Summary
Здесь мы представляем протокол для выполнения assay для виртуализации (ATAC-seq) активированный человека лимфоцитов CD4 + Транспозаза доступные хроматина. Протокол был изменен для сведения к минимуму загрязнения митохондриальной ДНК читает от 50% до 3% путем введения нового буфера lysis.
Abstract
ATAC-seq стал широко используется методология в изучении эпигенетики из-за его быстрый и простой подход к картирования генома всей доступной хроматина. В этой статье мы представляем улучшение ATAC-seq протокол, который уменьшает загрязнение митохондриальной ДНК читает. В то время как предыдущие протоколы ATAC-seq боролись с читает в среднем на 50%, загрязняя митохондриальной ДНК, оптимизированный литического буфера, представил в настоящем Протоколе уменьшает загрязнение митохондриальной ДНК в среднем 3%. Это улучшение ATAC-seq протокол обеспечивает около 50% сокращение стоимости последовательности. Мы демонстрируем, как эти библиотеки ATAC-seq высокого качества могут быть получены из активированных CD4 + лимфоцитов, шаг за шагом инструкции от CD4 + лимфоцитов изоляции из цельной крови путем анализа данных. Этот улучшенный протокол ATAC-seq протестирована в широком диапазоне типов клеток и будет немедленно воспользоваться исследователи, изучая хроматина доступности.
Introduction
Assay для Транспозаза доступные хроматина виртуализации (ATAC-seq) быстро стал ведущим методом для допроса хроматина архитектуры. ATAC-seq можно определить регионы доступны хроматина через процесс tagmentation, фрагментации и пометки ДНК же ферментом, производить библиотеки, с которыми последовательности можно определить доступность хроматина через весь геном. Этот процесс tagmentation при посредничестве гиперактивный Tn5 Транспозаза, который режет только открытые регионы хроматина из-за nucleosomic их пространственной помех. Как она режет, Tn5 Транспозаза также вставляет последовательность адаптеры, которые позволяют для быстрого библиотека строительство методом ПЦР и следующего поколения секвенирования генома всей доступной хроматина1,2.
ATAC-seq стала предпочтительным методом для определения регионов хроматина доступности из-за относительно простой и быстрый протокол, качество и спектр информации, которая может быть определена из его результаты и небольшое количество исходного материала требуется. По сравнению с DNase-seq3 (который также измеряет генома общесистемной хроматина доступность), MNase-seq4 (который определяет нуклеосома позиции в регионах открытых генома), и формальдегида опосредованной Фэр seq5, ATAC-seq быстрее, дешевле и более воспроизводимые1. Это также более чувствительным, работа с исходного материала всего лишь 500 ядер, по сравнению с 50 миллионов ядра, необходимые для DNase-seq3. ATAC-seq также имеет возможность предоставить дополнительные сведения об архитектуре хроматина чем другие методы, включая регионы привязки фактор транскрипции, нуклеосома позиционирования и открытые хроматина регионах1. Эффективный, одноклеточных ATAC-seq протоколы были подтверждены, предоставляя информацию о архитектуры хроматина в одной ячейки уровня6,7.
ATAC-seq используется для характеристики хроматина архитектуры через широкий спектр исследований и клетки типов, включая растения8,9людей и многих других организмов. Это также сыграло важную роль в идентификации эпигеномные регулирование болезни государств7. Однако наиболее широко используемый протокол ATAC-seq включает основным недостатком загрязнения гласит последовательности митохондриальной ДНК. В некоторых наборов данных этот уровень загрязнения может быть выше, чем 60% секвенирования результаты1. В поле, чтобы уменьшить эти загрязняющие митохондриальной читает для обеспечения более эффективного применения ATAC-seq7,10,11есть согласованные усилия. Здесь мы представляем улучшение ATAC-seq протокол, который снижает уровень загрязнения митохондриальной ДНК всего 3%, позволяя сокращение около 50% в последовательности по цене10. Это стало возможным путем упрощения процесса CD4 + лимфоцитов изоляции и активации и улучшение литического буфера, которая имеет решающее значение для сведения к минимуму загрязнения митохондриальной ДНК.
Этот протокол modifiedATAC-seq протестирована с широкий спектр первичных элементов, включая первичный периферической крови человека мононуклеарных клеток (получения)10, человека первичной моноцитов и дендритные клетки мыши (Неизданное). Он также успешно используется допросить линии клетки меланомы в кластеризованный экране регулярно interspaced короткие палиндром повторяется (ТРИФОСФАТЫ)-кодирования элементы11. Кроме того пакет анализа данных указанных в настоящем Протоколе и на GitHub предоставляет новым и опытным исследователей с инструментами для анализа данных ATAC-seq. ATAC-seq является наиболее эффективным методом для сопоставления хроматина доступность через весь геном, и изменения в существующий протокол, которые будут введены здесь позволит исследователям для производства высококачественных данных с низкой митохондриальной ДНК загрязнения, снижение издержек виртуализации и повышение ATAC-seq пропускную способность.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Эта улучшенная протокол предоставляет пошаговые инструкции для выполнения ATAC-seq CD4 + лимфоцитов, от исходного материала цельной крови через анализ данных (рис. 1).
1. изоляция CD4 + Т-клеток из цельной крови
Примечание: Исходным материалом для этого протокола — 15 мл свежей цельной крови, собранных с помощью стандартных процедур, позволяя источник исходного материала должен выбираться на основе требований к исследованиям. Масштаб протокол, при необходимости. Предварительно теплой-фосфатный буфер (PBS) + сыворотка (FCS) 2% плода теленка до комнатной температуры (RT) и отрегулируйте центрифуги для RT перед началом процедуры обогащения клеток CD4 + T.
- 750 мкл человека CD4 + Т-клеток обогащения коктейль по 15 мл цельной крови в 50 мл Конические трубки и осторожно перемешать путем инверсии. Инкубируйте на RT на 20 мин. При завершении инкубации, добавляют 15 мл PBS + 2% FCS к трубе и осторожно перемешать путем инверсии.
- Подготовьте свежие 50 мл Конические трубки с 15 мл плотности среды. Тщательно слой разбавленной крови на вершину средней плотности, будучи уверенным, чтобы не нарушить плотность среднего артериального интерфейс, который формирует. Центрифуги для 20 минут 1200 x g и RT с ускорением, равным 1 и нисходящая тормозная OFF.
Примечание: Важно, чтобы задать ускорение 1 и нисходящие тормозные OFF на центрифуге, чтобы избежать нарушения слоя клеток в средней плотности. - Соберите обогащенного CD4 + Т-клеток от плотности среднего/плазмы интерфейса с помощью пипетки передачи узкие стволовых. Передавать собранные клетки свежие 50 мл Конические трубки. Центрифуга собранных CD4 + Т-клеток для 8 мин в 423 x g и RT.
Примечание: Убедитесь в том, что возвращение центрифуги ускорение в 9 и нисходящей тормоз в ON для шага 1.3 и все из следующих действий. - Отбросить супернатант и помыть лепешка клетки дважды с 50 мл PBS + 2% FCS, центрифугирование 8 мин в 423 x g и RT. Discard окончательный супернатант мыть и приостановить Пелле мыть ячейки в 2 мл PBS + 2% FCS.
- Подсчет количества ячеек с помощью Горяева. Чтобы продолжить ATAC-seq, переходите к шагу 2.3. Чтобы заморозить клетки для последующей обработки, перейдите к пункт 1.6.
- Добавьте 1 mL свежих замораживания среды (FCS 90% + 10% диметилсульфоксида) за 1 миллион клеток. Аликвота 1 мл клеток в замораживания среды в криогенных безопасных трубок. Место труб на-80 ° C ночь в контейнере медленного замораживания. Следующий день, передачи трубки для жидкого азота для длительного хранения.
Примечание: 1 миллион клеток CD4 + T будут изолированы на 2 мл первоначального объема цельной крови. Заморозить 500000 клеток в 1 мл аликвоты замораживания среды. Сделайте свежий замораживания среды при каждом использовании.
2. активировать и очистить CD4 + Т-клеток
Примечание: Этот быстрый протокол для активации и очистки CD4 + Т-клеток только требует 48 h и результаты в 95% жизнеспособным, активированный CD4 + Т-клеток. Прохладный центрифуге до 4 ° C перед началом протокол.
- Размораживание 1 флакон (500 000) CD4 + Т-клеток в ванну воды 37 ° C, до тех пор, пока просто растаял лед. Аккуратно перенести 15 мл Конические трубки, содержащих 9 мл подогретым СМИ Розуэлл парк Мемориальный институт-1640 (RPMI 1640), дополнены 10% FCS, именуемый в дальнейшем полный RPMI клетки.
Примечание: Не позволяйте клетки таять полностью избежать воздействия ДМСО. - Центрифуги для 6 мин на 1500 x g и 4 ° C. Отменить супернатант и осторожно приостановить гранулы в 2 мл полной RPMI. Повторите спин вниз, удалить супернатант и осторожно приостановить клетки в 0,5 мл полной RPMI.
- Подсчет количества ячеек с помощью Горяева. Регулировка плотности суспензии клеток с полным RPMI для пластины 50 000 ячеек в 200 мкл на хорошо раунд 96-луночных нижней плиты.
Примечание: Из одной замороженные трубы 500K CD4 + Т-клеток, лунках 10 50000 CD4 + Т-клеток в 200 мкл в колодец. -
Подготовьте магнитные бусы, конъюгированных с человеческих антител анти CD3 и анти CD28 T-активатор.
- Аликвота 12,5 мкл человека T-активатор CD3/CD28 бусы на сэмпл ATAC-seq для 1.5 мл. Вымойте бусины с 1 мл раствора 1 x PBS и поместить трубку на магнит за 1 мин.
- Тщательно удалить отменить ясно супернатанта, извлеките трубку от магнита и приостановить бисер в 13 мкл завершить RPMI на ATAC-seq сэмпл.
Примечание: Вычислить количество бисера необходимые основанные на количество выборок ATAC-seq, обрабатывается. Этот протокол требует 12,5 мкл CD3/CD28 бусы на 500000 клеток, которая представляет собой один ATAC-seq образца.
- Активируйте CD4 + Т-клеток. Сбор 500 000 клеток в 2.1 мл полного среднего RPMI в 15 мл Конические трубки и 12,5 мкл предварительно выстиранные человека T-активатор бусины. Смешайте нежно инвертирование трубки.
- Осторожно передать стерильные водохранилище и плита 200 мкл клеток с бисером в хорошо раунд 96-луночных днище с помощью многоканальных дозаторов клетки с бисером. Проинкубируйте 48 ч при 37 ° C, 5% CO2 инкубатора.
- После инкубации, центрифуга 96-луночных пластина для 8 мин в 423 x g и RT. удалить 100 мкл среды на колодец из 96-луночных пластины, собирая его коническая труба прежде чем выбросить для обеспечения без потери шарик. Ресуспензируйте Пелле ячейки в остальные 100 мкл и собирать все в 1,5 мл.
Примечание: 10 скважин активированные Т-клеток будут собраны в томе 1 мл. - Выполните CD4 + изоляции. Добавьте 50 мкл предварительно выстиранные CD4 конъюгированных бусины 500000 клеток в 1 мл полной RPMI. Объединить бусы и клетки, пипетки. Проинкубируйте втечение 20 мин при температуре 4 ° C в холодильнике. Агитируйте бусы и ячейку смесь каждые 6 минут.
Примечание: Этот протокол должен использоваться для одного образца 500000 клеток. Внести необходимые коррективы для двух или более образцов 500 000. - При завершении инкубации, место трубки на магните для 2 мин снимите и выбросьте супернатанта, когда ясно. Вымойте шарик прыгните клетки путем удаления трубки из магнита, приостановив шарик прыгните клеток в 1 мл PBS + 2% FCS, замена трубки на магните за 1 мин и отбрасывая ясно супернатант. Повторите этот процесс для в общей сложности 3 стирок.
Примечание: Будьте осторожны, чтобы не отказаться от любой бисер во время мойки. - После окончательного вымыть поместить трубку на магните для 1 мин удалить и удалить супернатант и место гранулы на льду. Перейдите к разделу 3 (ATAC-seq).
3. ATAC-seq
Примечание: В этом шаге ядер изолированы от активированных клеток CD4 + T для ATAC-seq. Буфер lysis, используемые в настоящем протоколе была улучшена быть мягче на ядрах, что приводит к более эффективным пищеварение и более качественных результатов. Выполняются все действия центрифугирования в разделе 3 с фиксированным углом центрифуги, поддерживается на 4 ° C. Прохладный центрифуги перед началом протокол.
- Выполняйте ядер изоляции. Ресуспензируйте бусы и клетки с холодной литического буфера (10 мм трис-HCl, рН 7,4, 10 мм NaCl, 3 MgCl2, полисорбат 20 0,03%). Центрифуга сразу на 500 x g 10 мин при 4 ° C. Снимите и выбросьте супернатант.
- Выполните Транспозаза реакции. Приостановить действие отдельных ядер лепешка с 50 мкл Tn5 Транспозаза смеси (Таблица 1). Инкубируйте в Термоциклер на 30 минут при 37 ° C 40 ° C крышкой, держа на 4 ° C при полной.
- После thermocycling немедленно выполнить быстрый настольная центрифуга спин вниз и поместить трубку на магните за 1 мин для удаления бусы из продукта.
- Передавать четкое супернатант из трубки на магните столбец очистки ДНК. Промойте колонку с 250 мкл буфера PB и дважды с 750 мкл буфера PE. Элюировать образца в 10 мкл буфера. Перейти непосредственно к шагу 3.5.
Примечание: Этот шаг усиливает фрагментов ДНК с перевязаны адаптеров, здесь называют ATAC-seq библиотеки. Чтобы Мультиплекс нескольких библиотек ATAC-seq для запуска на одном NGS Лейн, используйте неиндексированные грунтовка 1 для всех образцов и различные индексированные 2 праймера для отдельных образцов (Таблица 2). Праймеры используются в рабочей концентрации 1,25 мкм. - Настройка первоначального реакции амплификации PCR в свободной от нуклеиназы ПЦР-пробирку, объединяя компоненты в порядке и объеме, указанных в Таблица 3. Уложите Термоциклер ПЦР-пробирку и запустите программу амплификации PCR с велосипедного условия, указанные в таблице 4.
-
Отслеживать реакция, ПЦР. Настройка реакции ПЦР в свободной от нуклеиназы ПЦР-пробирку, объединяя компоненты в порядке и сумме, указанной в таблице 5. Место в машину ПЦР и цикл как указано в таблице 6.
- Чтобы определить, что оптимальное количество дополнительного усиления циклов для остальных 45 мкл реакции, создайте участок с номером цикла на оси x и относительной флуоресцирования (РФС) на оси y. Оптимальное количество дополнительного усиления циклов — одну треть количество циклов, которые он принимает для реакции ПЦР для достижения плато.
Примечание: Мониторинг реакции ПЦР позволяет для определения оптимального числа циклов PCR, требуемой для получения оптимального библиотека фрагмент амплификации при сведении к минимуму GC содержание и размер смещения.
- Чтобы определить, что оптимальное количество дополнительного усиления циклов для остальных 45 мкл реакции, создайте участок с номером цикла на оси x и относительной флуоресцирования (РФС) на оси y. Оптимальное количество дополнительного усиления циклов — одну треть количество циклов, которые он принимает для реакции ПЦР для достижения плато.
- Завершите окончательный амплификации PCR оставшиеся 45 мкл реакции PCR. Место ПЦР-пробирку с усиление реакции от шаг 3.5 обратно в Термоциклер и запустить программу, как описано в таблице 7.
Примечание: Для образцов, обрабатываются как описано в настоящем Протоколе оптимальное общее количество циклов амплификации PCR преисполнена решимости быть 12. - После завершения амплификации очищайте библиотеки, используя набор для очистки ПЦР после производителя протокол, элюирующие в 25 мкл буфера.
Примечание: Усиленные библиотек можно хранить при 4 ° C до 48 ч или замороженные при температуре-20 ° C для длительного хранения.
4. ATAC-seq библиотека анализ качества
Примечание: Важно проверить качество и количество библиотек ATAC-seq до следующего поколения последовательности. Качество и количество библиотек должны оцениваться с использованием коммерчески доступные наборы (см. Таблицу материалы).
- Оценить качество и количество библиотек ATAC-seq, используя микрофлюидика-платформа для калибровки, количественной оценки и контроля качества ДНК. Смотрите Рисунок 2 представителя качества оценки результатов.
Примечание: Концентрация ATAC-seq библиотек должна быть > 1 нг/мкл для получения качественных результатов секвенирования. На среднем, 30 Нм в 25 мкл был получен.
5. последовательность и анализ данных
Примечание: Этот анализ конвейер позволяет пользователям контролировать качество чтения карт процедуры, изменить координаты для экспериментального дизайна и призываем пиков течению анализа. Ниже приведены команды линии и объяснение исполнения. Пакет анализа данных доступен в (https://github.com/s18692001/bulk_ATAC_seq).
- Последовательность подготовленный библиотек на следующего поколения секвенсор для чтения средняя глубина 42 миллиона чтений на сэмпл.
- Оцените качество чтения последовательности, проверяя файлы, созданные FastQC12 программного пакета с помощью команды:
fastqc -o < каталог с выходными данными >< fastq_file > - Трим основы читает Trimmomatic13 программного обеспечения, при необходимости, как определено FastQC проверки качества, используя команду (для пары закончился):
Java-jar < путь к trimmomatic jar-файл > PE < input1 >< input2 >< парных output1 >< непарных output1 >< паре вып.2 >< непарных вып.2 > HEADCROP: < культур баз > - Выровняйте читает генома человека ссылки (hg38), Bowtie214 программного обеспечения:
bowtie2 - x < ссылка геном > -1 < входной пары 1 >< входного пара 2 > -S < выходной SAM файл >
Примечание: Аргумент - x для базовое имя индекса для ведения генома, и -S для вывода формата Сэм. - Проверите thequality, сопоставленных с помощью пакета flagstat Samtools15 гласит:
SAMtools flagstat < BAM файл > - Сортировать сопоставленных читает файл и удалить дубликаты, с помощью инструмента16 Picard:
Java-jar picard.jar SortSam ввода = < имя входного файла SAM > вывода = < имя файла вывода отсортированы BAM > SORT_ORDER = координат» и «java-jar picard.jar MarkDuplicates ввода = < отсортированных BAM файл > вывода = < BAM выходной файл без дубликатов > REMOVE_DUPLICATES = TRUE - Файл индекса BAM, обрезать неиспользуемые хромосома читает и сдвиг координаты для экспериментальной причине ATAC-seq17:
Java-jar picard.jar BuildBamIndex ввода = < BAM файл >
SAMtools idxstats < Input BAM файл > | вырезать -f 1 | grep - v chrY | grep - v ЦПЧМ | grep - v chrUn | xargs samtools посмотреть -b < Input BAM файл >>< вывод обрезается BAM файл >
bedtools bamtobed -i < Input подстриженные BAM файл >>< вывод обрезается кровать файл >
awk ' начать {OFS = «\t»}; {Если ($6 == «+») печать $1, $2 + 4, $3 + 4, $4, $5, $6; напечатать еще $1, $2-5, 3-5 $, $4, $5, $6}' < Input подстриженные кровать файл >< Trimmed смещается кровать файл > - Удаление чтений, которые сдвигаются, чтобы негативные координации:
awk «{если ($2 > 0) напечатать «\t» $2 «\t» $3 «\t» $4 «\t» $5 $1 «\t» $6}» < Input кровать файл >< файл кровать координации non отрицательного вывода >. - Преобразуйте файл кровати BAM файл для следующих DiffBind18 анализа:
bedtools bedtobam -i < Input кровать файл > -g < ссылкой генома >< BAM выходной файл > - Выполнить вызов пик DiffBind18 программного пакета:
macs2 callpeak -t < Input BAM файл > -f BAM -g hs - nomodel--nolambda--держать dup все--вызов саммиты--outdir < путь к каталогу выходных > - n < имя > -B - q 0,01--БДГ--сдвиг -100--extsize 200
Примечание: После фильтрации, ожидать, что медиана 37 миллионов чтений на сэмпл. Митохондриальная ДНК загрязнение будет варьироваться от 0,30% – 5,39% (1,96% в среднем). Там будет низкий уровень умножить сопоставленных гласит (6,7% – 56%, 19% в среднем), и относительно высокий процент использования ядерных читает (60% – 92%, 79% в среднем).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
От 15 мл свежей цельной крови этот протокол генерирует в среднем 1 миллион клеток CD4 + T. Эти могут быть заморожены для последующей обработки или использовать немедленно. Жизнеспособность клеток CD4 + T, свежие или талой, был последовательно > 95%. Этот метод изоляции клеток CD4 + T позволяет гибкость в время исходного материала и коллекции. Эта улучшенная протокол ATAC-seq производит окончательный библиотека превышает 1 нг/мкл для виртуализации. Контроль качества, с использованием коммерчески доступных систем должны продемонстрировать фрагменты ДНК между 200 и 1000 bp (рис. 2). Последовательности должны выполняться только с высоким качеством библиотек.
Все библиотеки были упорядочены для средняя глубина более чем 40 миллионов, читать на сэмпл. Хотя часто используемые протоколы ATAC-seq было оспорено загрязнять читает последовательности митохондриальной ДНК, которая может варьироваться от 50-60% от общей последовательности чтения1 это улучшенная протокол устраняет вопроса. Библиотеки подготовлен после этого протокола содержат в среднем лишь 3% митохондриальной читает (рис. 3A). Достаточно высокий процент использования читает постоянна через биологические реплицирует (рис. 3B). Протокол был в состоянии обеспечить высокую воспроизводимость результатов через технические реплицирует (рис. 4A, B) а также биологические реплицирует (рис. 4 c, D). Кроме того протокол для CD4 + Т-клеток активации представил занимает 48 h вместо одной недели или более и приводит к активации последовательной и эффективной, как свидетельствуют результаты воспроизводимые последовательности (Рисунок 4A, B). Точно предсказал ATAC-seq вершины вызываются анализа трубопровода (Рисунок 4E). Анализ результатов секвенирования определены четкие изменения в состоянии chromatin во время активации клеток человека Т. Дифференциально доступные регионы открытых хроматина были выявлены между шести образцах до и после 48 часов активации (рис. 5).
Рисунок 1: экспериментальный обзор измененного Протокола ATAC-seq. (A) выборки приобретение и переработка, от 15 мл пациента цельной крови через CD4 + T клеточной изоляции, обшивка и активация Т-клеток и изоляции ядер с улучшение литического буфера. (B) Транспозаза реакции и амплификации PCR последовательности библиотеки. (C) анализ качества, последовательности и анализа данных. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2: представитель высокого качества ATAC-seq библиотеки от микрофлюидика-платформа для калибровки, количественной оценки и контроля качества ДНК. (A) электронные гель изображения образцов B1 и D1 с полосы между 200 и 1000 пар оснований. (B и C) Electropherogram результат трассировки образцов B1 (B) и D1 (C), с пиками между 200 и 1000 пар оснований. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 3: снижение митохондриальной ДНК загрязнения с результатами улучшения ATAC-seq протокол к увеличению использования читает секвенирования ДНК. Сравнение (A) использовать читает (фиолетовый), дублировать читает (зеленый) и митохондриальной читает (красный) от CD4 + T мобильных ATAC-seq профилирования в литературе. (B) Сравнение использования читает (фиолетовый), дублировать читает (зеленый), митохондриальных читает (красный) и несопоставленные читает (синий) CD4 + T мобильных ATAC-seq профилирования из нескольких здоровых лиц (n = 22). Эта цифра была изменена Cheng et al.10. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 4: Улучшена точность и повторяемость протокол ATAC-seq. Разброс участки хроматина доступности (ATAC-seq сигнал, x и y) для двух повторить эксперименты кератоз (A; 36,486 й вершины) или активирована (B; 52,154 Thstim пики) Т-клетки демонстрирует технической воспроизводимости. Хроматин доступность для активированных Т-клеток от лица IGTB1191 (ось y) и IGTB1190 (ось x) (C) и гистограммы корреляции между каждой пары лиц для вершины 52,154 Thstim (D) демонстрирует воспроизводимость между людьми. (E) ATAC-seq пики, называется с нашей улучшение ATAC-seq протокола на хромосоме 19 Q13.12. Эта цифра была изменена Cheng et al.10. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 5: представитель ATAC-seq результаты изменений в состояние хроматина после активации CD4 + Т-клеток. (A) экспериментальный обзор (слева) и номенклатура (справа). (B) дифференциально доступные регионы открытых хроматина (столбцы) в шести образцах (строк) до (вверху, Th) и после (внизу, йstim) 48 h активация первичного CD4 + Т-клеток. Эта цифра была изменена Cheng et al.10. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
| 2 x TD буфера | 25 МКЛ |
| TN5 фермента | 5 МКЛ |
| Нуклеаза свободной воды | 20 МКЛ |
| Общий объем | 50 МКЛ |
Таблица 1: 3.2 шаг Транспозаза реакции компонентов.
| Ad1_noMX: AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCGTCGGCAGCGTCAGATGTG |
| Ad2.1_TAAGGCGA CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTCGCCTTAGTCTCGTGGGCTCGGAGATGT |
| Ad2.2_CGTACTAG CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCTAGTACGGTCTCGTGGGCTCGGAGATGT |
| Ad2.3_AGGCAGAA CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTTCTGCCTGTCTCGTGGGCTCGGAGATGT |
| Ad2.4_TCCTGAGC CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGCTCAGGAGTCTCGTGGGCTCGGAGATGT |
| Ad2.5_GGACTCCT CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATAGGAGTCCGTCTCGTGGGCTCGGAGATGT |
| Ad2.6_TAGGCATG CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCATGCCTAGTCTCGTGGGCTCGGAGATGT |
| Ad2.7_CTCTCTAC CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGTAGAGAGGTCTCGTGGGCTCGGAGATGT |
| Ad2.8_CAGAGAGG CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCCTCTCTGGTCTCGTGGGCTCGGAGATGT |
| Ad2.9_GCTACGCT CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATAGCGTAGCGTCTCGTGGGCTCGGAGATGT |
| Ad2.10_CGAGGCTG CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCAGCCTCGGTCTCGTGGGCTCGGAGATGT |
| Ad2.11_AAGAGGCA CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTGCCTCTTGTCTCGTGGGCTCGGAGATGT |
| Ad2.12_GTAGAGGA CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTCCTCTACGTCTCGTGGGCTCGGAGATGT |
| Ad2.13_GTCGTGAT CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATATCACGACGTCTCGTGGGCTCGGAGATGT |
| Ad2.14_ACCACTGT CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATACAGTGGTGTCTCGTGGGCTCGGAGATGT |
| Ad2.15_TGGATCTG CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCAGATCCAGTCTCGTGGGCTCGGAGATGT |
| Ad2.16_CCGTTTGT CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATACAAACGGGTCTCGTGGGCTCGGAGATGT |
| Ad2.17_TGCTGGGT CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATACCCAGCAGTCTCGTGGGCTCGGAGATGT |
| Ad2.18_GAGGGGTT CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATAACCCCTCGTCTCGTGGGCTCGGAGATGT |
| Ad2.19_AGGTTGGG CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCCCAACCTGTCTCGTGGGCTCGGAGATGT |
| Ad2.20_GTGTGGTG CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCACCACACGTCTCGTGGGCTCGGAGATGT |
| Ad2.21_TGGGTTTC CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGAAACCCAGTCTCGTGGGCTCGGAGATGT |
| Ad2.22_TGGTCACA CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTGTGACCAGTCTCGTGGGCTCGGAGATGT |
| Ad2.23_TTGACCCT CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATAGGGTCAAGTCTCGTGGGCTCGGAGATGT |
| Ad2.24_CCACTCCT CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATAGGAGTGGGTCTCGTGGGCTCGGAGATGT |
Таблица 2: Конструкции oligos ATAC-seq используются для ПЦР.
| Нуклеаза свободной воды | 11.9 МКЛ |
| Пользовательские Nextera грунт 100 мкм 1 (таблица 2) | 0,6 МКЛ |
| NEBNext высокой четкости 2 x ПЦР Мастер микс | 25 МКЛ |
| ATAC-Seq Библиотека | 10 МКЛ |
| Грунтовка пользовательских Nextera 25 µM 2 (таблица 2) | 2.5 МКЛ |
| Общий объем | 50 МКЛ |
Таблица 3: Шаг 3.5 первоначальный микс реакции PCR.
| ШАГ ЦИКЛА | ТЕМПЕРАТУРА | ВРЕМЯ | ЦИКЛЫ |
| Расширение | 72 ° C | 5 мин | 1 |
| Первоначальный денатурации | 98 ° C | 30 s | 1 |
| Денатурация | 98 ° C | 10 s | 10 |
| Отжиг | 63 ° C | 30 s | |
| Расширение | 72 ° C | 1 мин | |
| Удерживайте | 4 ° C | Бесконечность | 1 |
Таблица 4: Шаг 3.5 начальной PCR амплификация Велоспорт программы.
| Алиготе реакции PCR | 5 МКЛ |
| ПЦР коктейль из таблицы 3 с 0.6 x Syber зеленый | 10 МКЛ |
Таблица 5: Смесь реакции ПЦР шаг 3.6.
| ШАГ ЦИКЛА | ТЕМПЕРАТУРА | ВРЕМЯ | ЦИКЛЫ |
| Первоначальный денатурации | 98 ° C | 30 s | 1 |
| Денатурация | 98 ° C | 10 s | 20 |
| Отжиг | 63 ° C | 30 s | |
| Расширение | 72 ° C | 1 мин | |
| Удерживайте | 4 ° C | Бесконечность | 1 |
Таблица 6: Шаг 3.6 программа для ПЦР.
| ШАГ ЦИКЛА | ТЕМПЕРАТУРА | ВРЕМЯ | ЦИКЛЫ |
| Первоначальный денатурации | 98 ° C | 30 s | 1 |
| Денатурация | 98 ° C | 10 s | Как определено |
| Отжиг | 63 ° C | 30 s | |
| Расширение | 72 ° C | 1 мин | |
| Удерживайте | 4 ° C | Бесконечность | 1 |
Таблица 7: Шаг 3.7 ПЦР программа для окончательного амплификации PCR.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Измененный Протокол ATAC-seq, представленные в этой статье обеспечивает воспроизводимость результатов с минимальными митохондриальной ДНК загрязнения. Протокол была использована для успешно характеризуют хроматина архитектура человека первичного получения10, человека моноцитов, дендритные клетки мыши (Неизданное), и культивировали меланома клеток линии11. Мы ожидаем, что это улучшение лизис условие имеет потенциал, чтобы работать для других типов клеток, а также. Предполагается также, что этот Протокол изоляции ядер будет совместима с одного ядра ATAC-seq протоколы, минимизации митохондриальной ДНК загрязнения для улучшения последовательности результатов.
Дополнительным преимуществом этого измененного Протокола является возможность заморозить партий изолированных клеток CD4 + T от получения в разное время в зависимости от наличия пациентов образцов. Как ATAC-seq затем могут выполняться одновременно на всех образцах, потенциальные пакетного эффект смещения в Транспозаза реакции и последовательности является минимизация10. Важно, что замораживание среднего сделаны свежие с каждым использованием, для поддержания высокой жизнеспособности, которая достигается с настоящим Протоколом замораживания оттаивания. Жизнеспособность изолированных клеток CD4 + T должен оставаться выше 90% чтобы избежать неспецифических пищеварение в реакции Транспозаза1.
Обратите внимание, что дальнейшая оптимизация может потребоваться для того, чтобы использовать этот протокол с переменной ячейкой типов и количества. Поскольку коэффициент Транспозаза ядер Tn5 был оптимизирован для 500 000 ядер в настоящем Протоколе, если выполнение ATAC-seq с различным числом ядер, количество Tn5 Транспозаза должны корректироваться соответствующим образом. Чрезмерная лизис ядер из-за избытка Tn5 может привести к высоким фона от закрытых хроматина и низкой сложности виртуализации библиотек, в то время как заместитель лизис не могут обеспечить полной ПЦР усиливается библиотеки1. Чтобы избежать этих осложнений, рекомендуется выполнять тщательный подсчет ядер и оптимизировать соотношение Tn5 при необходимости. Для дальнейшего повышения качества данных, рекомендуется оптимизировать циклы амплификации PCR ПЦР мониторинга. Если окончательный библиотека подвергается слишком много циклов амплификации, могут существовать предвзятости в последовательности данных2. Рекомендуется для выполнения надлежащего контроля качества ATAC-seq библиотек до следующего поколения последовательности для того, чтобы сэкономить время и деньги.
Как мы показали, изменение литического буфера является ключом к сокращению загрязнения митохондриальной ДНК и эффективна на широкий спектр типов клеток. Другие протоколы этот вопрос митохондриальной загрязнения с альтернативными лизис буферы7,19 или интенсивного процесса ТРИФОСФАТЫ опосредованной митохондриальной ДНК истощения20. Наши альтернативный протокол ATAC-seq способствует усилиям, направленным на уменьшение митохондриальной ДНК загрязнения гласит последовательности с улучшение литического буфера и сохранению простоты ATAC-seq, что делает его доступным методом. Вместе с РНК seq и секвенирование одной ячейки ATAC-seq является мощным инструментом для изучения эпигеномные регулирования. Это улучшило ATAC-seq протокол и пакет анализа данных поможет снизить стоимость секвенирования и производить более качественных результатов.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не имеют ничего сообщать.
Acknowledgments
Мы благодарим Атседе Siba для технической поддержки. ЦСК поддерживается 1R61DA047032 гранта NIH.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1x PBS, Sterile | Gibco | 10010023 | Can use other comparable products. |
| 5810/5810 R Swing Bucket Refrigerated Centrifuge with 50 mL, 15 mL, and 1.5 mL Tube Buckets | Eppendorf | 22625501 | Can use other comparable products. |
| 96 Well Round Bottom Plate | Thermo Scientific | 163320 | Can use other comparable products. |
| Agilent 4200 Tape Station System | Agilent | G2991AA | Suggested for quality assessment. |
| Cryotubes | Thermo Scientific | 374081 | Can use other comparable products. |
| DMSO | Sigma | D8418 | Can use other comparable products. |
| Dynabeads Human T-Activator CD3/CD28 | Invitrogen Life Technologies | 11131D | Critical Component |
| Dynabeads Untouched Human CD4 T Cells Kit | Invitrogen Life Technologies | 11346D | Critical Component |
| Dynamagnet | Invitrogen Life Technologies | 12321D | Critical Component |
| FCS | Gemini Bio Products | 100-500 | Can use other comparable products. |
| High Sensitivity DNA Kit | Agilent | 50674626 | Suggested for quality assessment. |
| Magnesium Chloride, Hexahydrate, Molecular Biology Grade | Sigma | M2393 | Can use other comparable products. |
| MinElute PCR Purification Kit (Buffer PB, Buffer PE, Elution Buffer) | Qiagen | 28004 | Critical Component |
| Mr. Frosty | Thermo Scientific | 5100-0001 | Can use other comparable products. |
| NaCl, Molecular Biology Grade | Sigma | S3014 | Can use other comparable products. |
| NEBNext High Fidelity 2x PCR Master Mix | New England BioLabs | M0541 | Critical Component |
| Nextera DNA Library Preparation Kit (2x TD Buffer, Tn5 Enzyme) | Illumina | FC1211030 | Critical Component |
| Nuclease Free Sterile dH20 | Gibco | 10977015 | Can use other comparable products. |
| Polysorbate 20 (Tween20) | Sigma | P9416 | Can use other comparable products. |
| PowerUp SYBR Green Master Mix | Applied Biosystems | A25780 | Critical Component |
| Precision Water Bath | Thermo Scientific | TSGP02 | Can use other comparable products. |
| QIAquick PCR Purification Kit | Qiagen | 28104 | Critical Component |
| Qubit dsDNA HS Assay Kit | Invitrogen Life Technologies | Q32851 | Suggested for quality assessment. |
| Qubit FlouroMeter | Invitrogen Life Technologies | Q33226 | Suggested for quality assessment. |
| Rosette Sep Human CD4+ Density Medium | Stem Cell Technologies | 15705 | Critical Component |
| Rosette Sep Human CD4+ Enrichment Cocktail | Stem Cell Technologies | 15022 | Critical Component |
| RPMI-1640 | Gibco | 11875093 | Can use other comparable products. |
| Sterile Resevoir | Thermo Scientific | 8096-11 | Can use other comparable products. |
| T100 Thermocycler with Heated Lid | BioRad | 1861096 | Can use other comparable products. |
| Tris-HCL | Sigma | T5941 | Can use other comparable products. |
References
- Buenrostro, J. D., Giresi, P. G., Zaba, L. C., Chang, H. Y., Greenleaf, W. J. Transposition of native chromatin for fast and sensitive epigenomic profiling of open chromatin, DNA-binding proteins and nucleosome position. Nature Methods. 10 (12), 1213-1218 (2013).
- Buenrostro, J. D., Wu, B., Chang, H. Y., Greenleaf, W. J. ATAC-seq: A Method for Assaying Chromatin Accessibility Genome-Wide. Current Protocols in Molecular Biology. 21, 1-29 (2015).
- Song, L., Crawford, G. E. DNase-seq: a high-resolution technique for mapping active gene regulatory elements across the genome from mammalian cells. Cold Spring Harbor Protocols. (2), (2010).
- Pajoro, A., Muiño, J. M., Angenent, G. C., Kaufmann, K. Profiling Nucleosome Occupancy by MNase-seq: Experimental Protocol and Computational Analysis. Methods in Molecular Biology. 1675, 167-181 (2018).
- Giresi, P. G., Kim, J., McDaniell, R. M., Iyer, V. R., Lieb, J. D. FAIRE (Formaldehyde-Assisted Isolation of Regulatory Elements) isolates active regulatory elements from human chromatin. Genome Research. 17 (6), 877-885 (2007).
- Rosenberg, A. B., et al. Single-cell profiling of the developing mouse brain and spinal cord with split-pool barcoding. Science. 360 (6385), 176-182 (2018).
- Corces, M. R., et al. Lineage-specific and single-cell chromatin accessibility charts human hematopoiesis and leukemia evolution. Nature Genetics. 48 (10), 1193-1203 (2016).
- Lu, Z., Hofmeister, B. T., Vollmers, C., DuBois, R. M., Schmitz, R. J. Combining ATAC-seq with nuclei sorting for discovery of cis-regulatory regions in plant genomes. Nucleic Acids Research. 45 (6), e41 (2017).
- Lara-Astiaso, D., et al. Chromatin state dynamics during blood formation. Science. 345 (6199), 943-949 (2014).
- Gate, R. E., et al. Genetic determinants of co-accessible chromatin regions in activated T cells across humans. Nature Genetics. , (2018).
- Sanjana, N. E., et al. High-resolution interrogation of functional elements in the noncoding genome. Science. 353 (6307), 1545-1549 (2016).
- Andrews, S. FastQC A Quality Control tool for High Throughput Sequence Data. Babraham Bioinformatics. , Available from: https://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc (2018).
- Bolger, A. M., Lohse, M., Usadel, B. Trimmomatic: a flexible trimmer for Illumina sequence data. Bioinformatics. 30 (15), 2114-2120 (2014).
- Langmead, B., Salzberg, S. L. Fast gapped-read alignment with Bowtie 2. Nature Methods. 9 (4), 357-359 (2012).
- Li, H., et al. The Sequence Alignment/Map format and SAMtools. Bioinformatics. 25 (16), 2078-2079 (2009).
- Broad Institute. Picard Tools. , Available from: http://broadinstitute.github.io/picard/ (2018).
- Quinlan, A. R., Hall, I. M. BEDTools: a flexible suite of utilities for comparing genomic features. Bioinformatics. 26 (6), 841-842 (2010).
- Stark, R., Brown, G. DiffBind: Differential Binding Analysis of ChIP-Seq Peak Data. , Available from: http://bioconductor.org/packages/devel/bioc/vignettes/DiffBind/inst/doc/DiffBind.pdf (2018).
- Corces, M. R., et al. An improved ATAC-seq protocol reduces background and enables interrogation of frozen tissues. Nature Methods. 14 (10), 959-962 (2017).
- Wu, J., et al. The landscape of accessible chromatin in mammalian preimplantation embryos. Nature. 534 (7609), 652-657 (2016).
