Summary

Создание двойной гуманизированной модели мыши TK-NOG для ВИЧ-ассоциированного патогенеза печени

Published: September 11, 2019
doi:

Summary

Этот протокол обеспечивает надежный метод для создания гуманизированных мышей с иммунной системой человека и клетками печени. Двойной восстановленный иммунодефицитных мышей, достигнутых с помощью интраспелинической инъекции человеческих гепатоцитов и CD34 гематопоиетических стволовых клеток восприимчивы к вирусу иммунодефицита человека-1 инфекции и повторение повреждения печени, как наблюдается в ВИЧ-инфицированных пациентов.

Abstract

Несмотря на увеличение продолжительности жизни пациентов, инфицированных вирусом иммунодефицита человека-1 (ВИЧ-1), заболевание печени стало распространенной причиной их заболеваемости. Иммунопатология печени, вызванная ВИЧ-1, остается неуловимой. Малые модели животных ксенотрансплантата с гепатоцитами человека и иммунной системой человека могут резюмировать биологию человека патогенеза болезни. При этом описывается протокол для создания двойной гуманизированной модели мыши с помощью человеческих гепатоцитов и CD34 гематопоиетических стволовых /клеток-прародителей (HSPCs) трансплантации, для изучения иммунопатологии печени, как наблюдается у ВИЧ-инфицированных пациентов. Для достижения двойной реконституции, мужчины ТЗ-НОГ (NOD. Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Sug Tg (Alb-TK)7-2/ShiJic) мышей интраперитоно вводят с ганциклозир (GCV) дозы для устранения мыши трансгенных клеток печени, и с treosulfan для немиелоаблятивного кондиционирования, оба из которых из которых оба из которых облегчить гепатоциты человека (HEP) прививок и иммунной системы человека (HIS) развития. Уровень альбумина человека (ALB) оценивается для прививок печени, а наличие иммунных клеток человека в крови, обнаруженных цитометрией потока, подтверждает установление иммунной системы человека. Модель, разработанная с использованием описанного здесь протокола, напоминает несколько компонентов повреждения печени от ВИЧ-1. Его создание может оказаться необходимым для исследований совместной инфекции вируса гепатита и для оценки противовирусных и антиретровирусных препаратов.

Introduction

С момента появления антиретровирусной терапии произошло значительное снижение смертности от моноинфекции ВИЧ-1. Тем не менее, заболевания печени стала распространенной причиной заболеваемости у ВИЧ-инфицированных пациентов1,2. Инфекции вирусов гепатита с ВИЧ-1 встречаются чаще, на долю 10% – 30% ВИЧ-инфицированных в США3,4,5.

Специфика вирусов ВИЧ-1 и гепатита ограничивает полезность малых моделей животных для изучения специфических инфекционных заболеваний человека или для изучения многочисленных аспектов патогенеза печени, связанного с ВИЧ-1. Иммунодефицитные мыши, которые позволяют прививать человеческие клетки и / или ткани (так называют гуманизированных моделей мыши) являются приемлемыми животными модели для доклинических исследований6,7,8. С момента появления гуманизированных мышей в начале 2000-х годов, многочисленные доклинические исследования токсичности холестатической печени человека, специфических для человека патогенов, включая ВИЧ-1 и ВИЧ-ассоциированные нейрокогнитивные расстройства, вирус Эпштейна Барра, гепатит и другие инфекционных заболеваний, были исследованы в этих мышей6,9,10,11. Несколько моделей мыши для CD34и HSPCs и / или трансплантации гепатоцитов человека уже давно разработаны и улучшились с течением времени для изучения болезни патогенеза вируса гепатита В (HBV)-связанных заболеваний печени12, 13 Год , 14. Несколько моделей для трансплантации гепатоцитов и человека (HEP) основаны на штаммах, известных как NOG (NOD). CG-Prkdcscid Il2rgtm1Sug/JicTac)8,13, NSG (NOD. CG-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ)15, Balb/C-Rag2-/- кк-/- (Rag2tm1.1Flv Il2rgtm1.1Flv/J)12, и fah-/- NOD rag1-/- il2r null мышь16. Однако каждая модель имеет свои преимущества и ограничения; например, AFC8 двойных гуманизированных мышей для HEPs и стволовых клеток человека (HSCs) на Balb/C-Rag2-/- Кк-/- фон позволяет успешно привить иммунных клеток и HSCs, но есть отсутствие антигена конкретных Т- и В-клеток ответ в этой модели12. Основные проблемы в восстановлении двойной гуманизированных мышей включают субоптимальный прививок, отсутствие подходящих моделей для поддержки различных тканей, несовпадающие условия, иммунный отторженный, или трансплантат –по сравнениюс -хост болезни (GVHD), и технические трудности, такие как рискованные манипуляции с новорожденными и высокие показатели смертности из-за метаболических нарушений13.

Хотя гуманизированные мыши были использованы для исследования ВИЧ в течение многих лет17,18,19, использование гуманизированных мышей для изучения повреждения печени, вызванные ВИЧ-1 была ограничена20. Ранее мы сообщали о создании двойной гуманизированной модели мыши TK-NOG и ее применении при ВИЧ-ассоциированном заболевании печени8. Эта модель показывает надежное прививочение печени и иммунных клеток и резюмирует патогенез ВИЧ-инфекции. В ходе этой дискуссии представлен подробный протокол, включав в себя наиболее важные шаги в области трансплантации гепатоцитов человека. Представлено также описание HSPCs, необходимых для успешного прививки От hePs и создания функциональной иммунной системы у мышей ТК-NOG. Использование этих мышей для изучения ВИЧ-ассоциированного иммунопатогенеза печени подробно. TK-NOG мышей, перевозящих печени конкретных вирус простого герпеса типа 1 тимидин киназы (HSV-TK) трансгениспользуютиспользуются. Клетки печени мыши выражая этот transgene можно легко ablated после краткого подвержения к nontoxic дозе GCV. Пересаженные клетки печени человека устойчиво поддерживаются в печени мыши без экзогенных препаратов21. Мышей также предусловные с nonmyeloablative дозы треосульфана для создания ниши в костном мозге мыши для человеческих клеток8. Иммунодефицитные мыши ТК-НОГ интраспленически вводятся с помощью HePs и многопотентных HSPCs. Затем мышей регулярно контролируют на наличие в крови и печени восстановления с помощью иммунофенотипирования крови и измерений уровня сыворотки человека и альбумина, соответственно. Мыши с успешной реконституцией более 15% как для иммунных клеток человека, так и для HEPs интраперитоно вводят ВИЧ-1. Влияние ВИЧ на печень можно оценить уже через 4 – 5 недель после инфицирования. Важно отметить, что, поскольку ВИЧ-1 используется, все необходимые меры предосторожности должны быть приняты при обработке вируса и инъекционных его на мышей.

Protocol

Этот протокол был одобрен Институциональным комитетом по уходу за животными и использованию (IACUC) при Медицинском центре Университета штата Небраска. ПРИМЕЧАНИЕ: Получить одобрение от местного IACUC перед проведением экспериментов на животных. 1. Об?…

Representative Results

Создание двойной гуманизированной мыши модели с человеческой печени и иммунных клеток можно легко контролировать на каждом шагу с очень простой ELISA и поток цитометрии, соответственно. Цитометрия потока регулярно выполняется для оценки развития функциональной иммун?…

Discussion

Печень скомпрометирована и повреждена у ВИЧ-инфицированных пациентов24. Экспериментальные модели малых животных для изучения заболеваний печени человека в присутствии ВИЧ-1 крайне ограничены, несмотря на наличие нескольких скотрансажированных моделей животных с CD34и</s…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Эта работа была поддержана Национальным институтом здравоохранения грант R24OD018546 (в L.Y.P. и S.G.). Авторы хотели бы поблагодарить Вайчжэ Ли, доктор философии, за помощь в хирургических процедурах, Аманда Бранч Вудс, B.S., Ян Ченг для иммуногистологии, UNMC потока цитометрии членов научно-исследовательского центра директор Филипп Хексли, доктор философии, Виктория Б. Смит, B.S., и Саманта Уолл, B.S., UNMC передовые микроскопии основных членов объекта Дженис А. Тейлор, B.S., и Джеймс Р. Таласка, B.S., для технической поддержки. Авторы признают д-ра Мамору Ито и Хироси Суамидзу из CIEA за предоставление мышей ТК-НОГ и д-ра Иоахима Баумгарта за предоставление треосульфана. Авторы благодарят д-ра Адриана Кестерса, UNMC, за ее редакционный вклад в рукопись.

Materials

27G1/2" needles BD biosciences 305109
30G1/2" needles BD biosciences 305106
5 mL polystyrene  round-bottom tube 12 x 75 mm style Corning 352054
BD 1 mL Tuberculin Syringe Without Needle BD biosciences 309659
BD FACS array bioanalyzer  BD Biosciences For purity check of eluted CD34+ cells 
BD FACS array software BD Biosciences Software to analysis acquired CD34+ cell on FACS array
BD FACS lysing solution BD Biosciences 349202 To lyse red blood cells
BD LSR II BD Biosciences Instrument for acquisiton of flow cytometry samples
BD Vacutainer Plastic Blood Collection Tube BD biosciences BD 367874 To collect Cord blood
Bovine Serum Albumin  Sigma-aldrich A9576
Buprenorphine Controlled substance and pain-killer
CD14-PE BD Biosciences 555398 Specific to human
CD19-BV605 BD Biosciences 562653 Specific to human
CD34 MicroBead Kit, human Miltenyi Biotec 130-046-702 For isoation of   CD34+ HSPC
CD34-PE, human Miltenyi Biotec 130-081-002 Antibody used for purity check of eluted CD34+ cells 
CD3-AF700 BD Biosciences 557943 Specific to human
CD45-PerCPCy5.5 BD Biosciences 564105 Specific to human
CD4-APC BD Biosciences 555349 Specific to human
CD8-BV421 BD Biosciences 562428 Specific to human
Cell counting slides Bio-rad 1450015
ChargeSwitch gDNA Mini Tissue Kit Thermofisher scientific CS11204 for extraction of genomic DNA from ear piece
Cobas Amplicor system v1.5  Roche Molecular Diagnostics bioanalyzer to measure viral load
Cotton-tipped applicators   McKesson 24-106-2S
Cytokeratin-18 (CK18) DAKO M7010 Specific to human
DMSO (Dimethyl sulfoxide) Sigma-aldrich D2650-5X5ML
Extension set Microbore Slide Clamp(s) Fixed Male Luer Lock. L: 60 in L: 152 cm PV: 0.55 mL Fluid Path Sterile BD biosciences 30914 Attached to dispensing pippet and to load with HSPC and HEP suspesion
FACS Diva version 6 BD Biosciences flow cytometer software required for  acqusition of sample
Fetal Bovine Serum (FBS) Gibco 10438026
FLOWJO analysis software
v10.2
FLOWJO, LLC flow cytometry analysis software
Ganciclovir APP Pharmaceuticals, Inc. 315110 Prescripition drug
Greiner MiniCollect EDTA Tubes Greiner bio-one 450475
Hepatocytes thawing medium  Triangle Research Labs  MCHT50
Horizon Open Ligating Clip Appliers Teleflex 537061 To hold the ligating clips
Hospira Sterile Water for Injection ACE surgical supply co. Inc. 001-1187 For dilution of Buprenorphine (pain-killer)
Human Albumin ELISA Quantitation Set Bethyl laboratories E80-129 For assesing human albumin levels in mouse serum
Human hepatocyte Triangle Research Labs  HUCP1  Cryopreserved human hepatocytes, induction qualified 
Iris Scissors, Straight Ted Pella, Inc. 13295
Lancet MEDIpoint Goldenrod 5 mm
LS columns  Miltenyi Biotec 130-042-401 Used to entrap CD34+ microbeads (positive selection)
Lymphocyte Separation Medium (LSM) MP Biomedicals 50494 For isoation of   lymphocytes from peripheral blood
MACS MultiStand Miltenyi Biotec 130-042-303 holds Qudro MACS seperator and LS columns
McPherson-Vannas Micro Dissecting Spring Scissors Roboz Surgical Instrument Co. RS-5605 Used to make an incision on skin to expose spleen
Micro Dissecting Forceps Roboz Surgical Instrument Co. RS-5157  to hold and pull out spleen from peritoneal cavity
mouse CD45-FITC BD Biosciences 553080 mouse-specific
PBS (Phosphate Buffered Saline) Hyclone SH30256.02
Qudro MACS separator  Miltenyi Biotec 130-090-976 holds four LS columns
RPMI 1640 medium Gibco 11875093
StepOne Plus Real Time PCR  Applied Biosystems Instrument used  to  genotype
Stepper Series Repetitive Dispensing Pipette 1ml DYMAX CORP T15469 Used to  dispense  HSPC and HEP supension in controlled manner
Suturevet PGA synthetic absorbale suture Henry Schein Animal Health 41178 Suturing of skin and peritoneum
TaqMan Gene Expression Master Mix Thermofisher scientific 4369016
TC20 automated cell counter Bio-rad 1450102
TK-NOG mice  Provided by the Central Institute for Experimental Animals (CIEA, Japan; Drs. Mamoru Ito and Hiroshi Suemizu)
Treosulfan Medac GmbH Provided by  Dr. Joachim Baumgart (medac GmbH) 
Trypan Blue Bio-rad 1450022
Vannas-type Micro Scissors, Straight, 80mm L Ted Pella, Inc. 1346 Used to make an incision on skin to expose spleen
Weck hemoclip traditional titanium ligating clips Esutures 523700 To ligate the spleen post-injection

References

  1. Smith, C., et al. Factors associated with specific causes of death amongst HIV-positive individuals in the D:A:D Study. AIDS. 24 (10), 1537-1548 (2010).
  2. Puoti, M., et al. Mortality for liver disease in patients with HIV infection: a cohort study. Journal of Acquired Immune Deficiency Syndromes. 24 (3), 211-217 (2000).
  3. Rodriguez-Mendez, M. L., Gonzalez-Quintela, A., Aguilera, A., Barrio, E. Prevalence, patterns, and course of past hepatitis B virus infection in intravenous drug users with HIV-1 infection. The American Journal of Gastroenterology. 95 (5), 1316-1322 (2000).
  4. Scharschmidt, B. F., et al. Hepatitis B in patients with HIV infection: relationship to AIDS and patient survival. Annals of Internal Medicine. 117 (10), 837-838 (1992).
  5. Lacombe, K., Rockstroh, J. HIV and viral hepatitis coinfections: advances and challenges. Gut. 61, 47-58 (2012).
  6. Brehm, M. A., Jouvet, N., Greiner, D. L., Shultz, L. D. Humanized mice for the study of infectious diseases. Current Opinion in Immunology. 25 (4), 428-435 (2013).
  7. Billerbeck, E., et al. Humanized mice efficiently engrafted with fetal hepatoblasts and syngeneic immune cells develop human monocytes and NK cells. The Journal of Hepatology. 65 (2), 334-343 (2016).
  8. Dagur, R. S., et al. Human hepatocyte depletion in the presence of HIV-1 infection in dual reconstituted humanized mice. Biology Open. 7 (2), (2018).
  9. Gaska, J. M., Ploss, A. Study of viral pathogenesis in humanized mice. Current Opinion in Virology. 11, 14-20 (2015).
  10. Gorantla, S., Poluektova, L., Gendelman, H. E. Rodent models for HIV-associated neurocognitive disorders. Trends in Neurosciences. 35 (3), 197-208 (2012).
  11. Xu, D., et al. Chimeric TK-NOG mice: a predictive model for cholestatic human liver toxicity. The Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 352 (2), 274-280 (2015).
  12. Washburn, M. L., et al. A humanized mouse model to study hepatitis C virus infection, immune response, and liver disease. Gastroenterology. 140 (4), 1334-1344 (2011).
  13. Gutti, T. L., et al. Human hepatocytes and hematolymphoid dual reconstitution in treosulfan-conditioned uPA-NOG mice. The American Journal of Pathology. 184 (1), 101-109 (2014).
  14. Strick-Marchand, H., et al. A novel mouse model for stable engraftment of a human immune system and human hepatocytes. PLoS One. 10 (3), 0119820 (2015).
  15. Keng, C. T., et al. Characterisation of liver pathogenesis, human immune responses and drug testing in a humanised mouse model of HCV infection. Gut. 65 (10), 1744-1753 (2016).
  16. Li, F., Nio, K., Yasui, F., Murphy, C. M., Su, L. Studying HBV Infection and Therapy in Immune-Deficient NOD-Rag1-/-IL2RgammaC-null (NRG) Fumarylacetoacetate Hydrolase (Fah) Knockout Mice Transplanted with Human Hepatocytes. Methods in Molecular Biology. 1540, 267-276 (2017).
  17. Poluektova, L. Y., Garcia, J. V., Koyanagi, Y., Manz, M. G., Tager, A. M. . Humanized Mice for HIV Research. , (2014).
  18. Cheng, L., Ma, J., Li, G., Su, L. Humanized Mice Engrafted With Human HSC Only or HSC and Thymus Support Comparable HIV-1 Replication, Immunopathology, and Responses to ART and Immune Therapy. Frontiers in Immunology. 9, 817 (2018).
  19. Zhang, L., Su, L. HIV-1 immunopathogenesis in humanized mouse models. Cellular & Molecular Immunology. 9 (3), 237-244 (2012).
  20. Nunoya, J., Washburn, M. L., Kovalev, G. I., Su, L. Regulatory T cells prevent liver fibrosis during HIV type 1 infection in a humanized mouse model. The Journal of Infectious Diseases. 209 (7), 1039-1044 (2014).
  21. Hasegawa, M., et al. The reconstituted ‘humanized liver’ in TK-NOG mice is mature and functional. Biochemical and Biophysical Research Communications. 405 (3), 405-410 (2011).
  22. Higuchi, Y., et al. The human hepatic cell line HepaRG as a possible cell source for the generation of humanized liver TK-NOG mice. Xenobiotica. 44 (2), 146-153 (2014).
  23. Kosaka, K., et al. A novel TK-NOG based humanized mouse model for the study of HBV and HCV infections. Biochemical and Biophysical Research Communications. 441 (1), 230-235 (2013).
  24. Crane, M., Iser, D., Lewin, S. R. Human immunodeficiency virus infection and the liver. World Journal of Hepatology. 4 (3), 91-98 (2012).
  25. Bility, M. T., Li, F., Cheng, L., Su, L. Liver immune-pathogenesis and therapy of human liver tropic virus infection in humanized mouse models. Journal of Gastroenterology and Hepatology. 28, 120-124 (2013).
  26. Kong, L., et al. Low-level HIV infection of hepatocytes. Virology Journal. 9, 1-7 (2012).
  27. Dash, P. K., et al. Long-acting nanoformulated antiretroviral therapy elicits potent antiretroviral and neuroprotective responses in HIV-1-infected humanized mice. AIDS. 26 (17), 2135-2144 (2012).
  28. Sun, S., Li, J. Humanized chimeric mouse models of hepatitis B virus infection. International Journal of Infectious Diseases. 59, 131-136 (2017).
  29. Shafritz, D. A., Oertel, M. Model systems and experimental conditions that lead to effective repopulation of the liver by transplanted cells. The International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 43 (2), 198-213 (2011).
  30. Almeida-Porada, G., Porada, C. D., Chamberlain, J., Torabi, A., Zanjani, E. D. Formation of human hepatocytes by human hematopoietic stem cells in sheep. Blood. 104 (8), 2582-2590 (2004).
  31. Streetz, K. L., et al. Hepatic parenchymal replacement in mice by transplanted allogeneic hepatocytes is facilitated by bone marrow transplantation and mediated by CD4 cells. Hepatology. 47 (2), 706-718 (2008).

Play Video

Cite This Article
Dagur, R. S., Wang, W., Makarov, E., Sun, Y., Poluektova, L. Y. Establishment of the Dual Humanized TK-NOG Mouse Model for HIV-associated Liver Pathogenesis. J. Vis. Exp. (151), e58645, doi:10.3791/58645 (2019).

View Video