Summary
在这里, 我们提出了一个协议, 以执行检测转座受接触染色质测序 (ATAC-seq) 激活 CD4 + 人类淋巴细胞。该协议已被修改, 以尽量减少污染线粒体 DNA 读取从50% 到3% 通过引入一个新的裂解缓冲液。
Abstract
ATAC-seq 由于其快速简便的方法绘制了全基因组可访问的染色质, 已成为表观遗传学研究中广泛使用的一种方法。在本文中, 我们提出了一个改进的 Ata-seq 协议, 减少污染线粒体 DNA 读取。虽然以前的 Ata-seq 协议与平均50% 的污染线粒体 DNA 的操作作斗争, 但该协议中引入的优化裂解缓冲液将线粒体 DNA 污染降低到平均3%。这种改进的 Ata-seq 协议使测序成本降低了近50%。我们展示了如何从激活的 CD4 + 淋巴细胞制备这些高质量的 Ata-seq 库, 通过数据分析提供 CD4 + 淋巴细胞从全血分离的分步指导。这种改进的 Atc-seq 协议已在广泛的细胞类型中得到验证, 并将立即用于研究染色质可获得性的研究人员。
Introduction
经骨可接触染色质测序 (ATAC-seq) 的检测已迅速成为询问染色质结构的主要方法。ATAC-seq 可以通过标记过程 (用相同的酶对 DNA 进行碎片化和标记) 来识别可访问染色质的区域, 从而生成可测序可以确定整个基因组中可获得染色质的文库。这个标记过程是介导的多活性 Tn5 转座酶, 这只削减开放区域的染色质由于核细胞组位位阻滞。在切割时, tn5 转座酶还插入测序适配器, 通过 pcr 和下一代全基因组可访问染色质 1,2 的测序构建。
ATAC-seq 已成为确定染色质可访问性区域的首选方法, 因为协议相对简单、快速, 质量和信息范围可根据其结果确定, 而且所需的起始材料数量较少。与 DNase-seq3 (也测量全基因组染色质的可及性) 相比, DNase-seq4 (它确定了开放基因组区域中的核糖体位置) 和甲醛介导的 faire-seq5, atac-seq 更快,更便宜, 更可重现性1。它也比较敏感, 与仅有500个原子核的起始材料一起工作, 而 DNase-seq3所需的核为 5, 000万核。与其他方法相比, Atc-seq 还能够提供更多有关染色质结构的信息, 包括转录因子结合、核糖体定位和开放染色质区域1。有效的单细胞 atc-seq 协议已经得到验证, 提供了关于单细胞级别6,7的染色质结构的信息。
Ata-seq 已被用于描述染色质结构的范围广泛的研究和细胞类型, 包括植物8, 人类9, 和许多其他生物。它在确定疾病状态的表观遗传调控方面也至关重要。然而, 最广泛使用的 Ata-seq 协议包括从线粒体 DNA 读取污染测序的主要缺点。在某些数据集中, 此污染水平可能高达测序结果1的60%。在这一领域作出了协调一致的努力, 以减少这些污染的线粒体读数, 从而能够更有效地应用 ata-seq 7、10、11.在这里, 我们提出了一个改进的 Ata-seq 协议, 将线粒体 DNA 污染率降低到只有 3%, 允许减少约50% 的测序成本 10。这是通过简化的 CD4 + 淋巴细胞分离和活化过程以及改进的裂解缓冲液实现的, 这对于最大限度地减少线粒体 DNA 污染至关重要。
这种增强型 Ata-seq 协议已通过广泛的原代细胞得到验证, 包括人类原代外周血单个核细胞 (Pbmc) 10、人原代单核细胞和小鼠树突状细胞 (未发表)。它还被成功地用于在非编码元素11的聚集定期间隔短回文重复 (CRISPR) 屏幕中询问黑色素瘤细胞系。此外, 本协议中描述并在 GitHub 上提供的数据分析包为新的、有经验的研究人员提供了分析 Ata-seq 数据的工具。ATAC-seq 是在整个基因组中绘制染色质可访问性的最有效的检测方法, 对此处介绍的现有协议进行修改将使研究人员能够生成具有低线粒体 DNA 污染的高质量数据,降低测序成本, 提高 Ata-seq 吞吐量。
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Protocol
这一改进的协议为执行 CD4 + 淋巴细胞的 Ata-seq 提供了分步指导, 从全血的起始材料到数据分析 (图 1)。
1. 全血 CD4+ T 细胞的分离
请注意:该方案的起始材料为15毫升的新鲜全血, 使用标准程序收集, 允许根据研究要求选择起始材料的来源。根据需要扩展协议。预热磷酸盐缓冲盐水 (PBS) + 2% 胎儿小牛血清 (FCS) 至室温 (RT), 并在开始 CD4+ T 细胞浓缩程序之前将离心机调整为 RT。
- 将750μl 的人类 CD4 + T 细胞富集鸡尾酒加入50毫升锥形管中的15毫升全血中, 通过倒置轻轻混合。在 RT 孵化20分钟。孵育完成后, 在试管中加入15毫升的 PBS + 2% FCS, 并通过倒置轻轻混合。
- 制备一种新的50毫升锥形管, 密度介质为15毫升。小心地将稀释后的血液样本分层到密度介质的顶部, 确保不会破坏形成的密度介质和血界面。离心 20分钟, 在 1200 x g 和rt 与加速度设置为1和下降制动关闭。
请注意:在离心机上将加速度设置为1和降制动关闭是至关重要的, 以避免密度介质中的电池层中断。 - 利用窄茎转移移液器从密度介质/等离子体界面收集浓缩的 CD4+ T 细胞。将收集到的细胞转移到一个新鲜的50毫升锥形管。在 423 x g和 Rt 条件下对采集到的 Cd4+ t 细胞进行8分钟的离心。
请注意:确保将离心机加速度返回到 9, 将制动降为 ON, 步骤1.3 和以下所有步骤。 - 丢弃上清液, 用50毫升的 PBS + 2% FCS 清洗细胞颗粒, 在 423 x g 和 rt 离心 8分钟, 丢弃最终上清液清洗, 并暂停在 pbs + 2% fcs 的2毫升中清洗细胞颗粒。
- 使用血细胞计计数细胞。若要继续使用 Ata-seq, 请继续执行步骤2.3。要冻结单元格以供以后处理, 请继续执行步骤1.6。
- 每100万个细胞加入1毫升新鲜冷冻培养基 (90% FCS + 10% 二甲基亚硫醚)。在低温安全管内冷冻介质中的细胞中的白酒1毫升。将管道放置在-80°c 处过夜, 放在缓慢冻结的容器中。第二天, 将管道转移到液氮上长期储存。
注:每2毫升的原始全血量将分离出 100万个 Cd4+ t 细胞。在1毫升的冷冻培养基中冷冻 500, 000个细胞。在任何使用时都要制作新鲜的冷冻培养基。
2. 激活和纯化 CD4+ T 细胞
请注意:这种用于激活和纯化 CD4+ T 细胞的快速协议只需 48小时, 结果是95% 的活的、激活的 CD4+ T 细胞。在开始协议之前, 将离心机冷却到4°c。
- 在37°c 的水浴中解冻 1个 CD4+ T 细胞的1个小瓶 (500, 000), 直到冰刚刚融化。轻轻地将细胞转移到一个15毫升的锥形管, 其中包含9毫升预热的罗斯威尔公园纪念研究所-1640 (RPMI-1640) 介质补充10% 的 FCS, 以下简称完整的 RPMI。
注: 不要让细胞完全解冻, 以避免暴露在 DMSO 中。 - 在 1500 x g和4°C 下离心6分钟。丢弃上清液, 轻轻悬浮在全 RPMI 的2毫升中的颗粒。重复旋转, 丢弃上清液, 并轻轻地将细胞悬浮在 0.5 mL 的完全 RPMI 中。
- 用血细胞仪计数细胞。用完整的 RPMI 调整细胞悬浮液的密度, 使96孔圆形底板的每口200Μl 中的 50, 000个细胞板。
请注意:从一个冷冻管 500K CD4+ T 细胞, 板10井 50, 000 CD4+ T 细胞在200Μl 每口井。 -
制备与人 t-激活剂抗 CD3 和抗 CD28 抗体结合的磁珠。
- 对于每个 Atc-seq 样品到 1.5 mL 管的人 t-激活剂 CCCCG/cd28 珠子的倾斜剂。用 1x PBS 的1毫升清洗珠子, 并将管子放在磁铁上1分钟。
- 小心地取出并丢弃透明上清液, 从磁铁中取出管, 并在每个 ATAC-seq 样品中悬挂13Μl 完整 RPMI 中的珠子。
注: 根据正在处理的 Ata-seq 样品的数量计算所需的珠子数量。该协议要求每 500, 000个细胞含有12.μμl 的 ccd28 珠, 构成一个 Atc-seq 样本。
- 激活 CD4 + T 单元格。在一个15毫升的锥形管中收集2.1 毫升的 RPMI 介质中的 500, 000个细胞, 并在一个15毫升的锥形管中添加12.5 μL 的预洗的人 t-激活剂珠。通过倒置管轻轻混合。
- 用多通道移液器将带珠子的细胞轻轻转移到无菌储液中, 并使用多通道移液器, 将每个圆底96孔板的圆盘上有珠子200μl。在 37°C 5% Co 2 孵化器中孵育 48小时.
- 后孵育, 离心96孔板 8分钟, 在 423 x g和 rt. 从96孔板中取出每口100μl 的介质, 在丢弃前将其收集到锥形管中, 以确保无珠损。将细胞颗粒重新装入剩余的 100μl, 并在 1.5 mL 管中收集所有颗粒。
注 : 10 化 t 细胞将在 1 毫升的体积中收集。 - 执行 CD4 + 隔离。在1毫升的完整 RPMI 中, 将预先清洗过的 CD4 共轭珠加入50Μl。用移液器将珠子和细胞混合在一起。在4°c 的冰箱中孵化20分钟。每6分钟搅拌珠子和细胞混合物。
请注意:该协议将用于一个样本的 500, 000个细胞。根据需要调整为两个或更多样品的 500, 000。 - 孵育完成后, 将管放在磁铁上 2分钟, 清除后取出并丢弃上清液。清洗珠带细胞, 从磁铁中取出管, 将珠带细胞悬挂在 PBS + 2% FCS 的1毫升中, 更换磁铁上的管 1分钟, 丢弃清除上清液。重复此过程, 共洗3次。
请注意:清洗时注意不要丢弃任何珠子。 - 最后清洗后, 将管子放在磁铁上 1分钟, 取出并丢弃上清液, 将颗粒放在冰上。继续进行第3节 (Ata-seq)。
3. Ata-seq
请注意:在这一步中, 从激活的 CD4+ T 细胞中分离出细胞核。该协议中使用的裂解缓冲液已得到改进, 在细胞核上温和, 从而获得更高效的消化和更高质量的结果。第3节的所有离心步骤都是用保持在4°c 的固定角离心机进行的。在开始协议之前冷却离心机。
- 执行原子核隔离。用冷裂解缓冲液 (10 mM Tris-HCl, pH 7.4, 10 mM nacl, 3 mM Mgcl2, 0.03% 聚山梨酸 20) 重新扫描珠子和细胞。在4°C 下, 以 500 x g立即离心10分钟。取下并丢弃上清液。
- 执行转座酶反应。用50μl 的 Tn5 转座酶混合悬浮分离的核子颗粒 (表 1)。在37°c 的温度下, 用40°c 的盖子在热循环器中培养 30分钟, 完成后保持在4°c。
- 热循环后, 立即执行快速台式离心机向下旋转, 并将管放在磁铁上 1分钟, 以去除产品中的珠子。
- 将透明的上清液从磁铁上的试管转移到 DNA 纯化柱。用250μl 的缓冲 PB 清洗一次色谱柱, 用750μl 的缓冲液 pe 清洗两次色谱柱。将样品在10Μl 洗脱缓冲液中进行洗脱。直接转到步骤3.5。
请注意:这一步放大了 DNA 片段与连接的适配器, 这里被称为 ATAC-seq 库。为了在一个 NGS 通道上多路运行多个 Ata-seq 库, 对所有示例使用未编制索引的 Primer 1, 对单个示例使用不同的索引 Primer 2 (表 2)。底漆的工作浓度为1.25 微米。 - 在无核酸 PCR 管中建立初始 PCR 扩增反应, 按照表3中规定的顺序和体积组合各组分.将 PCR 管放入热环器中, 并运行 PCR 扩增程序, 并具有表4中规定的循环条件。
-
用 qPCR 监测反应。在无核酸 PCR 管中建立 qPCR 反应, 按照表5中规定的顺序和数量将各组分组合在一起。按照表6中的规定放置在 qPCR 机器和循环中。
- 要确定剩余45Μl 反应的附加扩增周期的最佳数量, 请在 x 轴上创建一个具有循环数和 y 轴上相对荧光 (RFU) 的图。额外扩增周期的最佳数量是 qPCR 反应到达高原所需周期的三分之一。
注: 通过 qPCR 监测反应, 可以确定最佳的 PCR 周期数, 以获得最佳的库片段扩增, 同时最大限度地减少 GC 含量和大小偏差。
- 要确定剩余45Μl 反应的附加扩增周期的最佳数量, 请在 x 轴上创建一个具有循环数和 y 轴上相对荧光 (RFU) 的图。额外扩增周期的最佳数量是 qPCR 反应到达高原所需周期的三分之一。
- 完成剩余 45Μl PCR 反应的最终 PCR 扩增。将 PCR 管与3.5 步返回的扩增反应放在热循环器中, 并运行如表 7所示的程序。
请注意:对于按照本协议所述处理的样品, PCR 扩增周期的最佳总数被确定为12个。 - 扩增完成后, 按照制造商的协议使用 PCR 清理工具包对库进行净化, 并在25Μl 的洗脱缓冲液中洗脱。
请注意:放大的库可以在4°c 下存储长达 48小时, 也可以在-20°c 下冷冻, 以便长期储存。
4. Ata-seq 图书馆质量分析
请注意:在下一代测序之前, 验证 Ata-seq 库的质量和数量是非常重要的。应使用商业上可获得的资料袋评估图书馆的质量和数量 (见材料表)。
- 使用基于微流体的平台评估 Ata-seq 库的质量和数量, 以便对 DNA 进行施胶、定量和质量控制。有关具有代表性的质量评估结果, 请参见图 2 。
请注意:要获得质量测序结果, Ata-seq 文库的浓度必须为 gt;1 ngμμl。平均在25μl 中得到 30 nM。
5. 测序和数据分析
请注意:此分析管道允许用户控制读取映射过程的质量, 调整实验设计的坐标, 并调用峰值进行下游分析。以下是命令行和执行说明。数据分析包可在 (https://github.com/s18692001/bulk_ATAC_seq) 找到。
- 将下一代音序器上准备好的库按每个样本的平均读取深度4200万次排序。
- 通过使用以下命令检查 FastQC12软件包生成的文件来估计排序读取的质量:
< 输出目录 > < fastq _ file > - 根据 "快速质量控制"质量检查的确定, 使用命令 (对于配对结束), 根据需要, 由三叉戟13软件修剪读取的基础:
java-jar < 路径 > PE & lt;input1> & lt;input2> < 一对 output1& gt; < 未配对的 output1& gt; < 未配对的 output2& gt; HHEADCROP: < 作物基础 < - 由 Bowtie2 14 软件将读取与人类参考基因组 (hg38)对齐:
bowtie2-x < 参考基因组 >-1 < 输入对 1& gt; < 输入对 2& gt;-s < 输出 SAM 文件 >
请注意:参数-x 用于参考基因组索引的基础名称,-s 用于 SAM 格式输出。 - 使用 Samtools15标志器包检查映射读取的质量:
BAM 文件 < 的采样器标志 > - 使用 Picard16工具对映射的读取文件进行排序并删除重复项:
java-jar picard. jar SORTSAM INPUT = < 输入 SAM 文件名 > OUTPUT = < 输出排序的 BAM 文件名 > SORT _ ORDER = 坐标 "和" java-jar picard. jar MARK重复项输入 = < 排序的 BAM 文件 > output = < 输出 BAM 文件, 没有重复 >删除 _ DUPLATES = TRUE - 索引 BAM 文件, 修剪未使用的染色体读取和转移坐标的实验原因 ATAC-seq17:
java-jar PICARD. jar 点缀 = < BAM 文件 >
< 输入 BAM 文件 >切割-f 1grep-v chrYgrep-v chrMgrep-v chrunxargs samtools 查看-b < 输入 BAM 文件 > > < 输出修剪的 BAM 文件 >
床工具被 bobed-i < 输入修剪 BAM 文件 > > < 输出修剪 BED 文件 >
哭 ' 开始 {OFS = ""};{如果 (6 = "+") 打印 $1, $2 + 4, $3 + 4, $5, $5, $6; 否则打印 $1, 2-5, $3-5, $5, $5, $5, $6, < 输入修剪转移 BED 文件 > - 删除转换为负协调的读取:
如果 ($2 > 0) 打印 $1 ", 000" "$\ t" $3 "" $\ t "$3" $4 "" $5 "" $5 "" 6 "}" < 输入 bed > < 输出非负协调 BED 文件 >。 - 将 BED 文件转换为 BAM 文件, 以便进行以下漫反射绑定 18分析:
床工具床-i < 输入 BED >-g ≪ 参考基因组 > < 输出 BAM 文件 > - 通过 DiffBind18软件包执行峰值调用:
macs2 调用峰-t < 输入 BAM 文件 >-f bam-g hs-omomodel----------------------------------------------------------------------------------------------------------------使/的说: "我的名字说:" 到了什么 >----的产出的输出值 <-b-----------------------------------------------
请注意:过滤后, 预计每个样本的中值为3700万次读取。线粒体 DNA 污染从 0.30-5.39 不等 (平均 1.96)。将有一个较低的多映射读取率 (6.7%-56%, 19%, 平均 19%) 和相对较高的百分比可用核读取 (60%-92%, 79% 的平均)。
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Representative Results
从15毫升的新鲜全血, 该协议产生平均 100万个 CD4 + T 细胞。这些可以冻结以后处理或立即使用。CD4+ T 细胞的活力, 新鲜或解冻, 持续 & gt;95。这种 CD4+ T 细胞分离方法允许在源材料和收集时间方面具有灵活性。这种改进的 Ata-seq 协议生成了一个大于 1 ngμl 的最终库, 用于测序。使用市售系统进行的质量控制应显示200至 1, 000 bp 之间的 DNA 片段 (图 2)。只能使用高质量的库执行排序。
所有库的测序深度均超过每个样本的 4 000万。虽然常用的 Ata-seq 协议已受到污染测序读取从线粒体 DNA 可以从 50%-60% 的总测序读取1 这一改进的协议消除了问题的挑战。按照该协议准备的库平均只包含3% 的线粒体读取 (图 3 a)。在生物复制中, 可用读取的高百分比是足够稳定的 (图 3b)。该协议能够在技术复制 (图 4a, b) 以及生物复制 (图 4A, d) 中提供高度可重现的结果。此外, 所提出的 CD4 + T 细胞激活协议需要 48小时, 而不是一周或更多次, 并产生一致和有效的激活, 可重现的测序结果证明了这一点 (图 4a, b)。预测的 Ata-seq 峰值由分析管道准确调用 (图 4e)。测序结果分析发现, 在人 T 细胞活化过程中, 染色质状态发生了明显变化。在激活48小时前后, 在6个样品之间确定了不同的开放染色质可接触区域 (图 5)。
图 1: 改进的 ATAC-seq 协议的实验概述.(a) 样品采集和处理, 从15毫升的患者全血通过 Cd4+ t 细胞分离, 电镀和激活 t 细胞, 并与改进的裂解缓冲液核分离。(b) 转座酶反应和 pcr 扩增测序库。(c) 质量分析、测序和数据分析。请点击这里查看此图的较大版本.
图 2: 基于微流体的 dna 施胶、定量和质量控制平台上的具有代表性的高质量 Ata-seq 库.(a) 样品 b1 和 d1 的电子凝胶图像, 带在200至 1, 000个碱基对之间。(b 和 c)样品 B1 (b) 和 d1 (c) 的电泳跟踪结果, 峰值在200和 1, 000个碱基对之间。请点击这里查看此图的较大版本.
图 3: 改进的 Ata-seq 协议减少了线粒体 dna 污染, 从而增加了可用的 DNA 测序读取.(a) 比较文献中 cd4+ t 细胞 Atc-seq 的可用读数 (紫色)、重复读取 (绿色) 和线粒体读数 (红色)。(b) 比较多个健康个体的 cd4 + t 细胞 Atc-seq 分析的可用读数 (紫色)、重复读取 (绿色)、线粒体读取 (红色) 和未映射读取 (蓝色) (n = 22)。这一数字已从 Cheng 等人10 人中修改。请点击这里查看此图的较大版本.
图 4: 改进了 ATAC-seq 协议的重现性和准确性.用于两个未受刺激 (a; 36 486 吨) 或激活峰 (b; 52, 154 154 Thstim 峰) t细胞的两个复制实验的染色质可获得性的散点图 (atc-seq 信号、x 和 y 轴) 显示出技术重现性.从个体 IGTB1191 (y 轴) 和 IGTB1191 (x 轴) (c) 激活 t 细胞的染色质可及性, 以及 52, 154 Thstim 峰 (d) 每对个体之间相关性的直方图, 显示重现性个人之间。(e) 在 Q13.12 号染色体上, 我们改进了 ata-seq 协议称为 Ata-seq 峰。这一数字已从 Cheng 等人10 人中修改。请点击这里查看此图的较大版本.
图 5: CD4+ t 细胞活化后染色质状态变化的代表性 Atc-seq 结果.(a) 实验概述 (左) 和命名法 (右)。(b) 在原代 cd4 + t 细胞 (顶部、th)之前和之后 (底部, th stim) 48小时激活的六个样本 (行) 中的开放染色质 (列) 的差异可访问区域。这一数字已从 Cheng 等人10 人中修改。请点击这里查看此图的较大版本.
| 2个 TD 缓冲区 | 25μl |
| TN5 酶 | 5μl |
| 无核酸酶水 | 20μl |
| 总成交量 | 50μl |
表 1:步骤3.2 转相酶反应成分.
| Ad1_noMX: AATGATAGCGCCCAGTACCACTCGGGGCGCAGCAGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGG |
| Ad2.1_TAAGGCGA |
| Ad2.2_CGTACTAG |
| Ad2.3_AGGCAGAA |
| Ad2.4_TCCTGAGC |
| Ad2.5_GGACTCCT |
| Ad2.6_TAGGCATG |
| Ad2.7_CTCTCTAC |
| Ad2.8_CAGAGAGG |
| Ad2.9_GCTACGCT |
| Ad2.10_CGAGGCTG |
| Ad2.11_AAGAGGCA |
| Ad2.12_GTAGAGGA |
| Ad2.13_GTCGTGAT |
| Ad2.14_ACCACTGT |
| Ad2.15_TGGATCTG |
| Ad2.16_CCGTTTGT |
| Ad2.17_TGCTGGGT |
| Ad2.18_GAGGGGTT |
| Ad2.19_AGGTTGGG |
| Ad2.20_GTGTGGTG |
| Ad2.21_TGGGTTTC |
| Ad2.22_TGGTCACA |
| Ad2.23_TTGACCCT |
| Ad2.24_CCACTCCT |
表 2:用于 pcr 的 Ata-seq 寡核苷酸设计。
| 无核酸酶水 | 11.9μl |
| 100μm 自定义 Nextera 底漆 1 (表 2) | 0.6μl |
| 接下来高保真 2x PCR 主混合 | 25μl |
| ATAC-Seq 图书馆 | 10μl |
| 25μm 自定义 Nextera 底漆 2 (表 2) | 2.5μl |
| 总成交量 | 50μl |
表 3:步骤3.5 初始 PCR 反应混合物.
| 循环步骤 | 温度 | 时间 | 周期 |
| 扩展 | 72°c | 5分钟 | 1 |
| 初始变性 | 98°c | 30秒 | 1 |
| 变性 | 98°c | 10秒 | 10 |
| 退火 | 63°c | 30秒 | |
| 扩展 | 72°c | 1分钟 | |
| 按住 | 4°c | 无限 | 1 |
表 4:3.5 步初始 PCR 扩增循环程序.
| PCR 反应剂 | 5μl |
| 表3中的 PCR 鸡尾酒, 具有 0.6 x Syber Green | 10μl |
表 5:步骤 3.6 qPCR 反应混合.
| 循环步骤 | 温度 | 时间 | 周期 |
| 初始变性 | 98°c | 30秒 | 1 |
| 变性 | 98°c | 10秒 | 20 |
| 退火 | 63°c | 30秒 | |
| 扩展 | 72°c | 1分钟 | |
| 按住 | 4°c | 无限 | 1 |
表 6:第3.6 步 qPCR 循环计划.
| 循环步骤 | 温度 | 时间 | 周期 |
| 初始变性 | 98°c | 30秒 | 1 |
| 变性 | 98°c | 10秒 | 已确定 |
| 退火 | 63°c | 30秒 | |
| 扩展 | 72°c | 1分钟 | |
| 按住 | 4°c | 无限 | 1 |
表 7:步骤 3.7 PCR 循环程序, 用于最终 PCR 扩增.
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Discussion
本文介绍的改进的 ATAC-seq 协议提供了可重复的结果, 线粒体 DNA 污染最小。该方案已被用来成功地表征人类原代 Pbmc10、人单核细胞、小鼠树突状细胞 (未发表) 和培养的黑色素瘤细胞系 11的染色质结构。我们预计, 这种改善的裂解条件也有可能适用于其他细胞类型。预计该核分离协议将与单个核 Ata-seq 协议兼容, 最大限度地减少线粒体 DNA 污染, 以改进测序结果。
此修改后的协议的另一个好处是能够根据患者样本的可用性, 在不同时间冻结来自 Pbmc 的成批分离 CD4+ T 细胞。由于 Ata-seq 可以同时在所有样品上进行, 转相酶反应和测序中的潜在批次效应偏置最小化了 10。至关重要的是, 每次使用都要使冷冻介质变得新鲜, 以保持这种冻融协议所实现的高生存能力。分离的 CD4 + T 细胞的活力应保持在90% 以上, 以避免转座酶反应1中的非特异性消化。
请注意, 为了将此协议与可变单元格类型和数量一起使用, 可能需要进一步优化。由于本协议中 Tn5 转座子与核子的比率已针对 500, 000个核子进行了优化, 因此, 如果使用不同数量的核执行 Atc-seq, 则应相应调整 Tn5 转相酶的量。由于 Tn5 过量而导致的细胞核过度裂解可能会导致封闭染色质的高背景和测序库的低复杂性, 而下裂解可能无法提供完整的 PCR 扩增库1。为了避免这些并发症, 建议进行仔细的核计数, 并根据需要优化 Tn5 比。为了进一步提高数据质量, 建议通过 qPCR 监测优化 PCR 扩增周期。如果最终的库经历了太多的扩增周期, 则在排序数据2中可能会引入偏差。建议在下一代测序之前对 Atc-seq 库进行适当的质量控制, 以节省时间和金钱。
正如我们所证明的, 改良裂解缓冲液是减少线粒体 DNA 污染的关键, 并在广泛的细胞类型有效。其他协议解决了线粒体污染的问题与替代裂解缓冲液7,19或通过 crispr 介导的线粒体 dna 耗尽20的密集过程.我们的替代 ATAC-seq 协议有助于减少线粒体 DNA 污染的测序读取与改进的裂解缓冲液和保护 ATAC-seq 的简单性, 使其成为这样一个可访问的技术。与 RNA-seq 和单细胞测序一起, Ata-seq 是探索表观遗传调控的有力工具。这种改进的 Atc-seq 协议和数据分析包将有助于降低测序成本并产生更高质量的结果。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
我们感谢 Atsede Siba 的技术支持。c. s. c. 得到国家卫生研究院拨款1R6DA047032 的支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1x PBS, Sterile | Gibco | 10010023 | Can use other comparable products. |
| 5810/5810 R Swing Bucket Refrigerated Centrifuge with 50 mL, 15 mL, and 1.5 mL Tube Buckets | Eppendorf | 22625501 | Can use other comparable products. |
| 96 Well Round Bottom Plate | Thermo Scientific | 163320 | Can use other comparable products. |
| Agilent 4200 Tape Station System | Agilent | G2991AA | Suggested for quality assessment. |
| Cryotubes | Thermo Scientific | 374081 | Can use other comparable products. |
| DMSO | Sigma | D8418 | Can use other comparable products. |
| Dynabeads Human T-Activator CD3/CD28 | Invitrogen Life Technologies | 11131D | Critical Component |
| Dynabeads Untouched Human CD4 T Cells Kit | Invitrogen Life Technologies | 11346D | Critical Component |
| Dynamagnet | Invitrogen Life Technologies | 12321D | Critical Component |
| FCS | Gemini Bio Products | 100-500 | Can use other comparable products. |
| High Sensitivity DNA Kit | Agilent | 50674626 | Suggested for quality assessment. |
| Magnesium Chloride, Hexahydrate, Molecular Biology Grade | Sigma | M2393 | Can use other comparable products. |
| MinElute PCR Purification Kit (Buffer PB, Buffer PE, Elution Buffer) | Qiagen | 28004 | Critical Component |
| Mr. Frosty | Thermo Scientific | 5100-0001 | Can use other comparable products. |
| NaCl, Molecular Biology Grade | Sigma | S3014 | Can use other comparable products. |
| NEBNext High Fidelity 2x PCR Master Mix | New England BioLabs | M0541 | Critical Component |
| Nextera DNA Library Preparation Kit (2x TD Buffer, Tn5 Enzyme) | Illumina | FC1211030 | Critical Component |
| Nuclease Free Sterile dH20 | Gibco | 10977015 | Can use other comparable products. |
| Polysorbate 20 (Tween20) | Sigma | P9416 | Can use other comparable products. |
| PowerUp SYBR Green Master Mix | Applied Biosystems | A25780 | Critical Component |
| Precision Water Bath | Thermo Scientific | TSGP02 | Can use other comparable products. |
| QIAquick PCR Purification Kit | Qiagen | 28104 | Critical Component |
| Qubit dsDNA HS Assay Kit | Invitrogen Life Technologies | Q32851 | Suggested for quality assessment. |
| Qubit FlouroMeter | Invitrogen Life Technologies | Q33226 | Suggested for quality assessment. |
| Rosette Sep Human CD4+ Density Medium | Stem Cell Technologies | 15705 | Critical Component |
| Rosette Sep Human CD4+ Enrichment Cocktail | Stem Cell Technologies | 15022 | Critical Component |
| RPMI-1640 | Gibco | 11875093 | Can use other comparable products. |
| Sterile Resevoir | Thermo Scientific | 8096-11 | Can use other comparable products. |
| T100 Thermocycler with Heated Lid | BioRad | 1861096 | Can use other comparable products. |
| Tris-HCL | Sigma | T5941 | Can use other comparable products. |
References
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