Etablering av dual Humanisert TK-NOG Mouse modell for HIV-assosiert Liver patogenesen
Summary
Denne protokollen gir en pålitelig metode for å etablere humanisert mus med både humant immunsystem og leverceller. Dual rekonstituert immunodeficient mus oppnådd via intrasplenic injeksjon av menneskelig HEPATOCYTTER og CD34+ blodkreft stamceller er mottakelige for humant immunsviktvirus-1 infeksjon og recapitulate leverskader som observert i HIV-infiserte pasienter.
Abstract
Til tross for økt levealder for pasienter smittet med humant immunsviktvirus-1 (HIV-1), leversykdom har dukket opp som en vanlig årsak til sykelighet deres. Leveren immunopathology forårsaket av HIV-1 er fortsatt unnvikende. Små xenograft dyremodeller med humant hepatocytter og humant immunsystem kan recapitulate menneskets biologi av sykdoms patogenesen. Heri, en protokoll er beskrevet for å etablere en dual humanisert musemodell gjennom menneskelige hepatocytter og CD34+ blodkreft stem/stamceller (HSPCs) transplantasjon, for å studere leveren immunopathology som OBSERVERT i HIV-infiserte pasienter. For å oppnå dobbel rekonstituering, mannlig TK-NOG (NOD. CG-Prkdcscid Il2rgtm1Sug TG (alb-tk) 7-2/ShiJic) mus er intraperitonealt injisert med ganciklovir (GCV) doser for å eliminere mus transgene leverceller, og med treosulfan for nonmyeloablative condition, som begge lette menneskelig hepatocytter (HEP) engraftment og menneskets immunsystem (HIS) utvikling. Humant albumin (ALB) nivåer er evaluert for leveren engraftment, og tilstedeværelsen av menneskelige immunceller i blodet oppdaget av Flow flowcytometri bekrefter etablering av menneskets immunsystem. Modellen utviklet ved hjelp av protokollen beskrevet her ligner flere komponenter av leverskader fra HIV-1-smitte. Dens etablering kan vise seg å være avgjørende for studier av hepatitt virus co-smitte og for evaluering av antivirale og antiretroviral narkotika.
Introduction
Siden ankomsten av antiretroviral behandling, har det vært en betydelig nedgang i dødsfall knyttet til HIV-1 monoinfection. Men, leversykdom har dukket opp som en vanlig årsak til sykelighet i HIV-infiserte pasienter1,2. Coinfections av hepatitt virus med HIV-1 infeksjon er mer vanlig, sto for 10%-30% av HIV-smittede personer i USA3,4,5.
Verten-spesifisitet av HIV-1 og hepatitt virus begrenser nytten av små dyremodeller å studere menneskelig-spesifikke smittsomme sykdommer eller å undersøke flere aspekter av HIV-1-assosiert leveren patogenesen. Immunodeficient mus som tillater engraftment av menneskelige celler og/eller vev (kalt humanisert mus modeller) er akseptable dyremodeller for prekliniske studier6,7,8. Siden innføringen av humanisert mus tidlig på 2000-tallet, flere prekliniske studier av kolestatisk Human leveren toksisitet, Human-spesifikke patogener, inkludert HIV-1 og HIV-assosiert nevrokognitive lidelser, Epstein Barr virus, hepatitt, og andre smittsomme sykdommer, har blitt undersøkt i disse musene6,9,10,11. Flere musemodeller for CD34+ HSPCs og/eller menneskelig hepatocytter transplantasjon har lenge vært utviklet og har bedret seg over tid for å studere sykdommen patogenesen av hepatitt B-viruset (HBV)-assosiert leversykdom12, 13 på alle , 14. flere modeller for HSPC og menneskelig HEPATOCYTTER (HEP) transplantasjon er basert på stammer, kjent som NOG (Nod. CG-Prkdcscid Il2rgtm1Sug/JicTac)8,13, NSG (nikk. CG-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ)15, Balb/C-Rag2-/- γc-/- (Rag2TM 1.1 FLV Il2rgTM 1.1 FLV/J)12, og Fah-/- Nod rag1-/- il2rγnull mus16. Imidlertid har hver modell sine egne fordeler og begrensninger; for eksempel, AFC8 dual humanisert mus for HEPs og humane stamceller (HSCs) på en Balb/C-Rag2-/- γc-/- bakgrunn muliggjør vellykket engraftment av immunceller og HSCs, men det er et fravær av et antigen-spesifikke T-og B-celle respons i denne modellen12. De største bekymringene i rekonstituering av doble humanisert mus inkluderer suboptimal engraftment, mangel på egnede modeller for å støtte ulike vev, feilaktige forhold, immun avvisning, eller pode-versus-host sykdom (GVHD), og teknisk vanskeligheter, slik som risikabelt manipulasjoner med nyfødte og høy dødelighet på grunn av metabolsk unormalt13.
Selv om humanisert mus har blitt brukt til HIV-forskning i mange år17,18,19, har bruk av humanisert mus for å studere leverskader forårsaket av HIV-1 er begrenset20. Vi har tidligere rapportert etablering av en dobbel humanisert TK-NOG mus modell og dens anvendelse i HIV-assosiert leversykdom8. Denne modellen viser den robuste engraftment av lever og immunceller og viser HIV-smitte patogenesen. Denne diskusjonen presenterer en detaljert protokoll, inkludert de mest kritiske trinnene i transplantasjon av menneskelig hepatocytter. En beskrivelse av HSPCs som kreves for en vellykket engraftment av HEPs og etablering av et funksjonelt immunsystem i TK-NOG mus er også presentert. Bruken av disse musene å studere HIV-assosiert leveren immunopathogenesis er detaljert. TK-NOG mannlige mus bærer en lever-spesifikke herpes simplex virus type 1 tymidin kinase (HSV-TK) transgene brukes. Mus leverceller uttrykker denne transgene kan lett bli ablated etter en kort eksponering for en nontoxic dose av GCV. Transplantert menneskelige leverceller er stabilt opprettholdt i musen leveren uten eksogene narkotika21. Musene er også preconditioned med nonmyeloablative doser av treosulfan å skape en nisje i musen benmargen for menneskelige celler8. Immunodeficient TK-NOG mus er intrasplenically injisert med HEPs og Multipotent HSPCs. Musene overvåkes deretter regelmessig for blod og leveren rekonstituering av blod immunfenotyping og målinger av serum humant-albumin nivåer, henholdsvis. Mus med en vellykket rekonstituering på mer enn 15% for både humane immunceller og HEPs er intraperitonealt injisert med HIV-1. Effekten av HIV på leveren kan vurderes så tidlig som 4-5 uker postinfection. Det er viktig å merke seg at, fordi HIV-1 brukes, må alle nødvendige forholdsregler tas under håndtering av viruset og injisere det i mus.
Protocol
Representative Results
Discussion
Leveren er kompromittert og skadet i HIV-infiserte pasienter24. Eksperimentelle små dyremodeller for å studere Human leversykdommer i nærvær av HIV-1 er svært begrenset, til tross for tilgjengeligheten av et par cotransplanted dyr modeller med CD34+ HSPCs og hepatocytter7,12, 25på. I in vitro eksperimenter, hepatocytter er vist å ha lavt nivå HIV-1 infeksjon26. …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbeidet ble støttet av National Institute of Health Grant R24OD018546 (til L.Y.P. og S.G.). Forfatterne vil gjerne takke Weizhe Li, Ph.D., for hjelp i kirurgiske prosedyrer, Amanda Branch Woods, BS, Yan Cheng for immunohistology, UNMC flyt flowcytometri forskningsanlegg medlemmer direktør Phillip Hexley, Ph.D., Victoria B. Smith, BS, og Samantha Wall, B.S., UNMC avanserte mikroskopi Core Facility medlemmer Janice A. Taylor, BS, og James R. Talaska, BS, for teknisk støtte. Forfatterne erkjenner DRS. Mamoru Ito og Hiroshi Suemizu fra CIEA for å gi TK-NOG mus og Dr. Joachim Baumgart for å gi treosulfan. Forfatterne takker Dr. Adrian Koesters, UNMC, for hennes redaksjonelle bidrag til manuskriptet.
Materials
| 27G1/2" needles | BD biosciences | 305109 | |
| 30G1/2" needles | BD biosciences | 305106 | |
| 5 mL polystyrene round-bottom tube 12 x 75 mm style | Corning | 352054 | |
| BD 1 mL Tuberculin Syringe Without Needle | BD biosciences | 309659 | |
| BD FACS array bioanalyzer | BD Biosciences | For purity check of eluted CD34+ cells | |
| BD FACS array software | BD Biosciences | Software to analysis acquired CD34+ cell on FACS array | |
| BD FACS lysing solution | BD Biosciences | 349202 | To lyse red blood cells |
| BD LSR II | BD Biosciences | Instrument for acquisiton of flow cytometry samples | |
| BD Vacutainer Plastic Blood Collection Tube | BD biosciences | BD 367874 | To collect Cord blood |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-aldrich | A9576 | |
| Buprenorphine | Controlled substance and pain-killer | ||
| CD14-PE | BD Biosciences | 555398 | Specific to human |
| CD19-BV605 | BD Biosciences | 562653 | Specific to human |
| CD34 MicroBead Kit, human | Miltenyi Biotec | 130-046-702 | For isoation of CD34+ HSPC |
| CD34-PE, human | Miltenyi Biotec | 130-081-002 | Antibody used for purity check of eluted CD34+ cells |
| CD3-AF700 | BD Biosciences | 557943 | Specific to human |
| CD45-PerCPCy5.5 | BD Biosciences | 564105 | Specific to human |
| CD4-APC | BD Biosciences | 555349 | Specific to human |
| CD8-BV421 | BD Biosciences | 562428 | Specific to human |
| Cell counting slides | Bio-rad | 1450015 | |
| ChargeSwitch gDNA Mini Tissue Kit | Thermofisher scientific | CS11204 | for extraction of genomic DNA from ear piece |
| Cobas Amplicor system v1.5 | Roche Molecular Diagnostics | bioanalyzer to measure viral load | |
| Cotton-tipped applicators | McKesson | 24-106-2S | |
| Cytokeratin-18 (CK18) | DAKO | M7010 | Specific to human |
| DMSO (Dimethyl sulfoxide) | Sigma-aldrich | D2650-5X5ML | |
| Extension set Microbore Slide Clamp(s) Fixed Male Luer Lock. L: 60 in L: 152 cm PV: 0.55 mL Fluid Path Sterile | BD biosciences | 30914 | Attached to dispensing pippet and to load with HSPC and HEP suspesion |
| FACS Diva version 6 | BD Biosciences | flow cytometer software required for acqusition of sample | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco | 10438026 | |
| FLOWJO analysis software v10.2 |
FLOWJO, LLC | flow cytometry analysis software | |
| Ganciclovir | APP Pharmaceuticals, Inc. | 315110 | Prescripition drug |
| Greiner MiniCollect EDTA Tubes | Greiner bio-one | 450475 | |
| Hepatocytes thawing medium | Triangle Research Labs | MCHT50 | |
| Horizon Open Ligating Clip Appliers | Teleflex | 537061 | To hold the ligating clips |
| Hospira Sterile Water for Injection | ACE surgical supply co. Inc. | 001-1187 | For dilution of Buprenorphine (pain-killer) |
| Human Albumin ELISA Quantitation Set | Bethyl laboratories | E80-129 | For assesing human albumin levels in mouse serum |
| Human hepatocyte | Triangle Research Labs | HUCP1 | Cryopreserved human hepatocytes, induction qualified |
| Iris Scissors, Straight | Ted Pella, Inc. | 13295 | |
| Lancet | MEDIpoint | Goldenrod 5 mm | |
| LS columns | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | Used to entrap CD34+ microbeads (positive selection) |
| Lymphocyte Separation Medium (LSM) | MP Biomedicals | 50494 | For isoation of lymphocytes from peripheral blood |
| MACS MultiStand | Miltenyi Biotec | 130-042-303 | holds Qudro MACS seperator and LS columns |
| McPherson-Vannas Micro Dissecting Spring Scissors | Roboz Surgical Instrument Co. | RS-5605 | Used to make an incision on skin to expose spleen |
| Micro Dissecting Forceps | Roboz Surgical Instrument Co. | RS-5157 | to hold and pull out spleen from peritoneal cavity |
| mouse CD45-FITC | BD Biosciences | 553080 | mouse-specific |
| PBS (Phosphate Buffered Saline) | Hyclone | SH30256.02 | |
| Qudro MACS separator | Miltenyi Biotec | 130-090-976 | holds four LS columns |
| RPMI 1640 medium | Gibco | 11875093 | |
| StepOne Plus Real Time PCR | Applied Biosystems | Instrument used to genotype | |
| Stepper Series Repetitive Dispensing Pipette 1ml | DYMAX CORP | T15469 | Used to dispense HSPC and HEP supension in controlled manner |
| Suturevet PGA synthetic absorbale suture | Henry Schein Animal Health | 41178 | Suturing of skin and peritoneum |
| TaqMan Gene Expression Master Mix | Thermofisher scientific | 4369016 | |
| TC20 automated cell counter | Bio-rad | 1450102 | |
| TK-NOG mice | Provided by the Central Institute for Experimental Animals (CIEA, Japan; Drs. Mamoru Ito and Hiroshi Suemizu) | ||
| Treosulfan | Medac GmbH | Provided by Dr. Joachim Baumgart (medac GmbH) | |
| Trypan Blue | Bio-rad | 1450022 | |
| Vannas-type Micro Scissors, Straight, 80mm L | Ted Pella, Inc. | 1346 | Used to make an incision on skin to expose spleen |
| Weck hemoclip traditional titanium ligating clips | Esutures | 523700 | To ligate the spleen post-injection |
References
- Smith, C., et al. Factors associated with specific causes of death amongst HIV-positive individuals in the D:A:D Study. AIDS. 24 (10), 1537-1548 (2010).
- Puoti, M., et al. Mortality for liver disease in patients with HIV infection: a cohort study. Journal of Acquired Immune Deficiency Syndromes. 24 (3), 211-217 (2000).
- Rodriguez-Mendez, M. L., Gonzalez-Quintela, A., Aguilera, A., Barrio, E. Prevalence, patterns, and course of past hepatitis B virus infection in intravenous drug users with HIV-1 infection. The American Journal of Gastroenterology. 95 (5), 1316-1322 (2000).
- Scharschmidt, B. F., et al. Hepatitis B in patients with HIV infection: relationship to AIDS and patient survival. Annals of Internal Medicine. 117 (10), 837-838 (1992).
- Lacombe, K., Rockstroh, J. HIV and viral hepatitis coinfections: advances and challenges. Gut. 61, 47-58 (2012).
- Brehm, M. A., Jouvet, N., Greiner, D. L., Shultz, L. D. Humanized mice for the study of infectious diseases. Current Opinion in Immunology. 25 (4), 428-435 (2013).
- Billerbeck, E., et al. Humanized mice efficiently engrafted with fetal hepatoblasts and syngeneic immune cells develop human monocytes and NK cells. The Journal of Hepatology. 65 (2), 334-343 (2016).
- Dagur, R. S., et al. Human hepatocyte depletion in the presence of HIV-1 infection in dual reconstituted humanized mice. Biology Open. 7 (2), (2018).
- Gaska, J. M., Ploss, A. Study of viral pathogenesis in humanized mice. Current Opinion in Virology. 11, 14-20 (2015).
- Gorantla, S., Poluektova, L., Gendelman, H. E. Rodent models for HIV-associated neurocognitive disorders. Trends in Neurosciences. 35 (3), 197-208 (2012).
- Xu, D., et al. Chimeric TK-NOG mice: a predictive model for cholestatic human liver toxicity. The Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 352 (2), 274-280 (2015).
- Washburn, M. L., et al. A humanized mouse model to study hepatitis C virus infection, immune response, and liver disease. Gastroenterology. 140 (4), 1334-1344 (2011).
- Gutti, T. L., et al. Human hepatocytes and hematolymphoid dual reconstitution in treosulfan-conditioned uPA-NOG mice. The American Journal of Pathology. 184 (1), 101-109 (2014).
- Strick-Marchand, H., et al. A novel mouse model for stable engraftment of a human immune system and human hepatocytes. PLoS One. 10 (3), 0119820 (2015).
- Keng, C. T., et al. Characterisation of liver pathogenesis, human immune responses and drug testing in a humanised mouse model of HCV infection. Gut. 65 (10), 1744-1753 (2016).
- Li, F., Nio, K., Yasui, F., Murphy, C. M., Su, L. Studying HBV Infection and Therapy in Immune-Deficient NOD-Rag1-/-IL2RgammaC-null (NRG) Fumarylacetoacetate Hydrolase (Fah) Knockout Mice Transplanted with Human Hepatocytes. Methods in Molecular Biology. 1540, 267-276 (2017).
- Poluektova, L. Y., Garcia, J. V., Koyanagi, Y., Manz, M. G., Tager, A. M. . Humanized Mice for HIV Research. , (2014).
- Cheng, L., Ma, J., Li, G., Su, L. Humanized Mice Engrafted With Human HSC Only or HSC and Thymus Support Comparable HIV-1 Replication, Immunopathology, and Responses to ART and Immune Therapy. Frontiers in Immunology. 9, 817 (2018).
- Zhang, L., Su, L. HIV-1 immunopathogenesis in humanized mouse models. Cellular & Molecular Immunology. 9 (3), 237-244 (2012).
- Nunoya, J., Washburn, M. L., Kovalev, G. I., Su, L. Regulatory T cells prevent liver fibrosis during HIV type 1 infection in a humanized mouse model. The Journal of Infectious Diseases. 209 (7), 1039-1044 (2014).
- Hasegawa, M., et al. The reconstituted ‘humanized liver’ in TK-NOG mice is mature and functional. Biochemical and Biophysical Research Communications. 405 (3), 405-410 (2011).
- Higuchi, Y., et al. The human hepatic cell line HepaRG as a possible cell source for the generation of humanized liver TK-NOG mice. Xenobiotica. 44 (2), 146-153 (2014).
- Kosaka, K., et al. A novel TK-NOG based humanized mouse model for the study of HBV and HCV infections. Biochemical and Biophysical Research Communications. 441 (1), 230-235 (2013).
- Crane, M., Iser, D., Lewin, S. R. Human immunodeficiency virus infection and the liver. World Journal of Hepatology. 4 (3), 91-98 (2012).
- Bility, M. T., Li, F., Cheng, L., Su, L. Liver immune-pathogenesis and therapy of human liver tropic virus infection in humanized mouse models. Journal of Gastroenterology and Hepatology. 28, 120-124 (2013).
- Kong, L., et al. Low-level HIV infection of hepatocytes. Virology Journal. 9, 1-7 (2012).
- Dash, P. K., et al. Long-acting nanoformulated antiretroviral therapy elicits potent antiretroviral and neuroprotective responses in HIV-1-infected humanized mice. AIDS. 26 (17), 2135-2144 (2012).
- Sun, S., Li, J. Humanized chimeric mouse models of hepatitis B virus infection. International Journal of Infectious Diseases. 59, 131-136 (2017).
- Shafritz, D. A., Oertel, M. Model systems and experimental conditions that lead to effective repopulation of the liver by transplanted cells. The International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 43 (2), 198-213 (2011).
- Almeida-Porada, G., Porada, C. D., Chamberlain, J., Torabi, A., Zanjani, E. D. Formation of human hepatocytes by human hematopoietic stem cells in sheep. Blood. 104 (8), 2582-2590 (2004).
- Streetz, K. L., et al. Hepatic parenchymal replacement in mice by transplanted allogeneic hepatocytes is facilitated by bone marrow transplantation and mediated by CD4 cells. Hepatology. 47 (2), 706-718 (2008).
