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Genetics

ATAC-seq परख के साथ कम Mitochondrial डीएनए संदूषण प्राथमिक मानव सीडी 4 + टी लिम्फोसाइटों से

Published: March 22, 2019 doi: 10.3791/59120
Automatic Translation
1, 1,2, 1,3
1Department of Biology, Boston University, 2Department of Computer Science and Engineering, University of California San Diego, 3Bioinformatics Program, Boston University

Summary

यहां, हम एक प्रोटोकॉल मौजूद transposase के लिए एक परख करने के लिए-सुलभ क्रोमेटिन अनुक्रमण (atac-seq) पर सक्रिय सीडी 4 + मानव lymphocytes । प्रोटोकॉल को संशोधित किया गया है ताकि एक नए lysis बफर की शुरूआत के माध्यम से ५०% से 3% तक दूषित mitochondrial डीएनए को कम करने के लिए पढ़ता है ।

Abstract

ATAC-seq जीनोम-वाइड सुलभ chromatin मानचित्रण करने के लिए अपनी तेजी से और सरल दृष्टिकोण के कारण एपिजेनेटिक्स के अध्ययन में एक व्यापक रूप से इस्तेमाल किया पद्धति बन गया है । इस पत्र में हम एक बेहतर ATAC-seq प्रोटोकॉल मौजूद है कि contaminating mitochondrial डीएनए कम कर देता है पढ़ता है । जबकि पिछले ATAC-seq प्रोटोकॉल ५०% के एक औसत के साथ संघर्ष किया है mitochondrial डीएनए contaminating पढ़ता है, अनुकूलित lysis बफर इस प्रोटोकॉल में शुरू की 3% की एक औसत mitochondrial डीएनए संदूषण कम कर देता है । इस सुधार atac-seq प्रोटोकॉल अनुक्रमण लागत में एक के पास ५०% कमी के लिए अनुमति देता है । हम प्रदर्शन कैसे इन उच्च गुणवत्ता ATAC-seq पुस्तकालयों सक्रिय सीडी 4 + lymphocytes से तैयार किया जा सकता है, द्वारा कदम प्रदान कर सकते है सीडी 4 से कदम निर्देश + लिम्फोसाइट अलगाव डेटा विश्लेषण के माध्यम से पूरे रक्त से । इस सुधार atac-seq प्रोटोकॉल सेल प्रकार की एक विस्तृत श्रृंखला में मान्य किया गया है और क्रोमेटिन पहुँच का अध्ययन शोधकर्ताओं के लिए तत्काल उपयोग की जाएगी.

Introduction

transposase के लिए परख-सुलभ क्रोमेटिन अनुक्रमण (atac-seq) तेजी से क्रोमेटिन वास्तुकला पूछताछ के लिए अग्रणी तरीका बन गया है । atac-seq टैगमेंटेशन की प्रक्रिया के माध्यम से सुलभ क्रोमेटिन के क्षेत्रों की पहचान कर सकते हैं, एक ही एंजाइम द्वारा खंडित और डीएनए के टैगिंग, पुस्तकालयों जिसके साथ अनुक्रमण एक पूरे जीनोम भर में क्रोमेटिन पहुँच निर्धारित कर सकते हैं उत्पादन करने के लिए. इस टैगमेंटेशन प्रक्रिया अतिसक्रिय Tn5 transposase है, जो केवल nucleosomic त्रिविमी बाधा के कारण क्रोमेटिन के खुले क्षेत्रों में कटौती द्वारा मध्यस्थता की है । यह कटौती के रूप में, Tn5 transposase भी अनुक्रमण एडाप्टर है कि पीसीआर और अगली पीढ़ी के जीनोम-वाइड सुलभ क्रोमेटिन1,2के अनुक्रमण द्वारा तेजी से पुस्तकालय निर्माण के लिए अनुमति सम्मिलित करता है ।

atac-seq अपेक्षाकृत सरल और तेजी से प्रोटोकॉल, गुणवत्ता और सूचना है कि इसके परिणामों से निर्धारित किया जा सकता है की सीमा के कारण क्रोमेटिन पहुंच के क्षेत्रों का निर्धारण करने के लिए पसंदीदा विधि बन गया है, और आवश्यक सामग्री शुरू करने की छोटी राशि । dnase-seq3 की तुलना में (जो भी जीनोम चौड़ा क्रोमेटिन पहुंच उपाय), mnase-seq4 (जो खुले जीनोम क्षेत्रों में nucleosome पदों को निर्धारित करता है), और formaldehyde-mediated faire-seq5, atac-seq तेज है, सस्ता, और अधिक reproducible1। यह भी अधिक संवेदनशील है, के रूप में ५०० नाभिक के रूप में कुछ की शुरुआत सामग्री के साथ काम कर रहे, DNase-seq3के लिए आवश्यक ५०,०००,००० नाभिक की तुलना में । atac-seq भी अन्य विधियों से क्रोमेटिन वास्तुकला के बारे में अधिक जानकारी प्रदान करने की क्षमता है, प्रतिलेखन कारक बंधन के क्षेत्रों सहित, nucleosome स्थिति, और ओपन क्रोमेटिन क्षेत्रों1. प्रभावी, एकल सेल atac-seq प्रोटोकॉल, एकल कोशिका स्तर6,7पर क्रोमेटिन वास्तुकला के बारे में जानकारी प्रदान मान्य किया गया है ।

atac-seq अनुसंधान और कोशिकाओं के प्रकार के एक व्यापक स्पेक्ट्रम भर में क्रोमेटिन वास्तुकला की विशेषता के लिए इस्तेमाल किया गया है, पौधों सहित8, मनुष्य9, और कई अन्य जीवों. यह भी रोग राज्यों के पश् चजात विनियमन की पहचान करने में महत्वपूर्ण है7। हालांकि, सबसे व्यापक रूप से इस्तेमाल atac-seq प्रोटोकॉल में शामिल है संदूषण अनुक्रमण के प्रमुख दोष mitochondrial डीएनए से पढ़ता है । कुछ डेटा सेट में, यह संदूषण स्तर अनुक्रमण परिणाम1के ६०% के रूप में उच्च हो सकता है । इस क्षेत्र में एक ठोस प्रयास करने के लिए इन contaminating माइटोकोड्रियल को कम करने के लिए atac-seq7,10,11के अधिक कुशल आवेदन के लिए अनुमति देने के लिए पढ़ता है । यहां हम एक बेहतर ATAC-seq प्रोटोकॉल है कि सिर्फ 3% के लिए mitochondrial डीएनए संदूषण दर कम कर देता है वर्तमान, अनुक्रमण लागत10में लगभग ५०% की कमी की अनुमति । यह सीडी 4 + लिम्फोसाइट अलगाव और सक्रियण और एक बेहतर lysis बफर कि mitochondrial डीएनए संदूषण को ंयूनतम करने में महत्वपूर्ण है की एक सुव्यवस्थित प्रक्रिया से संभव बनाया है ।

इस modifiedATAC-seq प्रोटोकॉल प्राथमिक कोशिकाओं की एक विस्तृत श्रृंखला के साथ मांय किया गया है, मानव प्राथमिक परिधीय रक्त मोनोन्यूक्लियर कोशिकाओं (PBMCs)10, मानव प्राथमिक monocytes सहित, और माउस डेन्रिटिक कोशिकाओं (अप्रकाशित). यह भी सफलतापूर्वक प्रयोग किया गया है एक संकुल में मेलेनोमा सेल लाइनों को नियमित रूप से interspaced लघु palindromic दोहराता (CRISPR) गैर की स्क्रीन-11तत्वों कोडिंग पूछताछ । इसके अतिरिक्त, इस प्रोटोकॉल में वर्णित डेटा विश्लेषण पैकेज और GitHub पर प्रदान की ATAC-seq डेटा का विश्लेषण करने के लिए उपकरणों के साथ नए और अनुभवी शोधकर्ताओं प्रदान करता है । atac-seq सबसे प्रभावी परख के लिए एक पूरे जीनोम भर में क्रोमेटिन पहुंच नक्शा है, और मौजूदा प्रोटोकॉल है कि यहां पेश कर रहे है संशोधनों के लिए उच्च गुणवत्ता वाले डेटा का उत्पादन करने की अनुमति होगी कम mitochondrial डीएनए संदूषण के साथ डाटा, अनुक्रमण लागत को कम करने और atac-seq थ्रैपुट में सुधार ।

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Protocol

यह बेहतर प्रोटोकॉल डेटा विश्लेषण (चित्रा 1) के माध्यम से पूरे रक्त की प्रारंभिक सामग्री से, सीडी 4 + lymphocytes के atac-seq प्रदर्शन के लिए कदम दर कदम निर्देश प्रदान करता है ।

1. पूरे रक्त से सीडी 4 + टी कोशिकाओं के अलगाव

नोट: इस प्रोटोकॉल के लिए शुरू सामग्री ताजा पूरे रक्त के 15 मिलीलीटर मानक प्रक्रियाओं का उपयोग कर एकत्र की, प्रारंभिक सामग्री के स्रोत अनुसंधान आवश्यकताओं के आधार पर चयन किया जा करने की अनुमति है । आवश्यकतानुसार प्रोटोकॉल स्केल । पूर्व गर्म फॉस्फेट buffered खारा (PBS) + 2% भ्रूण बछड़ा सीरम (FCS) कमरे के तापमान (आरटी) के लिए और सीडी 4 + T सेल संवर्धन प्रक्रिया शुरू करने से पहले आर टी के लिए सेंट्रीफ्यूज समायोजित करें ।

  1. मानव सीडी 4 + टी सेल संवर्धन कॉकटेल के ७५० μL जोड़ें एक ५० मिलीलीटर शंकु ट्यूब में पूरे रक्त की 15 मिलीलीटर और उलटा द्वारा धीरे मिश्रण । 20 मिनट के लिए आरटी पर इनसेबेट । जब ऊष्मायन पूरा हो जाता है, तो ट्यूब के लिए 2% FCS PBS के 15 मिलीलीटर जोड़ें और उलटा द्वारा धीरे मिश्रण ।
  2. घनत्व मध्यम के 15 मिलीलीटर के साथ एक ताजा ५० मिलीलीटर शंकु ट्यूब तैयार करें । ध्यान से घनत्व मध्यम के शीर्ष पर पतला रक्त नमूना परत, सुनिश्चित किया जा रहा है कि रूपों घनत्व मध्यम/ १,२०० x g पर 20 मिनट के लिए सेंट्रीफ्यूज और 1 के लिए सेट त्वरण के साथ आर टी और उतरते ब्रेक बंद.
    नोट: यह 1 के लिए त्वरण सेट और घनत्व मध्यम में कोशिका परत के विघटन से बचने के लिए सेंट्रीफ्यूज पर ब्रेक उतरते महत्वपूर्ण है ।
  3. एक संकीर्ण स्टेम हस्तांतरण पिपेट का उपयोग कर घनत्व मध्यम/प्लाज्मा इंटरफेस से समृद्ध सीडी 4 + टी कोशिकाओं को इकट्ठा । एकत्र कोशिकाओं को एक ताजा ५० मिलीलीटर शंकु ट्यूब पर स्थानांतरित करें । अपकेंद्रित्र ४२३ x g और RT पर 8 मिनट के लिए एकत्र सीडी 4 + टी कोशिकाओं ।
    नोट: सेंट्रीफ्यूज एक्सेलेरेशन के लिए 9 और अवरोही पर चरण १.३ और सभी निम्न चरणों के लिए ब्रेक करने के लिए वापस करने के लिए सुनिश्चित करें ।
  4. supernatant छोड़ें और सेल गोली दो बार पीबीएस के ५० मिलीलीटर के साथ धो + 2% fcs, 8 मिनट के लिए ४२३ एक्स जी और आरटी में अपकेंद्रण । अंतिम supernatant धोने छोड़ें और pbs के 2 मिलीलीटर में धो सेल गोली निलंबित + 2% fcs ।
  5. एक hemocytometer का उपयोग कर कोशिकाओं गिनती. ATAC-seq के साथ जारी रखने के लिए, चरण २.३ करने के लिए आगे बढ़ें । बाद में संसाधित करने के लिए कक्षों को फ़्रीज़ करने के लिए, चरण १.६ पर जाएं ।
  6. १,०००,००० कोशिकाओं पर 1 मिलीलीटर ताजा हिमांक मध्यम (९०% FCS + 10% डाइमेथिल सल्फोक्साइड) जोड़ें । क्रायोजेनिक सुरक्षित ट्यूबों में हिमांक मध्यम में कोशिकाओं के 1 मिलीलीटर Aliquot । प्लेस ट्यूबों-८० ° c एक धीमी गति से ठंड कंटेनर में रातोंरात । अगले दिन, लंबी अवधि के भंडारण के लिए तरल नाइट्रोजन के लिए ट्यूबों हस्तांतरण ।
    नोट: १,०००,००० सीडी 4 + टी कोशिकाओं को पूरे रक्त की मूल मात्रा के 2 मिलीलीटर प्रति अलग हो जाएगा । फ्रीज मध्यम के 1 मिलीलीटर aliquots में ५००,००० कोशिकाओं फ्रीज़ । हर प्रयोग में ताजे जमने वाला माध्यम बनाएं ।

2. को सक्रिय और शुद्ध सीडी 4 + टी कोशिकाओं

नोट: सक्रिय करने और 4/4 + टी कोशिकाओं को शुद्ध करने के लिए यह तेजी से प्रोटोकॉल केवल ४८ एच और ९५% व्यवहार्य में परिणाम की आवश्यकता है, सीडी 4 + टी कोशिकाओं को सक्रिय । प्रोटोकॉल शुरू करने से पहले 4 डिग्री सेल्सियस के लिए सेंट्रीफ्यूज शांत ।

  1. गल 1 शीशी (५००,०००) की सीडी 4 + टी कोशिकाओं में एक ३७ ° c पानी स्नान जब तक बर्फ सिर्फ पिघल गया है । धीरे से एक 15 मिलीलीटर शंकु पूर्व के 9 मिलीलीटर-गर्म Roswell पार्क मेमोरियल संस्थान-१६४० (RPMI-१६४०) मीडिया 10% FCS के साथ पूरक, इसके बाद पूरा RPMI के रूप में संदर्भित करने के लिए कोशिकाओं को स्थानांतरित ।
    नोट: DMSO के लिए जोखिम से बचने के लिए कोशिकाओं को पूरी तरह से गल न दें ।
  2. १५०० x g और 4 ° c पर 6 मिनट के लिए सेंट्रीफ्यूज । supernatant छोड़ें और धीरे पूरी RPMI के 2 मिलीलीटर में गोली निलंबित । स्पिन को दोहराएं, supernatant छोड़ें, और धीरे से पूर्ण RPMI के ०.५ मिलीलीटर में कोशिकाओं को निलंबित ।
  3. एक hemocytometer का उपयोग कर कोशिकाओं गिनती. पूरी तरह से RPMI के साथ सेल निलंबन के घनत्व को समायोजित करें २०० μL में थाली ५०,००० कोशिकाओं के लिए अच्छी तरह से एक ९६-well दौर नीचे थाली ।
    नोट: 500K की एक जमे हुए ट्यूब सीडी 4 + टी कोशिकाओं से, थाली 10 ५०,००० के कुओं २०० μL प्रति अच्छी तरह से सीडी + टी कोशिकाओं ।
  4. मानव टी उत्प्रेरक विरोधी-CD3 और विरोधी CD28 एंटीबॉडी के साथ संयुग्मित चुंबकीय मोती तैयार ।
    1. एक १.५ मिलीलीटर ट्यूब के लिए ATAC-seq नमूना प्रति मानव टी-उत्प्रेरक CD3/CD28 मोती के Aliquot १२.५ μL । 1x PBS के 1 मिलीलीटर के साथ मोती धोने और 1 मिनट के लिए एक चुंबक पर ट्यूब जगह है ।
    2. ध्यान से निकालें और स्पष्ट supernatant त्यागने, चुंबक से ट्यूब निकालें, और 13 μL में मोती ATAC-seq नमूना प्रति पूर्ण RPMI निलंबित ।
      नोट: ATAC-seq नमूनों की संसाधित किया जा रहा की संख्या के आधार पर आवश्यक मोती की मात्रा की गणना । इस प्रोटोकॉल की आवश्यकता है १२.५ μL CD3/CD28 मोती प्रति ५००,००० कोशिकाओं है, जो एक ATAC-seq नमूना का गठन किया ।
  5. सीडी 4 + टी कोशिकाओं को सक्रिय करें । एक 15 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब में पूर्ण RPMI मध्यम के २.१ मिलीलीटर में ५००,००० कोशिकाओं को इकट्ठा करने और पूर्व धोया मानव टी उत्प्रेरक मोती के १२.५ μL जोड़ें । ट्यूब को उलटा करके धीरे से मिलाएं ।
  6. धीरे से एक जलाशय और थाली के साथ कोशिकाओं के २०० μL दौर नीचे ९६ के प्रति अच्छी तरह से मोती के साथ कक्षों का स्थानांतरण-अच्छी थाली एक मल्टी चैनल पिपेट का उपयोग । एक ३७ डिग्री सेल्सियस में ४८ एच के लिए सेते, 5% सह2 इनयूबेटर ।
  7. पोस्ट ऊष्मायन, ९६ सेंट्रीफ्यूज अच्छी तरह से 8 मिनट के लिए थाली ४२३ एक्स जी और आरटी पर $९६ से अच्छी तरह से प्रति मध्यम से १०० μl निकालें-अच्छी तरह से थाली, यह एक शंकु ट्यूब को इकट्ठा करने के लिए कोई मनका नुकसान सुनिश्चित करने के लिए खारिज से पहले । शेष १०० μL में सेल गोली Resuspend और एक १.५ मिलीलीटर ट्यूब में सभी इकट्ठा ।
    नोट: सक्रिय टी कोशिकाओं के 10 कुओं एक 1 मिलीलीटर की मात्रा में एकत्र किया जाएगा ।
  8. सीडी 4 + अलगाव प्रदर्शन । जोड़ें ५० μL पूर्व के-धोया सीडी संयुग्मित मोती ५००,००० कोशिकाओं को पूरा RPMI के 1 मिलीलीटर में । पिपेट द्वारा मोती और कोशिकाओं का मिश्रण । फ्रिज में 4 डिग्री सेल्सियस पर 20 मिनट के लिए इनसेबेट । आंदोलन मोती और कोशिका मिश्रण हर 6 मिनट ।
    नोट: इस प्रोटोकॉल का उपयोग ५००,००० कक्षों के एक नमूने के लिए किया जाना है । ५००,००० के दो या अधिक नमूनों के लिए आवश्यकतानुसार समायोजित करें ।
  9. जब ऊष्मायन पूरा हो गया है, 2 मिनट के लिए चुंबक पर ट्यूब जगह. निकालें और supernatant जब स्पष्ट त्याग । चुंबक से ट्यूब को हटाकर मनका-बाउंड कोशिकाओं को धोएं, पीबीएस के 1 मिलीलीटर में मनका-बाउंड कक्षों को सस्पैंड करें + 2% FCS, 1 मिनट के लिए चुंबक पर ट्यूब की जगह, और स्पष्ट supernatant को खारिज । इस प्रक्रिया को 3 washes की कुल के लिए दोहराएं ।
    नोट: washes के दौरान किसी भी मोती त्यागने के लिए नहीं सावधान रहना ।
  10. अंतिम धोने के बाद, 1 मिनट के लिए चुंबक पर ट्यूब जगह. निकालें और supernatant त्यागने और बर्फ पर गोली जगह । धारा 3 (ATAC-seq) पर जाएं ।

3. ATAC-seq

नोट: इस चरण में, नाभिक एटैक-seq के लिए सक्रिय सीडी 4 + टी कोशिकाओं से अलग कर रहे हैं । इस प्रोटोकॉल में प्रयुक्त होने वाले lysis बफर को नाभिक पर gentler होने के लिए सुधारा गया है, जिसके परिणामस्वरूप अधिक कुशल पाचन और उच्च गुणवत्ता के परिणाम होते हैं । धारा 3 में सभी अपकेंद्रण कदम 4 डिग्री सेल्सियस पर बनाए रखा एक निश्चित कोण सेंट्रीफ्यूज के साथ प्रदर्शन कर रहे हैं । प्रोटोकॉल शुरुआत से पहले सेंट्रीफ्यूज शांत ।

  1. नाभिक अलगाव प्रदर्शन । Resuspend मोती और कोशिकाओं के साथ ठंड lysis बफर (10 मिमी Tris-HCl, पीएच ७.४, 10 मिमी NaCl, 3 मिमी MgCl2, ०.०३% polysorbate 20) । 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए ५०० x g पर तुरंत सेंट्रीफ्यूज । अधिनतांत निकालें और छोड़ें.
  2. transposase प्रतिक्रिया करते हैं । Tn5 transposase मिश्रण के ५० μL के साथ अलग नाभिक गोली निलंबित (तालिका 1). ३७ डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए एक thermocycler में सेते ४० ° c ढक्कन के साथ, जब पूरा 4 डिग्री सेल्सियस पर पकड़े ।
  3. thermocycling के बाद, तुरंत एक जल्दी बेंच ऊपर सेंट्रीफ्यूज स्पिन प्रदर्शन और 1 मिनट के लिए चुंबक पर ट्यूब जगह उत्पाद से मोती को दूर करने के लिए ।
  4. चुंबक पर ट्यूब से एक डीएनए शुद्धि स्तंभ के लिए स्पष्ट supernatant स्थानांतरण । बफर पीबी के २५० μL के साथ एक बार कॉलम धो और बफर पीई के ७५० μL के साथ दो बार । 10 μL का वेल्यूशन बफर में नमूना Elute. कदम ३.५ के लिए सीधे आगे बढ़ना ।
    नोट: इस कदम ligated adaptors के साथ डीएनए टुकड़े amplifies, यहां ATAC-seq पुस्तकालय के रूप में संदर्भित । आदेश में मल्टीप्लेक्स कई atac-seq पुस्तकालयों के लिए एक ngs लेन पर चलाने के लिए, सभी नमूनों के लिए unindexed प्राइमर 1 का उपयोग करें और व्यक्तिगत नमूनों के लिए एक अलग अनुक्रमित प्राइमर 2 (तालिका 2) । Primers १.२५ μM के काम सांद्रता में इस्तेमाल कर रहे हैं ।
  5. एक nuclease मुक्त पीसीआर ट्यूब में प्रारंभिक पीसीआर प्रवर्धन प्रतिक्रिया की स्थापना, क्रम और तालिका 3 में निर्दिष्ट मात्रा में घटकों के संयोजन । पीसीआर ट्यूब को थर्मासाइलर में रखें और टेबल 4में निर्दिष्ट सायक्लिंग स्थितियों के साथ पीसीआर प्रवर्धन प्रोग्राम चलाएं ।
  6. qPCR द्वारा प्रतिक्रिया की निगरानी । एक nuclease मुक्त पीसीआर ट्यूब में qPCR प्रतिक्रिया, आदेश और तालिका 5 में निर्दिष्ट राशि में घटकों के संयोजन की स्थापना की । qPCR मशीन और चक्र में प्लेस के रूप में तालिका 6 में निर्दिष्ट ।
    1. शेष ४५ μL प्रतिक्रिया के लिए अतिरिक्त प्रवर्धन चक्र की इष्टतम संख्या निर्धारित करने के लिए, x-अक्ष पर चक्र संख्या और y-अक्ष पर सापेक्ष प्रतिदीप्ति (RFU) के साथ एक प्लॉट बनाएं । अतिरिक्त प्रवर्धन चक्रों की इष्टतम संख्या एक-तिहाई चक्रों की संख्या होती है, जो पठार तक पहुँचने के लिए qPCR अभिक्रिया के लिए लेता है ।
      नोट: qPCR द्वारा प्रतिक्रिया की निगरानी करने के लिए इष्टतम पुस्तकालय टुकड़ा प्रवर्धन प्राप्त करने के लिए वांछित पीसीआर चक्र के इष्टतम संख्या के निर्धारण के लिए अनुमति देता है, जबकि GC सामग्री और आकार पूर्वाग्रह ंयूनतम ।
  7. पीसीआर अभिक्रिया के शेष ४५ μL का अंतिम पीसीआर प्रवर्धन पूरा करें । चरण ३.५ वापस thermocycler में प्रवर्धन प्रतिक्रिया के साथ पीसीआर ट्यूब प्लेस और कार्यक्रम चलाने के रूप में तालिका 7में वर्णित है ।
    नोट: इस प्रोटोकॉल में वर्णित नमूनों के लिए, पीसीआर प्रवर्धन चक्रों की इष्टतम कुल संख्या 12 होने के लिए निर्धारित की गई थी ।
  8. प्रवर्धन पूरा हो जाने के बाद, निर्माता के प्रोटोकॉल के बाद एक पीसीआर क्लीनअप किट का उपयोग कर पुस्तकालयों को शुद्ध, रेफरेंस बफर के 25 μL में eluting ।
    नोट: प्रवर्धित पुस्तकालयों लंबी अवधि के भंडारण के लिए-20 डिग्री सेल्सियस पर ४८ एच या जमे हुए के लिए 4 ° c पर संग्रहीत किया जा सकता है ।

4. ATAC-seq पुस्तकालय गुणवत्ता विश्लेषण

नोट: यह गुणवत्ता और ATAC-seq लायब्रेरी की मात्रा अगली पीढ़ी sequencing से पहले मांय करने के लिए महत्वपूर्ण है । पुस्तकालयों की गुणवत्ता और मात्रा का वाणिज्यिक रूप से उपलब्ध किट ( सामग्री की तालिकादेखें) का उपयोग कर मूल्यांकन किया जाना चाहिए ।

  1. आकार, मात्रा और डीएनए की गुणवत्ता नियंत्रण के लिए एक microfluidics आधारित मंच का उपयोग ATAC-seq पुस्तकालयों की गुणवत्ता और मात्रा का आकलन करें । प्रतिनिधि गुणवत्ता मूल्यांकन परिणामों के लिए चित्रा 2 देखें ।
    नोट: ATAC-seq लाइब्रेरीज़ की एकाग्रता > 1 ng/μL गुणवत्ता अनुक्रमण परिणाम प्राप्त करने के लिए होना चाहिए । औसत पर, 25 μL में 30 एनएम प्राप्त किया गया था ।

5. अनुक्रमण और डेटा विश्लेषण

नोट: इस विश्लेषण पाइपलाइन उपयोगकर्ताओं पढ़ता मानचित्रण प्रक्रिया की गुणवत्ता को नियंत्रित करने के लिए अनुमति देता है, प्रयोगात्मक डिजाइन के लिए निर्देशांक समायोजित, और डाउनस्ट्रीम विश्लेषण के लिए चोटियों को बुलाओ. निंन आदेश पंक्तियां और निष्पादन की व्याख्या कर रहे हैं । डेटा विश्लेषण पैकेज (https://github.com/s18692001/bulk_ATAC_seq) पर उपलब्ध है ।

  1. अनुक्रम एक अगली पीढ़ी sequencer पर तैयार पुस्तकालयों ४२,०००,००० के एक औसत पढ़ने की गहराई के लिए नमूना प्रति पढ़ता है ।
  2. आदेश का उपयोग कर fastqc12 सॉफ्टवेयर पैकेज द्वारा उत्पन्न फ़ाइलों की जाँच करके अनुक्रमण पढ़ता की गुणवत्ता का अनुमान:
    fastqc-हे < output_directory > < fastq_file >
  3. ट्रिम कर दीजिए की कुर्सियां Trimmomatic13 सॉफ्टवेयर द्वारा, यदि आवश्यक हो, के रूप में fastqc गुणवत्ता की जांच द्वारा निर्धारित, आदेश का उपयोग कर (जोड़ी के लिए समाप्त):
    trimmomatic जार फ़ाइल के लिए जावा-जार < पथ > PE < input1 > < input2 > < युग्मित output1 > < अयुग्मित output1 > < युग्मित output2 > < unpaired output2 > HEADCROP: < फसल कुर्सियां >
  4. मानव संदर्भ जीनोम (hg38) के लिए Bowtie214 सॉफ्टवेयर द्वारा पढ़ता संरेखित करें:
    bowtie2-x < संदर्भ जीनोम >-1 < इनपुट जोड़ी 1 > < इनपुट जोड़ी 2 >-S < आउटपुट SAM फ़ाइल >
    नोट: तर्क-x संदर्भ जीनोम के लिए अनुक्रमणिका के basename के लिए है, और-S SAM स्वरूप आउटपुट के लिए है ।
  5. की जांच करें मैप किए गए reads की गुणवत्ता Samtools15 flagstat पैकेज का उपयोग कर:
    samtools flagstat < BAM फाइल >
  6. मैप की गई reads फ़ाइल सॉर्ट करें और Picard16 उपकरण का उपयोग कर डुप्लिकेट निकालें:
    जावा-जार picard. jar SortSam इनपुट = < इनपुट सैम फ़ाइल नाम > आउटपुट < आउटपुट सॉर्ट BAM फ़ाइल नाम > SORT_ORDER = समंवय "और" जावा-जार picard. jar Markडुप्लिकेट्स इनपुट = < हल BAM फ़ाइल > आउटपुट = < आउटपुट BAM फ़ाइल के बिना डुप्लिकेट > REMOVE_DUPLICATES = TRUE
  7. Index BAM फ़ाइल, अप्रयुक्त गुणसूत्र पढ़ता ट्रिम कर दीजिए और ATAC-seq17के प्रयोगात्मक कारण के लिए निर्देशांक शिफ्ट:
    जावा-जार picard. jar BuildBamIndex इनपुट = < BAM फ़ाइल >
    samtools idxstats < इनपुट BAM फ़ाइल > । कट-च 1 | grep-v chrY | grep-v chrM | गरेप-वी चरुन | xargs समउपकरण दृश्य-b < इनपुट BAM फ़ाइल > > < आउटपुट छंटनी की BAM फ़ाइल >
    बेडटूल्स बाम्टोबेड-i < इनपुट छंटनी की गई BAM फाइल > > < आउटपुट छंटनी की गई BED फाइल >
    ' ऑक शुरू {ofs = "\t"}; {if ($६ = = "+") प्रिंट $१, $२ + 4, $३ + 4, $४, $५, $६; और प्रिंट $१, $२-5, $३-5, $४, $५, $६} ' < इनपुट छंटनी की गई BED फाइल > < छंटनी की गई BED फाइल >
  8. नकारात्मक समंवय करने के लिए खिसकाया है जो पढ़ता हटाएं:
    ऑक ' {यदि ($२ > 0) प्रिंट $१ "\t" $२ "\t" $३ "\t" $४ "\t" $५ "\t" $६} ' < इनपुट बिस्तर फ़ाइल > < आउटपुट गैर-ऋणात्मक समंवय bed फ़ाइल > ।
  9. बेड फाइल को निम्न DiffBind18 विश्लेषण के लिए BAM फाइल में कनवर्ट करें:
    बेडटूल्स bedtobam-मैं < इनपुट बिस्तर फ़ाइल >-जी < संदर्भ जीनोम > < आउटपुट BAM फ़ाइल >
  10. DiffBind18 सॉफ्टवेयर पैकेज द्वारा पीक कॉलिंग प्रदर्शन:
    macs2 कॉलपीक-t < इनपुट BAM फ़ाइल >-f BAM-g hs-nomodel--nolambda---रखें-dup सभी--कॉल-शिखर--outdir < आउटपुट निर्देशिका पथ >-n < आउटपुट नाम >-B-q ०.०१--bdg--shift-१००--extsize २००
    नोट: छानने के बाद, नमूना प्रति ३७,०००,००० reads की एक औसत की उंमीद है । Mitochondrial डीएनए संदूषण 0.30% से रेंज-5.39% (औसत पर १.९६%) होगा । वहां गुणा मैप की एक कम दर हो जाएगा पढ़ता (6.7% – 56%, 19% औसत पर) और प्रयोग करने योग्य परमाणु पढ़ता का एक अपेक्षाकृत उच्च प्रतिशत (60% – 92%, औसत पर ७९%).

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Representative Results

ताजा पूरे रक्त के 15 मिलीलीटर से, इस प्रोटोकॉल १,०००,००० सीडी 4 + टी कोशिकाओं के एक औसत उत्पंन करता है । ये बाद में प्रसंस्करण के लिए जमे हुए या तुरंत इस्तेमाल किया जा सकता है । सीडी 4 + टी कोशिकाओं, ताजा या गल की व्यवहार्यता लगातार 95% > गया था । सीडी 4 + टी सेल अलगाव की इस विधि स्रोत सामग्री और संग्रह समय में लचीलापन के लिए अनुमति देता है । यह सुधार ATAC-seq प्रोटोकॉल sequencing के लिए 1 ng/μL से अधिक की एक अंतिम लाइब्रेरी का उत्पादन करता है । गुणवत्ता नियंत्रण वाणिज्यिक रूप से उपलब्ध प्रणालियों का उपयोग किया प्रदर्शन २०० और १,००० बीपी के बीच डीएनए टुकड़े का प्रदर्शन करना चाहिए (चित्रा 2) । Sequencing केवल उच्च गुणवत्ता लायब्रेरीज़ के साथ किया जाना चाहिए ।

सभी पुस्तकालयों से अधिक की एक औसत गहराई के लिए sequenced थे ४०,०००,००० नमूना प्रति पढ़ें । जबकि आमतौर पर atac-seq प्रोटोकॉल का इस्तेमाल किया गया है mitochondrial डीएनए से है कि 50% से रेंज कर सकते है-६०%-कुल अनुक्रमण पढ़ता1 यह बेहतर प्रोटोकॉल की समस्या समाप्त से दूषित अनुक्रमण पढ़ता द्वारा चुनौती दी गई है । इस प्रोटोकॉल के बाद तैयार पुस्तकालयों औसत पर केवल 3% mitochondrial पढ़ता है (चित्रा 3A) । उपयोग योग्य पठन का उच्च प्रतिशत पर्याप्त रूप से निरंतर जैविक प्रतिकृति (चित्र 3b) में है । प्रोटोकॉल तकनीकी प्रतिकृति (चित्र 4a, B) के रूप में के रूप में अच्छी तरह से जैविक प्रतिकृति (चित्रा 4c, D) भर में अत्यधिक reproducible परिणाम प्रदान करने में सक्षम था । इसके अतिरिक्त, के लिए प्रोटोकॉल सीडी 4 + टी सेल सक्रियकरण प्रस्तुत के बजाय एक सप्ताह या अधिक और सुसंगत और कुशल सक्रियण में परिणाम ४८ h लेता है, के रूप में reproducible अनुक्रमण परिणाम द्वारा प्रदर्शित (चित्र 4a, बी) । ATAC-seq चोटियों की भविष्यवाणी की सटीक विश्लेषण पाइपलाइन (चित्रा 4E) द्वारा कहा जाता है । अनुक्रमण परिणामों के विश्लेषण मानव टी सेल सक्रियण के दौरान क्रोमेटिन राज्य में स्पष्ट परिवर्तन की पहचान की । खुले क्रोमेटिन के विभिन्न सुलभ क्षेत्रों से पहले और बाद में छह नमूनों के बीच की पहचान की गई ४८ ज सक्रियण (चित्रा 5).

Figure 1
चित्र 1: संशोधित ATAC-seq प्रोटोकॉल का प्रायोगिक ओवरव्यू । (क) नमूना अर्जन और प्रसंस्करण, रोगी साबुत रक्त की 15 मिलीलीटर से सीडी 4 + टी सेल आइसोलेशन, चढ़ाना और टी कोशिकाओं के सक्रियण, और उन्नत lysis बफर के साथ नाभिक अलगाव । (ख) ट्रांसपोसेज़ अभिक्रिया तथा अनुक्रमण पुस्तकालय का पीसीआर प्रवर्धन । (ग) गुणवत्ता विश्लेषण, अनुक्रमण और आंकड़ा विश्लेषण । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्रा 2: प्रतिनिधि उच्च गुणवत्ता ATAC-seq एक microfluidics आधारित मंच से आकार, परिमाणन और डीएनए के गुणवत्ता नियंत्रण के लिए प्लेटफॉर्म । (क) २०० और १,००० आधार युग्मों के बीच बैंडिंग के साथ नमूने B1 और D1 की इलैक्ट्रॉनिक जेल छवि । (ख और ग) इलेक्ट्रोफ्लोग्राम ट्रेस परिणाम B1 (B) और D1 (C), २०० और १,००० आधार जोड़े के बीच चोटियों के साथ । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्रा 3: सुधारित atac-seq प्रोटोकॉल के साथ mitochondrial डीएनए संदूषण कम उपयोगी डीएनए अनुक्रमण पढ़ता में वृद्धि में परिणाम है । (क) प्रयोग करने योग्य पुस्तकें (जामुनी), डुप्लीकेट पुस्तकें (हरा), और माइटोकोड्रियल पुस्तकें (लाल) से सीडी 4 + टी सेल atac-seq के साहित्य में रूपरेखा से तुलना । (ख) उपयोग योग्य पठन (जामुनी), डुप्लीकेट पुस्तकें (हरा), मित्रोंतक पुस्तकें (लाल), और बिना मैप किए reads (नीला) की सीडी 4 + T सेल atac-seq रूपरेखा से एकाधिक स्वस्थ व्यक्तियों (n = 22) । यह आंकड़ा चेंग एट अल.10से संशोधित किया गया है । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 4
चित्रा 4: सुधार ATAC-seq प्रोटोकॉल reproducibility और सटीकता । क्रोमेटिन पहुँच क्षमता (ATAC-seq सिग्नल, x और y-अक्ष) के तितर बितर भूखंडों के दो दोहराने प्रयोगों के लिए अउत्तेजित (A; ३६,४८६ वें चोटियों) या सक्रिय (B; ५२,१५४ Thstim चोटियों) टी कोशिकाओं तकनीकी पुनरुत्थानशीलता को दर्शाता है । व्यक्तियों से सक्रिय टी कोशिकाओं के लिए Chromatin पहुंच IGTB1191 (y-अक्ष) और IGTB1190 (x-अक्ष) (C) और ५२,१५४ Thstim चोटियों के लिए व्यक्तियों के हर जोड़े के बीच correlations के हिस्टोग्राम (घ) reproducibility दर्शाता है व्यक्तियों के बीच । (ङ) एटीएसी-सीक्यू पीक ने क्रोमोकुछ 19 अतारांकित 13.12 में हमारे उन्नत एटीएसी-सीईक्यू प्रोटोकाल के साथ बुलाया है । यह आंकड़ा चेंग एट अल.10से संशोधित किया गया है । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 5
चित्र 5:4 + T-सेल सक्रियण के बाद क्रोमेटिन राज्य में परिवर्तन के प्रतिनिधि atac-seq परिणाम । (क) प्रायोगिक सिंहावलोकन (बाएँ) और नामकरण (दाएँ). (ख) छह नमूनों (पंक्तियों) में खुले क्रोमेटिन (कॉलम) के पहले (ऊपर, गु) और उसके बाद (नीचे, गुstim) ४८ एच के प्राथमिक सीडी 4 + टी कोशिकाओं के क्रियांवयन के लिए सुलभ क्षेत्रों । यह आंकड़ा चेंग एट अल.10से संशोधित किया गया है । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

2x टीडी बफर 25 μL
TN5 Enzyme 5 μL
न्यूनालेस मुक् त जल 20 μL
कुल मात्रा ५० μL

तालिका 1: चरण ३.२ transposase प्रतिक्रिया घटक ।

Ad1_noMX: AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCGTCGGCAGCGTCAGATGTG
विज्ञापन 2.1 _ TAAGGCGA CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTCGCCTTAGTCTCGTGGGCTCGGAGATGT
विज्ञापन 2.2 _ CGTACTAG CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCTAGTACGGTCTCGTGGGCTCGGAGATGT
विज्ञापन 2.3 _ AGGCAGAA CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTTCTGCCTGTCTCGTGGGCTCGGAGATGT
विज्ञापन 2.4 _ TCCTGAGC CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGCTCAGGAGTCTCGTGGGCTCGGAGATGT
विज्ञापन 2.5 _ GGACTCCT CAAGCAGAGACGGCATACगगगतएगगैटCCGTCTCGTGGGCTCGGAGATGT
Ad 2.6 _ TAGGकैटग CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCATGCCTAGTCTCGTGGGCTCGGAGATGT
विज्ञापन 2.7 _ CTCTCTAC CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGTAGAGAGGTCTCGTGGGCTCGGAGATGT
विज्ञापन 2.8 _ CAGAGAGG CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCCTCTCTGGTCTCGTGGGCTCGGAGATGT
विज्ञापन 2.9 _ GCTACGCT CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATAGCGTAGCGTCTCGTGGGCTCGGAGATGT
विज्ञापन 2.10 _ CGAGGCTG CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCAGCCTCGGTCTCGTGGGCTCGGAGATGT
विज्ञापन 2.11 _ AAGAGGCA CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTGCCTCTTGTCTCGTGGGCTCGGAGATGT
विज्ञापन 2.12 _ GTAGAGGA CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTCCTCTACGTCTCGTGGGCTCGGAGATGT
Ad 2.13 _ GTCGTGAT CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATATCACGACGTCTCGTGGGCTCGGAGATGT
विज्ञापन 2.14 _ ACCACTGT CAAGCAGAGACGGCATACगगगाटचएगकटगकटककेजगतगतगगटटगटटगकटकटछदतगर
विज्ञापन 2.15 _ TGGATCTG CAAGCAGAGACGGCATACगगATCAGATCCGCTCGGAGATGT
विज्ञापन 2.16 _ CCGTTTGT CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATACAAACGGGTCTCGTGGGCTCGGAGATGT
विज्ञापन 2.17 _ TGCTGGGT CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATACCCAGCAGTCTCGTGGGCTCGGAGATGT
विज्ञापन 2.18 _ GAGGGGTT CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATAACCCCTCGTCTCGTGGGCTCGGAGATGT
Ad 2.19 _ AGGTTGGG CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCCCAACCTGTCTCGTGGGCTCGGAGATGT
विज्ञापन 2.20 _GTGTTG CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCACCACACGTCTCGTGGGCTCGGAGATGT
विज्ञापन 2.21 _ TGGGTTTC CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGAAACCCAGTCTCGTGGGCTCGGAGATGT
विज्ञापन 2.22 _ TGGTCACA CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTGTGACCAGTCTCGTGGGCTCGGAGATGT
Ad 2.23 _ TTGACCCT CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATAGGGTCAAGTCTCGTGGGCTCGGAGATGT
विज्ञापन 2.24 _ CCACTCCT CAAGCAGAGACGGGTCTCGTGGGCTCGGAGATGT

तालिका 2: पीसीआर के लिए Atac-seq ओलिगोस डिजाइन का इस्तेमाल किया।

न्यूनालेस मुक् त जल ११.९ μL
१०० μM कस्टम Nextera प्राइमर 1 (तालिका 2) ०.६ μL
नेबनेक्स्ट हाई-फिडेलिटी 2x पीसीआर मास्टर मिक्स 25 μL
ATAC-Seq लायब्रेरी 10 μL
25 μM कस्टम Nextera प्राइमरी 2 (तालिका 2) २.५ μL
कुल मात्रा ५० μL

तालिका 3: चरण ३.५ प्रारंभिक पीसीआर प्रतिक्रिया मिक्स ।

चक्र सोपान तापमान समय चक्र
एक्सटेंशन ७२ डिग्री सेल्सियस 5 min 1
प्रारंभिक विकृत्करण ९८ डिग्री सेल्सियस 30 एस 1
विकृतीकरण ९८ डिग्री सेल्सियस 10 एस 10
अनीलन ६३ डिग्री सेल्सियस 30 एस
एक्सटेंशन ७२ डिग्री सेल्सियस 1 मिनट
पकड़ 4 ° c इन्फिनिटी 1

तालिका 4: चरण ३.५ प्रारंभिक पीसीआर प्रवर्धन सायक्लिंग कार्यक्रम ।

पीसीआर रिएक्शन Aliquot 5 μL
0.6 x Syber ग्रीन के साथ तालिका 3 से पीसीआर कॉकटेल 10 μL

तालिका 5: चरण ३.६ qPCR प्रतिक्रिया मिक्स ।

चक्र सोपान तापमान समय चक्र
प्रारंभिक विकृत्करण ९८ डिग्री सेल्सियस 30 एस 1
विकृतीकरण ९८ डिग्री सेल्सियस 10 एस 20
अनीलन ६३ डिग्री सेल्सियस 30 एस
एक्सटेंशन ७२ डिग्री सेल्सियस 1 मिनट
पकड़ 4 ° c इन्फिनिटी 1

तालिका 6: चरण ३.६ qPCR सायक्लिंग कार्यक्रम ।

चक्र सोपान तापमान समय चक्र
प्रारंभिक विकृत्करण ९८ डिग्री सेल्सियस 30 एस 1
विकृतीकरण ९८ डिग्री सेल्सियस 10 एस निर्धारित
अनीलन ६३ डिग्री सेल्सियस 30 एस
एक्सटेंशन ७२ डिग्री सेल्सियस 1 मिनट
पकड़ 4 ° c इन्फिनिटी 1

तालिका 7: स्टेप ३.७ अंतिम पीसीआर प्रवर्धन के लिए पीसीआर साइक्लिंग कार्यक्रम ।

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Discussion

संशोधित ATAC-seq इस लेख में प्रस्तुत प्रोटोकॉल ंयूनतम mitochondrial डीएनए संदूषण के साथ reproducible परिणाम प्रदान करता है । प्रोटोकॉल को सफलतापूर्वक मानव प्राथमिक pbmcs10के क्रोमेटिन वास्तुकला, मानव monocytes, माउस डेन्ड्रोटिक कोशिकाओं (अप्रकाशित), और सभ्य मेलेनोमा सेल लाइनों11विशेषता का इस्तेमाल किया गया है । हम इस सुधार lysis हालत पूर्वानुमान के रूप में अच्छी तरह से अंय प्रकार के सेल के लिए काम करने की क्षमता है । यह भी प्रत्याशित है कि इस नाभिक अलगाव प्रोटोकॉल एकल नाभिक ATAC-seq प्रोटोकॉल के साथ संगत हो जाएगा, mitochondrial डीएनए संदूषण को कम करने के लिए अनुक्रमण परिणाम में सुधार होगा ।

इस संशोधित प्रोटोकॉल का एक अतिरिक्त लाभ अलग समय पर PBMCs से पृथक सीडी 4 + टी कोशिकाओं के बैचों फ्रीज करने की क्षमता है रोगी नमूनों की उपलब्धता के आधार पर. के रूप में ATAC-seq तो सभी नमूनों पर समवर्ती किया जा सकता है, transposase प्रतिक्रिया में संभावित बैच प्रभाव पूर्वाग्रह और अनुक्रमण10कम है । यह महत्वपूर्ण है कि इस फ्रीज-गल प्रोटोकॉल के साथ प्राप्त की गई उच्च व्यवहार्यता को बनाए रखने के लिए हिमांक माध्यम को प्रत्येक प्रयोग के साथ ताजा किया जाए । पृथक सीडी 4 + टी कोशिकाओं की व्यवहार्यता ९०% से ऊपर रहना चाहिए ताकि transposase प्रतिक्रिया1में गैर विशिष्ट पाचन से बचने के लिए ।

कृपया ध्यान दें कि आगे अनुकूलन के लिए चर सेल प्रकार और मात्रा के साथ इस प्रोटोकॉल का उपयोग करने के लिए आवश्यक हो सकता है । चूंकि Tn5 transposase-नाभिक अनुपात इस प्रोटोकॉल में ५००,००० नाभिक के लिए अनुकूलित किया गया है, यदि एटैक-seq नाभिक की एक अलग संख्या के साथ प्रदर्शन, Tn5 transposase की राशि तदनुसार समायोजित किया जाना चाहिए. Tn5 से अधिक के कारण नाभिक का अति-lysis बंद क्रोमेटिन और अनुक्रमण पुस्तकालयों की कम जटिलता से उच्च पृष्ठभूमि के लिए नेतृत्व कर सकते हैं, जबकि के तहत lysis एक पूरी पीसीआर प्रवर्धित पुस्तकालय1प्रदान नहीं कर सकते हैं । आदेश में इन जटिलताओं से बचने के लिए, यह सावधान नाभिक गिनती प्रदर्शन और आवश्यक के रूप में Tn5 अनुपात का अनुकूलन करने की सलाह दी है । डाटा गुणवत्ता में और सुधार करने के लिए, क्यूपीसीआर मॉनीटरिंग द्वारा पीसीआर प्रवर्धन चक्रों को इष्टतम करने की सलाह दी जाती है । यदि अंतिम लायब्रेरी बहुत अधिक प्रवर्धन चक्रित होती है, तो अनुक्रमण डेटा2में प्रस्तुत पूर्वाग्रह हो सकता है । यह atac-seq लायब्रेरी का उचित गुणवत्ता नियंत्रण करने के लिए अगली पीढ़ी अनुक्रमण से पहले करने के लिए समय और धन की बचत करने के लिए अनुशंसित है ।

जैसा कि हम प्रदर्शन किया है, एक संशोधित lysis बफर mitochondrial डीएनए संदूषण की कमी के लिए महत्वपूर्ण है और सेल प्रकार की एक विस्तृत श्रृंखला पर प्रभावी है । अंय प्रोटोकॉल वैकल्पिक lysis बफ़र्स7,19 या एक crispr-mediated mitochondrial डीएनए कमी20की गहन प्रक्रिया के साथ mitochondrial संदूषण के मुद्दे को संबोधित किया है । हमारे वैकल्पिक atac-seq प्रोटोकॉल एक बेहतर lysis बफर और atac-seq की सादगी का संरक्षण है कि यह इस तरह के एक सुलभ तकनीक बनाता है के साथ अनुक्रमण के mitochondrial डीएनए संदूषण कम करने के प्रयास करने के लिए योगदान देता है । एक साथ आरएनए-seq और एकल सेल अनुक्रमण के साथ, atac-seq की खोज के लिए एक शक्तिशाली उपकरण है पश् चजात विनियमन । यह सुधार atac-seq प्रोटोकॉल और डेटा विश्लेषण पैकेज अनुक्रमण लागत कम करने और उच्च गुणवत्ता परिणाम का उत्पादन करने में मदद करेगा ।

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Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

तकनीकी सहायता के लिए हम एटसेड साइबा को धन्यवाद देते हैं । C.S.C. NIH अनुदान 1R61DA047032 द्वारा समर्थित है ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1x PBS, Sterile Gibco 10010023 Can use other comparable products.
5810/5810 R Swing Bucket Refrigerated Centrifuge with 50 mL, 15 mL, and 1.5 mL Tube Buckets Eppendorf 22625501 Can use other comparable products.
96 Well Round Bottom Plate Thermo Scientific 163320 Can use other comparable products.
Agilent 4200 Tape Station System Agilent G2991AA Suggested for quality assessment.
Cryotubes Thermo Scientific 374081 Can use other comparable products.
DMSO Sigma D8418 Can use other comparable products.
Dynabeads Human T-Activator CD3/CD28 Invitrogen Life Technologies 11131D Critical Component
Dynabeads Untouched Human CD4 T Cells Kit Invitrogen Life Technologies 11346D Critical Component
Dynamagnet Invitrogen Life Technologies 12321D Critical Component
FCS Gemini Bio Products 100-500 Can use other comparable products.
High Sensitivity DNA Kit Agilent 50674626 Suggested for quality assessment.
Magnesium Chloride, Hexahydrate, Molecular Biology Grade Sigma M2393 Can use other comparable products.
MinElute PCR Purification Kit (Buffer PB, Buffer PE, Elution Buffer) Qiagen 28004 Critical Component
Mr. Frosty Thermo Scientific 5100-0001 Can use other comparable products.
NaCl, Molecular Biology Grade Sigma S3014 Can use other comparable products.
NEBNext High Fidelity 2x PCR Master Mix New England BioLabs M0541 Critical Component
Nextera DNA Library Preparation Kit (2x TD Buffer, Tn5 Enzyme) Illumina FC1211030 Critical Component
Nuclease Free Sterile dH20 Gibco 10977015 Can use other comparable products.
Polysorbate 20 (Tween20) Sigma P9416 Can use other comparable products.
PowerUp SYBR Green Master Mix Applied Biosystems A25780 Critical Component
Precision Water Bath Thermo Scientific TSGP02 Can use other comparable products.
QIAquick PCR Purification Kit Qiagen 28104 Critical Component
Qubit dsDNA HS Assay Kit Invitrogen Life Technologies Q32851 Suggested for quality assessment.
Qubit FlouroMeter Invitrogen Life Technologies Q33226 Suggested for quality assessment.
Rosette Sep Human CD4+ Density Medium Stem Cell Technologies 15705 Critical Component
Rosette Sep Human CD4+ Enrichment Cocktail Stem Cell Technologies 15022 Critical Component
RPMI-1640 Gibco 11875093 Can use other comparable products.
Sterile Resevoir Thermo Scientific 8096-11 Can use other comparable products.
T100 Thermocycler with Heated Lid BioRad 1861096 Can use other comparable products.
Tris-HCL Sigma T5941 Can use other comparable products.

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References

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आनुवंशिकी अंक १४५ एपिजीनोमिक्स ATAC-seq Tn5 सीडी 4 + लिम्फोसाइटों नाभिक mitochondrial डीएनए संदूषण
ATAC-seq परख के साथ कम Mitochondrial डीएनए संदूषण प्राथमिक मानव सीडी 4 + टी लिम्फोसाइटों से
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Rickner, H. D., Niu, S. Y., Cheng, C. S. ATAC-seq Assay with Low Mitochondrial DNA Contamination from Primary Human CD4+ T Lymphocytes. J. Vis. Exp. (145), e59120, doi:10.3791/59120 (2019).

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