एचआईवी से जुड़े लिवर रोगजनन के लिए दोहरी मानवीकृत टीके-एनओजी माउस मॉडल की स्थापना
Summary
इस प्रोटोकॉल दोनों मानव प्रतिरक्षा प्रणाली और जिगर की कोशिकाओं के साथ मानवीय चूहों की स्थापना के लिए एक विश्वसनीय विधि प्रदान करता है. मानव हेपेटोसाइट्स और सीडी34+ हेमेटोपोएटिक स्टेम कोशिकाओं के इंट्रास्प्लेनिक इंजेक्शन के माध्यम से प्राप्त दोहरी पुनर्गठन इम्यूनोन्यूफिडेक्ट चूहों मानव इम्यूनोडेफिशियेंसी वायरस-1 संक्रमण के लिए अतिसंवेदनशील होते हैं और में मनाया के रूप में जिगर की क्षति recapitulate एचआईवी संक्रमित रोगियों।
Abstract
मानव इम्यूनोडेफिशियेंसी वायरस-1 (एचआईवी-1) से संक्रमित रोगियों की जीवन प्रत्याशा में वृद्धि के बावजूद, यकृत रोग उनकी रुग्णता का एक आम कारण के रूप में उभरा है। एचआईवी-1 के कारण लीवर इम्यूनोपैथोलॉजी मायावी बनी हुई है। मानव hepatocytes और मानव प्रतिरक्षा प्रणाली के साथ छोटे xenograft पशु मॉडल रोग रोगजनन के मानव जीव विज्ञान recapitulate कर सकते हैं. इसमें, एक प्रोटोकॉल मानव hepatocytes और CD34 के माध्यम से एक दोहरी मानवीय माउस मॉडल स्थापित करने के लिए वर्णित है+ hematopoietic स्टेम / दोहरी पुनर्गठन को प्राप्त करने के लिए, पुरुष TK-NOG (NOD. Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Sug Tg(Alb-TK)7-2/ShiJic) चूहों को माउस ट्रांसजेनिक लिवर कोशिकाओं को खत्म करने के लिए गैनिकलोविर (जीसीवी) खुराक के साथ इंट्रापेरिटोनली इंजेक्शन दिया जाता है, और गैर-माइलोब्लटिव कंडीशनिंग के लिए ट्रेसोसल्फान के साथ, दोनों मानव hepatocyte (HEP) engraftment और मानव प्रतिरक्षा प्रणाली (एचआईएस) विकास की सुविधा. मानव एल्बुमिन (एएलबी) के स्तर जिगर engraftment के लिए मूल्यांकन कर रहे हैं, और प्रवाह cytometry द्वारा पता चला रक्त में मानव प्रतिरक्षा कोशिकाओं की उपस्थिति मानव प्रतिरक्षा प्रणाली की स्थापना की पुष्टि करता है. यहाँ वर्णित प्रोटोकॉल का उपयोग कर विकसित मॉडल एचआईवी-1 संक्रमण से जिगर की क्षति के कई घटकों जैसा दिखता है। इसकी स्थापना हेपेटाइटिस वायरस सह संक्रमण के अध्ययन के लिए और एंटीवायरल और एंटीरेट्रोवायरल दवाओं के मूल्यांकन के लिए आवश्यक साबित हो सकती है।
Introduction
एंटीरेट्रोवायरल थेरेपी के आगमन के बाद से, एचआईवी-1 मोनोइंसेटिव से संबंधित मौतों में काफी कमी आई है। तथापि, यकृत रोग एचआईवी संक्रमित रोगियों में रुग्णता का एक सामान्य कारण के रूप में उभरा है1,2. एचआईवी-1 संक्रमण वाले हेपेटाइटिस वायरस का सह संक्रमण अधिक आम है , जो संयुक्त राज्य अमेरिका में एचआईवी संक्रमित व्यक्तियों के 10% – 30% के लिए जिम्मेदारहै 3,4,5.
एचआईवी-1 और हेपेटाइटिस वायरस की मेजबान विशिष्टता मानव-विशिष्ट संक्रामक रोगों का अध्ययन करने या एचआईवी-1-संबद्ध यकृत रोगजनन के कई पहलुओं की जांच करने के लिए छोटे पशु मॉडलों की उपयोगिता को सीमित करती है। प्रतिरक्षा की कमी वाले चूहे जो मानव कोशिकाओं और/या ऊतकों के engraftment की अनुमति देते हैं (मानवीकृत माउस मॉडल कहा जाता है) पूर्व नैदानिक अध्ययनों केलिए स्वीकार्य पशु मॉडल हैं 6,7,8. 2000 के दशक के शुरू में मानवीकृत चूहों की शुरूआत के बाद से, cholestatic मानव यकृत विषाक्तता के कई पूर्व नैदानिक अध्ययन, मानव-विशिष्ट रोगजनकों, एचआईवी-1 और एचआईवी संबद्ध neurocognitive विकारों सहित, एपस्टीन बार वायरस, हेपेटाइटिस, और अन्य संक्रामक रोगों की जांच इन चूहों6,9,10,11में की गई है . CD34+ HSPCs और/या मानव hepatocyte प्रत्यारोपण के लिए एकाधिक माउस मॉडल लंबे समय से विकसित किया गया है और हेपेटाइटिस बी वायरस (HBV) संबद्ध जिगर की बीमारी12के रोग रोगजनन का अध्ययन करने के लिए समय के साथ सुधार हुआ है, 13 , 14.एचएसपीसी और मानव हेपेटोसाइट (एचईपी) प्रत्यारोपण के लिए कई मॉडल उपभेदों पर आधारित होते हैं, जिन्हें एनओजी (एनओडी) के रूप में जाना जाता है। ग-Prkdcscid Il2rgtm1Sug/JicTac)8,13,एनएसजी (NOD. Cg-Prkdcscid Il2rgtm1WJl/SzJ)15, Balb/C-Rag2-/- [c-/- (Rag2tm1.1Flv Il2rgtm1.1Flv/ J)12,और fah-/- NOD rag1/ il2r-null माउस16| हालांकि, प्रत्येक मॉडल के अपने फायदे और सीमाएं हैं; उदाहरण के लिए, एचईपी और मानव स्टेम सेल (एचएससी) के लिए एएफसी8 दोहरी मानवीय चूहों एक Balb/C-Rag2पर -/- [c-/ इस मॉडल12में प्रतिक्रिया . डबल मानवीकृत चूहों के पुनर्गठन में प्रमुख चिंताओं में शामिल हैं suboptimal engraftment, विभिन्न ऊतकों का समर्थन करने के लिए उपयुक्त मॉडल की कमी, बेमेल स्थितियों, प्रतिरक्षा अस्वीकृति, या भ्रष्टाचारबनाम– मेजबान रोग (GVHD), और तकनीकी कठिनाइयों, इस तरह के नवजात शिशुओं के साथ जोखिम भरा जोड़तोड़ और चयापचय असामान्यताएं13के कारण उच्च मृत्यु दर के रूप में.
यद्यपि मानवीकृत चूहों का उपयोग कई वर्षों से एच आई वी अनुसंधान के लिए किया गया है17,18,19, एचआईवी -1 के कारण होने वाले यकृत क्षति का अध्ययन करने के लिए मानवीकृत चूहों का उपयोगसीमितकिया गया है . हम पहले एक दोहरी मानवीय TK-NOG माउस मॉडल और एचआईवी संबद्ध जिगर की बीमारी8में इसके आवेदन की स्थापना की सूचना दी. इस मॉडल जिगर और प्रतिरक्षा कोशिकाओं के मजबूत engraftment से पता चलता है और एचआईवी संक्रमण रोगजनन recapitulates. यह चर्चा एक विस्तृत प्रोटोकॉल प्रस्तुत करता है, मानव hepatocytes के प्रत्यारोपण में सबसे महत्वपूर्ण कदम भी शामिल है. एचईपी के सफल ग्राफ्टमेंट और टीके-एनओजी चूहों में एक कार्यात्मक प्रतिरक्षा प्रणाली की स्थापना के लिए आवश्यक एचएसपीसी का विवरण भी प्रस्तुत किया गया है। एचआईवी-संबद्ध यकृत इम्यूनोरोगाजेनोजेसिस का अध्ययन करने के लिए इन चूहों का उपयोग विस्तृत है। TK-NOG पुरुष चूहों एक जिगर विशेष दाद सिंप्लेक्स वायरस प्रकार ले जाने 1 थाइमिडीन kinase (HSV-TK) transgene उपयोग किया जाता है. माउस जिगर की कोशिकाओं को इस transgene व्यक्त आसानी से GCV के एक nontoxic खुराक के लिए एक संक्षिप्त जोखिम के बाद ablated किया जा सकता है. प्रतिरोपित मानव यकृत कोशिकाओं को बाह्य जात औषधियोंकेबिना माउस यकृत के भीतर स्टयपर किया जाता है . चूहों को मानव कोशिकाओं के लिए माउस अस्थि मज्जा में एक जगह बनाने के लिए ट्रेसुल्फान की गैर-मिलिएलोएब्लेटिव खुराक के साथ भी पूर्व-संस्कार किया जाता है8. इम्यूनोडेमिन्यूड टीके-नोग चूहों को एचईपी और मल्टीपॉवर एचपीएससी के साथ इंट्रास्प्लेनली इंजेक्ट किया जाता है। चूहों तो नियमित रूप से रक्त इम्यूनोफेनोटाइपिंग और सीरम मानव-एल्बुमिन के स्तर की माप द्वारा रक्त और जिगर पुनर्गठन के लिए नियमित रूप से निगरानी कर रहे हैं, क्रमशः. मानव प्रतिरक्षा कोशिकाओं और एचईपी दोनों के लिए 15% से अधिक के सफल पुनर्गठन के साथ चूहे को एचआईवी-1 के साथ इंट्रापेरिटोनली इंजेक्शन दिया जाता है। जिगर पर एचआईवी के प्रभाव के रूप में जल्दी के रूप में मूल्यांकन किया जा सकता है 4 – 5 सप्ताह postinfection. यह ध्यान रखना महत्वपूर्ण है कि, क्योंकि एचआईवी-1 का उपयोग किया जाता है, वायरस से निपटने और चूहों में इंजेक्शन लगाते समय सभी आवश्यक सावधानियां बरतनी चाहिए।
Protocol
Representative Results
Discussion
एचआईवी संक्रमित रोगियों में यकृत के साथ समझौता किया जाता है और क्षतिग्रस्तहो जाताहै । एचआईवी-1 की उपस्थिति में मानव यकृत रोगों के अध्ययन के लिए प्रायोगिक छोटे पशु मॉडल अत्यंत सीमित है, CD34+ HS…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
यह काम राष्ट्रीय स्वास्थ्य अनुदान R24OD018546 (L.Y.P. और S.G. के लिए) द्वारा समर्थित किया गया था. लेखकों को शल्य चिकित्सा प्रक्रियाओं में मदद के लिए Weizhe ली, पीएच.डी., धन्यवाद करना चाहते हैं, अमांडा शाखा वुड्स, बी एस, प्रतिरक्षा विज्ञान के लिए यान चेंग, UNMC प्रवाह साइटोमेट्री अनुसंधान सुविधा के सदस्यों के निदेशक फिलिप हेक्सले, पीएच.डी., विक्टोरिया बी स्मिथ, बी.एस., और सामन्था वॉल, बी.एस., UNMC उन्नत माइक्रोस्कोपी कोर सुविधा के सदस्यों जेनिस ए टेलर, बी.एस., और जेम्स आर Talaska, बी.एस., तकनीकी सहायता के लिए. लेखकों TK-NOG चूहों और डॉ Joachim Baumgart treosulfan प्रदान करने के लिए प्रदान करने के लिए सीआईईए से Drs. Mamoru Ito और हिरोशी Suemizu स्वीकार करते हैं. लेखकों डॉ एड्रियन Koesters, UNMC, पांडुलिपि के लिए अपने संपादकीय योगदान के लिए धन्यवाद.
Materials
| 27G1/2" needles | BD biosciences | 305109 | |
| 30G1/2" needles | BD biosciences | 305106 | |
| 5 mL polystyrene round-bottom tube 12 x 75 mm style | Corning | 352054 | |
| BD 1 mL Tuberculin Syringe Without Needle | BD biosciences | 309659 | |
| BD FACS array bioanalyzer | BD Biosciences | For purity check of eluted CD34+ cells | |
| BD FACS array software | BD Biosciences | Software to analysis acquired CD34+ cell on FACS array | |
| BD FACS lysing solution | BD Biosciences | 349202 | To lyse red blood cells |
| BD LSR II | BD Biosciences | Instrument for acquisiton of flow cytometry samples | |
| BD Vacutainer Plastic Blood Collection Tube | BD biosciences | BD 367874 | To collect Cord blood |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-aldrich | A9576 | |
| Buprenorphine | Controlled substance and pain-killer | ||
| CD14-PE | BD Biosciences | 555398 | Specific to human |
| CD19-BV605 | BD Biosciences | 562653 | Specific to human |
| CD34 MicroBead Kit, human | Miltenyi Biotec | 130-046-702 | For isoation of CD34+ HSPC |
| CD34-PE, human | Miltenyi Biotec | 130-081-002 | Antibody used for purity check of eluted CD34+ cells |
| CD3-AF700 | BD Biosciences | 557943 | Specific to human |
| CD45-PerCPCy5.5 | BD Biosciences | 564105 | Specific to human |
| CD4-APC | BD Biosciences | 555349 | Specific to human |
| CD8-BV421 | BD Biosciences | 562428 | Specific to human |
| Cell counting slides | Bio-rad | 1450015 | |
| ChargeSwitch gDNA Mini Tissue Kit | Thermofisher scientific | CS11204 | for extraction of genomic DNA from ear piece |
| Cobas Amplicor system v1.5 | Roche Molecular Diagnostics | bioanalyzer to measure viral load | |
| Cotton-tipped applicators | McKesson | 24-106-2S | |
| Cytokeratin-18 (CK18) | DAKO | M7010 | Specific to human |
| DMSO (Dimethyl sulfoxide) | Sigma-aldrich | D2650-5X5ML | |
| Extension set Microbore Slide Clamp(s) Fixed Male Luer Lock. L: 60 in L: 152 cm PV: 0.55 mL Fluid Path Sterile | BD biosciences | 30914 | Attached to dispensing pippet and to load with HSPC and HEP suspesion |
| FACS Diva version 6 | BD Biosciences | flow cytometer software required for acqusition of sample | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco | 10438026 | |
| FLOWJO analysis software v10.2 |
FLOWJO, LLC | flow cytometry analysis software | |
| Ganciclovir | APP Pharmaceuticals, Inc. | 315110 | Prescripition drug |
| Greiner MiniCollect EDTA Tubes | Greiner bio-one | 450475 | |
| Hepatocytes thawing medium | Triangle Research Labs | MCHT50 | |
| Horizon Open Ligating Clip Appliers | Teleflex | 537061 | To hold the ligating clips |
| Hospira Sterile Water for Injection | ACE surgical supply co. Inc. | 001-1187 | For dilution of Buprenorphine (pain-killer) |
| Human Albumin ELISA Quantitation Set | Bethyl laboratories | E80-129 | For assesing human albumin levels in mouse serum |
| Human hepatocyte | Triangle Research Labs | HUCP1 | Cryopreserved human hepatocytes, induction qualified |
| Iris Scissors, Straight | Ted Pella, Inc. | 13295 | |
| Lancet | MEDIpoint | Goldenrod 5 mm | |
| LS columns | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | Used to entrap CD34+ microbeads (positive selection) |
| Lymphocyte Separation Medium (LSM) | MP Biomedicals | 50494 | For isoation of lymphocytes from peripheral blood |
| MACS MultiStand | Miltenyi Biotec | 130-042-303 | holds Qudro MACS seperator and LS columns |
| McPherson-Vannas Micro Dissecting Spring Scissors | Roboz Surgical Instrument Co. | RS-5605 | Used to make an incision on skin to expose spleen |
| Micro Dissecting Forceps | Roboz Surgical Instrument Co. | RS-5157 | to hold and pull out spleen from peritoneal cavity |
| mouse CD45-FITC | BD Biosciences | 553080 | mouse-specific |
| PBS (Phosphate Buffered Saline) | Hyclone | SH30256.02 | |
| Qudro MACS separator | Miltenyi Biotec | 130-090-976 | holds four LS columns |
| RPMI 1640 medium | Gibco | 11875093 | |
| StepOne Plus Real Time PCR | Applied Biosystems | Instrument used to genotype | |
| Stepper Series Repetitive Dispensing Pipette 1ml | DYMAX CORP | T15469 | Used to dispense HSPC and HEP supension in controlled manner |
| Suturevet PGA synthetic absorbale suture | Henry Schein Animal Health | 41178 | Suturing of skin and peritoneum |
| TaqMan Gene Expression Master Mix | Thermofisher scientific | 4369016 | |
| TC20 automated cell counter | Bio-rad | 1450102 | |
| TK-NOG mice | Provided by the Central Institute for Experimental Animals (CIEA, Japan; Drs. Mamoru Ito and Hiroshi Suemizu) | ||
| Treosulfan | Medac GmbH | Provided by Dr. Joachim Baumgart (medac GmbH) | |
| Trypan Blue | Bio-rad | 1450022 | |
| Vannas-type Micro Scissors, Straight, 80mm L | Ted Pella, Inc. | 1346 | Used to make an incision on skin to expose spleen |
| Weck hemoclip traditional titanium ligating clips | Esutures | 523700 | To ligate the spleen post-injection |
References
- Smith, C., et al. Factors associated with specific causes of death amongst HIV-positive individuals in the D:A:D Study. AIDS. 24 (10), 1537-1548 (2010).
- Puoti, M., et al. Mortality for liver disease in patients with HIV infection: a cohort study. Journal of Acquired Immune Deficiency Syndromes. 24 (3), 211-217 (2000).
- Rodriguez-Mendez, M. L., Gonzalez-Quintela, A., Aguilera, A., Barrio, E. Prevalence, patterns, and course of past hepatitis B virus infection in intravenous drug users with HIV-1 infection. The American Journal of Gastroenterology. 95 (5), 1316-1322 (2000).
- Scharschmidt, B. F., et al. Hepatitis B in patients with HIV infection: relationship to AIDS and patient survival. Annals of Internal Medicine. 117 (10), 837-838 (1992).
- Lacombe, K., Rockstroh, J. HIV and viral hepatitis coinfections: advances and challenges. Gut. 61, 47-58 (2012).
- Brehm, M. A., Jouvet, N., Greiner, D. L., Shultz, L. D. Humanized mice for the study of infectious diseases. Current Opinion in Immunology. 25 (4), 428-435 (2013).
- Billerbeck, E., et al. Humanized mice efficiently engrafted with fetal hepatoblasts and syngeneic immune cells develop human monocytes and NK cells. The Journal of Hepatology. 65 (2), 334-343 (2016).
- Dagur, R. S., et al. Human hepatocyte depletion in the presence of HIV-1 infection in dual reconstituted humanized mice. Biology Open. 7 (2), (2018).
- Gaska, J. M., Ploss, A. Study of viral pathogenesis in humanized mice. Current Opinion in Virology. 11, 14-20 (2015).
- Gorantla, S., Poluektova, L., Gendelman, H. E. Rodent models for HIV-associated neurocognitive disorders. Trends in Neurosciences. 35 (3), 197-208 (2012).
- Xu, D., et al. Chimeric TK-NOG mice: a predictive model for cholestatic human liver toxicity. The Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 352 (2), 274-280 (2015).
- Washburn, M. L., et al. A humanized mouse model to study hepatitis C virus infection, immune response, and liver disease. Gastroenterology. 140 (4), 1334-1344 (2011).
- Gutti, T. L., et al. Human hepatocytes and hematolymphoid dual reconstitution in treosulfan-conditioned uPA-NOG mice. The American Journal of Pathology. 184 (1), 101-109 (2014).
- Strick-Marchand, H., et al. A novel mouse model for stable engraftment of a human immune system and human hepatocytes. PLoS One. 10 (3), 0119820 (2015).
- Keng, C. T., et al. Characterisation of liver pathogenesis, human immune responses and drug testing in a humanised mouse model of HCV infection. Gut. 65 (10), 1744-1753 (2016).
- Li, F., Nio, K., Yasui, F., Murphy, C. M., Su, L. Studying HBV Infection and Therapy in Immune-Deficient NOD-Rag1-/-IL2RgammaC-null (NRG) Fumarylacetoacetate Hydrolase (Fah) Knockout Mice Transplanted with Human Hepatocytes. Methods in Molecular Biology. 1540, 267-276 (2017).
- Poluektova, L. Y., Garcia, J. V., Koyanagi, Y., Manz, M. G., Tager, A. M. . Humanized Mice for HIV Research. , (2014).
- Cheng, L., Ma, J., Li, G., Su, L. Humanized Mice Engrafted With Human HSC Only or HSC and Thymus Support Comparable HIV-1 Replication, Immunopathology, and Responses to ART and Immune Therapy. Frontiers in Immunology. 9, 817 (2018).
- Zhang, L., Su, L. HIV-1 immunopathogenesis in humanized mouse models. Cellular & Molecular Immunology. 9 (3), 237-244 (2012).
- Nunoya, J., Washburn, M. L., Kovalev, G. I., Su, L. Regulatory T cells prevent liver fibrosis during HIV type 1 infection in a humanized mouse model. The Journal of Infectious Diseases. 209 (7), 1039-1044 (2014).
- Hasegawa, M., et al. The reconstituted ‘humanized liver’ in TK-NOG mice is mature and functional. Biochemical and Biophysical Research Communications. 405 (3), 405-410 (2011).
- Higuchi, Y., et al. The human hepatic cell line HepaRG as a possible cell source for the generation of humanized liver TK-NOG mice. Xenobiotica. 44 (2), 146-153 (2014).
- Kosaka, K., et al. A novel TK-NOG based humanized mouse model for the study of HBV and HCV infections. Biochemical and Biophysical Research Communications. 441 (1), 230-235 (2013).
- Crane, M., Iser, D., Lewin, S. R. Human immunodeficiency virus infection and the liver. World Journal of Hepatology. 4 (3), 91-98 (2012).
- Bility, M. T., Li, F., Cheng, L., Su, L. Liver immune-pathogenesis and therapy of human liver tropic virus infection in humanized mouse models. Journal of Gastroenterology and Hepatology. 28, 120-124 (2013).
- Kong, L., et al. Low-level HIV infection of hepatocytes. Virology Journal. 9, 1-7 (2012).
- Dash, P. K., et al. Long-acting nanoformulated antiretroviral therapy elicits potent antiretroviral and neuroprotective responses in HIV-1-infected humanized mice. AIDS. 26 (17), 2135-2144 (2012).
- Sun, S., Li, J. Humanized chimeric mouse models of hepatitis B virus infection. International Journal of Infectious Diseases. 59, 131-136 (2017).
- Shafritz, D. A., Oertel, M. Model systems and experimental conditions that lead to effective repopulation of the liver by transplanted cells. The International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 43 (2), 198-213 (2011).
- Almeida-Porada, G., Porada, C. D., Chamberlain, J., Torabi, A., Zanjani, E. D. Formation of human hepatocytes by human hematopoietic stem cells in sheep. Blood. 104 (8), 2582-2590 (2004).
- Streetz, K. L., et al. Hepatic parenchymal replacement in mice by transplanted allogeneic hepatocytes is facilitated by bone marrow transplantation and mediated by CD4 cells. Hepatology. 47 (2), 706-718 (2008).
