- Sun, S., Li, J. Humanized chimeric mouse models of hepatitis B virus infection. International Journal of Infectious Diseases. 59, 131-136 (2017).
- Shafritz, D. A., Oertel, M. Model systems and experimental conditions that lead to effective repopulation of the liver by transplanted cells. The International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 43 (2), 198-213 (2011).
- Almeida-Porada, G., Porada, C. D., Chamberlain, J., Torabi, A., Zanjani, E. D. Formation of human hepatocytes by human hematopoietic stem cells in sheep. Blood. 104 (8), 2582-2590 (2004).
- Streetz, K. L., et al. Hepatic parenchymal replacement in mice by transplanted allogeneic hepatocytes is facilitated by bone marrow transplantation and mediated by CD4 cells. Hepatology. 47 (2), 706-718 (2008).
