Summary
Nous présentons ici un protocole pour effectuer un test pour la transposase accessible chromatine séquençage (ATAC-seq) sur activé CD4 + lymphocytes humains. Le protocole a été modifié pour réduire au minimum la contamination mitochondrial DNA lectures de 50 % à 3 % grâce à l’introduction d’une nouvelle mémoire tampon de lyse.
Abstract
ATAC-seq est devenu une méthode largement utilisée dans l’étude de l’épigénétique en raison de son approche simple et rapide à la cartographie de la chromatine accessible de tout le génome. Dans cet article, nous présentons un protocole ATAC-seq amélioré qui réduit la contamination lectures d’ADN mitochondriales. Alors que les précédents protocoles ATAC-seq ont lutté avec une moyenne de 50 % la contamination de l’ADN mitochondrial se lit, le tampon de lyse optimisé présenté dans le présent protocole réduit la contamination d’ADN mitochondriale à une moyenne de 3 %. Ce protocole de ATAC-seq amélioré permet de presque 50 % de réduction dans le coût du séquençage. Nous démontrons comment ces bibliothèques ATAC-seq de haute qualité peuvent être préparés de lymphocytes CD4 + activés, fournissant des instructions étape par étape de CD4 + isolation de lymphocytes du sang total par le biais de l’analyse des données. Ce protocole ATAC-seq amélioré a été validé dans un large éventail de types de cellules et sera d’une utilité immédiate aux chercheurs qui étudient l’accessibilité de la chromatine.
Introduction
Le dosage pour la transposase accessible chromatine séquençage (ATAC-seq) est rapidement devenu la principale méthode pour interroger l’architecture de la chromatine. ATAC-seq peut identifier les régions de chromatine accessible à travers le processus de tagmentation, la fragmentation et le marquage de l’ADN par la même enzyme, pour produire des bibliothèques avec laquelle séquençage peut déterminer l’accessibilité de la chromatine dans un génome entier. Ce processus de tagmentation est médié par la transposase Tn5 hyperactif, qui ne coupe que les régions ouvertes de la chromatine en raison de l’encombrement stérique nucleosomic. Qui le touche, la transposase Tn5 insère également des adaptateurs de séquençage qui permettent la construction rapide de bibliothèque par PCR et génération séquençage du génome de chromatine accessible1,2.
ATAC-seq est devenue la méthode préférée pour déterminer les régions de l’accessibilité de la chromatine en raison du protocole relativement simple et rapide, la qualité et la quantité d’information qui peut être déterminée de ses résultats et une petite quantité de matériel requis de départ. Par rapport à DNase-seq3 (qui mesure également l’accessibilité de la chromatine génome-large), MNase-seq4 (qui détermine les positions des nucléosomes dans régions génomiques ouvert), et le formaldéhyde-mediated FAIRE-seq5, ATAC-seq est plus rapide, moins cher et plus reproductible1. Il est aussi plus sensible, avec matériel d’aussi peu que 500 noyaux, par rapport aux 50 millions requis pour DNase-seq3noyaux de départ. ATAC-seq a également la possibilité de fournir plus d’informations sur l’architecture de la chromatine que d’autres méthodes, y compris les régions de liaison de facteur de transcription, positionnement des nucléosomes et régions de chromatine ouverte1. Efficaces, monocellulaires ATAC-seq protocoles ont été validés, fournissant des informations sur l’architecture de la chromatine à la cellule unique niveau6,7.
ATAC-seq a été utilisé pour caractériser l’architecture de la chromatine dans un large éventail de types de cellules et de la recherche, y compris les plantes8humains9et beaucoup d’autres organismes. Il a également été essentiel dans l’identification de régulation épigénétique de la maladie États7. Cependant, le plus largement utilisé du protocole ATAC-seq inclut l’inconvénient majeur de contamination lectures de séquençage de l’ADN mitochondrial. Dans certaines bases de données, ce niveau de contamination peut être aussi haut que 60 % de séquencer les résultats1. Il y a un effort concerté dans le domaine de réduire ces contaminants lectures mitochondriales afin de permettre l’application plus efficace de ATAC-seq7,10,11. Nous présentons ici un protocole ATAC-seq amélioré qui réduit le taux de contamination de l’ADN mitochondrial, à seulement 3 %, permettant de réduire d’environ 50 % de coûts de séquençage10. Ceci est rendu possible par un processus simplifié de CD4 + lymphocytes d’isolement et d’activation et un tampon de lyse améliorée qui est essentielle pour réduire au minimum la contamination de l’ADN mitochondriale.
Ce protocole modifiedATAC-seq a été validé avec une large gamme de cellules primaires, y compris le sang périphérique primaire humain cellules mononucléaires (PBMC)10, des monocytes humains primaires et les cellules dendritiques de souris (non publiées). Il a également été utilisé avec succès pour interroger des lignées de cellules de mélanome dans un écran régulièrement dois‑je courts palindromes répétitions (CRISPR) en cluster de non-codage éléments11. En outre, le progiciel d’analyse de données décrites dans le présent protocole et fourni sur GitHub fournit des chercheurs débutants et expérimentés avec des outils pour analyser les données de l’ATAC-seq. ATAC-seq est le dosage plus efficace pour cartographier l’accessibilité de la chromatine dans un génome entier, et les modifications au protocole existant qui sont introduites ici permettra aux chercheurs de produire des données de haute qualité avec une faible contamination de l’ADN mitochondriale, réduction des coûts de séquençage et améliorant le débit ATAC-seq.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Ce protocole amélioré fournit des instructions détaillées pour l’exécution de ATAC-seq des lymphocytes CD4 +, de la matière première de sang grâce à l’analyse de données (Figure 1).
1. isolement des cellules de T CD4 + du sang total
Remarque : Le produit de départ pour ce protocole est de 15 mL de sang total frais prélevé à l’aide de procédures standards, permettant à la source des matières premières à être sélectionné issu des besoins de recherche. L’échelle du protocole selon les besoins. Réchauffez en solution saline tamponnée au phosphate (PBS) + sérum de veau foetal de 2 % (FCS) à température ambiante (RT) et ajustez la centrifugeuse pour RT avant de commencer la procédure d’enrichissement de cellules T CD4 +.
- Ajouter 750 µL de CD4 + lymphocytes T enrichissement humain cocktail à 15 mL de sang dans un tube conique de 50 mL et mélanger doucement à l’inversion. Incuber 20 min à RT. Lors de l’incubation est terminée, ajouter 15 mL de PBS + 2 % FCS dans le tube et mélanger doucement à l’inversion.
- Préparer un tube conique frais 50 mL 15 ml de milieu de densité. Soigneusement l’échantillon de sang dilué sur le dessus de la moyenne densité, étant sûr de ne pas perturber l’interface de support/sang de densité qui forme la couche. Centrifuger pendant 20 min à 1 200 x RT et g l’accélération de la valeur 1 et le frein décroissant au large.
Remarque : Il est essentiel de définir l’accélération 1 et descendant de frein OFF sur la centrifugeuse à éviter des perturbations de la couche de cellules dans le milieu de la densité. - Recueillir les cellules T CD4 + enrichis depuis l’interface de support/plasma de densité à l’aide d’une pipette de transfert tige étroite. Transférer les cellules recueillies dans un tube conique frais 50 mL. Centrifuger les cellules T CD4 + collectées pendant 8 min à 423 x g et RT.
Remarque : Assurez-vous de revenir l’accélération centrifuge frein 9 et descendant sur ON pour l’étape 1.3 et toutes les étapes suivantes. - Jeter le surnageant et laver le culot cellulaire deux fois avec 50 mL de PBS + 2 % FCS, centrifugation pendant 8 min à 423 x g et RT. jeter le surnageant final lavez et suspendre le culot cellulaire lavées dans 2 mL de PBS + 2 % FCS.
- Compter les cellules à l’aide d’un hémocytomètre. Pour continuer avec ATAC-seq, passez à l’étape 2.3. Pour congeler les cellules pour un traitement ultérieur, passer au point 1.6.
- Ajouter 1 mL de milieu frais glacial (FCS 90 % + 10 % de diméthyl sulfoxide) par 1 million de cellules. Aliquote 1 mL de cellules en gel en tubes sécurités cryogéniques. Placer les tubes à-80 ° C durant la nuit dans un récipient de ralentir au point de congélation. Le lendemain, transfert en tubes à l’azote liquide pour le stockage à long terme.
Remarque : 1 million de cellules T CD4 + sera isolé par 2 mL de volume de sang d’origine. Congelez 500 000 cellules dans 1 ml de milieu de congélation. Faire un milieu gel frais à chaque utilisation.
2. activer et purifier les cellules T CD4 +
Remarque : Ce protocole rapid pour l’activation et la purification de cellules T CD4 + seulement requiert 48 h et les résultats dans 95 % viable, activé les cellules T CD4 +. Cool le centrifuger à 4 ° C avant de commencer le protocole.
- Décongeler 1 flacon (500 000) des cellules T CD4 + dans un bain-marie à 37 ° C jusqu'à ce que la glace a fondu juste. Cellules de transfert doucement dans un tube conique 15 mL contenant 9 mL de médias de Roswell Park Memorial Institute-1640 (RPMI-1640) pré chauffé additionné de 10 % de FCS, ci-après dénommé RPMI complet.
Remarque : Ne laissez pas les cellules décongeler complètement pour éviter l’exposition au DMSO. - Centrifuger pendant 6 min à 1500 x g et 4 ° C. Jeter le surnageant et suspendez doucement le culot dans 2 mL de RPMI complet. Répéter le spin down, éliminer le surnageant et suspendez doucement les cellules dans 0,5 mL de RPMI complet.
- Compter les cellules à l’aide d’un hémocytomètre. Ajuster la densité de la suspension cellulaire avec RPMI complet à 50 000 cellules dans 200 µL / puits d’une plaque de fond rond 96 puits de la plaque.
Remarque : D’un tube congelé des cellules T CD4 + de 500K, puits de la plaque 10 des 50 000 cellules T CD4 + dans 200 µL / puits. -
Préparer des billes magnétiques conjugués avec anticorps anti-CD3 et anti-CD28 humains de T-activator.
- Aliquote 12,5 µL d’humain T-activateur CD3/CD28 perles par ATAC-seq échantillon dans un tube de 1,5 mL. Laver les billes avec 1 mL de solution 1 PBS x et placer le tube sur un aimant pendant 1 min.
- Retirer et jeter le surnageant clair, retirez délicatement le tube d’aimant et suspendre les perles dans 13 µL terminer RPMI par échantillon ATAC-seq.
Remarque : Calculer le montant de perles nécessaires selon le nombre d’échantillons de ATAC-seq en cours de traitement. Ce protocole requiert 12,5 µL de billes CD3/CD28 par 500 000 cellules, constituant un échantillon de ATAC-seq.
- Activer les cellules T CD4 +. Prélever des 500 000 cellules en 2,1 mL du milieu RPMI complet dans un tube conique de 15 mL et ajouter 12,5 µL de perles de T-activateur humaines déjà lavées. Mélanger doucement en retournant le tube.
- Transférer doucement les cellules avec des perles à une stérile réservoir et plaque 200 µL de cellules avec des perles / puits de la plaque à 96 puits fond rond à l’aide d’une pipette multi-canaux. Incuber pendant 48 h dans un 37 ° C, 5 % CO2 incubateur.
- Après incubation, centrifuger la plaque 96 puits pendant 8 min à 423 x g et RT. enlever 100 µL de milieu / puits de la plaque à 96 puits, il collecte dans un tube conique avant de le jeter pour assurer sans perte de perle. Resuspendre le culot dans les derniers 100 µL et recueillir tous dans un tube de 1,5 mL.
Remarque : 10 puits de lymphocytes T activés seront rassemblées dans un volume de 1 mL. - Effectuer des CD4 + isolation. Ajouter 50 µL de Prélavée perles CD4 conjugué aux 500 000 cellules dans 1 mL de milieu RPMI complet. Combiner les perles et les cellules la pipette. Incuber pendant 20 min à 4 ° C dans le réfrigérateur. Agiter les perles et mélange toutes les 6 minutes de la cellule.
Remarque : Ce protocole doit être utilisé que pour un échantillon de 500 000 cellules. Ajustez si nécessaire pour deux ou plusieurs échantillons de 500 000. - Lorsque l’incubation est terminée, placer le tube sur l’aimant pour 2 min. retirer et jeter le surnageant lorsque claire. Laver les cellules perle-bondissent en enlevant le tube de l’aimant, suspendant les cellules perle-bondissent dans 1 mL de PBS + 2 % FCS, remplaçant le tube sur l’aimant pendant 1 min et jeter le surnageant clair. Répétez ce processus pour un total de 3 lavages.
Remarque : Veillez à ne pas jeter des perles lors de lavages. - Après le lavage final, placer le tube sur l’aimant pour 1 min. retirer et jeter le surnageant et placez la sur la glace. Passez à la section 3 (ATAC-seq).
3. ATAC-seq
Remarque : Dans cette étape, les noyaux sont isolés de lymphocytes T CD4 + activés pour ATAC-suiv. Le tampon de lyse utilisé dans le présent protocole a été amélioré pour être plus doux sur les noyaux, ce qui entraîne une digestion plus efficace et des résultats de qualité supérieures. Toutes les étapes de centrifugation à l’article 3 sont effectuées avec une centrifugeuse à angle fixe maintenue à 4 ° C. Cool la centrifugeuse avant de commencer le protocole.
- Effectuer l’isolation de noyaux. Remettre en suspension les cellules avec le tampon de lyse froid (10 mM Tris-HCl, pH 7,4, 10 mM NaCl, MgCl2, 0,03 % polysorbate 20 3 mM) et perles. Centrifuger immédiatement à 500 x g pendant 10 min à 4 ° C. Retirer et jeter le surnageant.
- Effectuer la réaction de la transposase. Suspendre le culot de noyaux isolés avec 50 µL de Tn5 transposase mix (tableau 1). Incuber dans un thermocycleur pendant 30 min à 37 ° C, avec un couvercle de 40 ° C, tenant à 4 ° C lorsque vous avez terminé.
- Après cyclage thermique, immédiatement effectuer une rotation de centrifugeuse de paillasse rapide vers le bas et placer le tube sur l’aimant pendant 1 min retirer les billes du produit.
- Transférer le surnageant clair du tube sur l’aimant à une colonne de purification de l’ADN. Laver la colonne avec 250 µL de tampon de PB et deux fois avec 750 µL de tampon de PE. Éluer l’échantillon de 10 µL de tampon d’élution. Passer directement au point 3.5.
Remarque : Cette étape amplifie les fragments d’ADN avec les adaptateurs ligaturés, dénommés ici la bibliothèque ATAC-seq. Pour multiplexer plusieurs bibliothèques ATAC-seq pour être exécuté sur une seule voie NGS, utilisez non indexées Primer 1 pour tous les échantillons et un 2 de Primer indexée différents pour des échantillons individuels (tableau 2). Amorces servent à travailler les concentrations de 1,25 µM. - Mettre en place la réaction d’amplification PCR initiale dans un tube PCR exempte de nucléase, combinant les composants dans l’ordre et le volume spécifié dans tableau 3. Placer le tube PCR dans le thermocycleur et exécutez le programme d’amplification PCR avec cyclisme conditions spécifiées dans le tableau 4.
-
Surveiller la réaction de qPCR. Mettre en place la réaction de qPCR dans un tube PCR exempte de nucléase, combinant les composants dans l’ordre et de la quantité spécifiée dans le tableau 5. Place dans la machine de qPCR et cycle comme spécifié au tableau 6.
- Pour déterminer que le nombre optimal d’amplification supplémentaire des cycles pour la réaction de 45 µL restants, créer un terrain avec le nombre de cycles sur l’axe des abscisses et la fluorescence relative (RFU) sur l’axe y. Le nombre optimal de cycles d’amplification supplémentaire est un tiers le nombre de cycles qu’il faut pour la réaction de qPCR atteindre le plateau.
NOTE : Suivi de la réaction de qPCR permet pour déterminer le nombre optimal de cycles PCR désiré obtenir l’amplification de fragment de bibliothèque optimale tout en minimisant les GC contenu et biais de taille.
- Pour déterminer que le nombre optimal d’amplification supplémentaire des cycles pour la réaction de 45 µL restants, créer un terrain avec le nombre de cycles sur l’axe des abscisses et la fluorescence relative (RFU) sur l’axe y. Le nombre optimal de cycles d’amplification supplémentaire est un tiers le nombre de cycles qu’il faut pour la réaction de qPCR atteindre le plateau.
- Compléter l’amplification PCR finale le µl 45 restantes de la réaction PCR. Replacez le tube PCR avec la réaction d’amplification de l’étape 3.5 dans le thermocycleur et exécuter le programme, tel que décrit dans le tableau 7.
Remarque : Pour les échantillons traités tel que décrit dans le présent protocole, le nombre optimal de cycles d’amplification PCR a été déterminé à 12. - Une fois terminée l’amplification, purifier les bibliothèques à l’aide d’un kit de nettoyage PCR suivant le protocole du fabricant, à élution de 25 µL du tampon d’élution.
Remarque : Amplifié bibliothèques peuvent être conservés à 4 ° C pendant 48 h ou congelés à-20 ° C pour le stockage à long terme.
4. ATAC-seq bibliothèque analyse de la qualité
Remarque : Il est important de valider la qualité et la quantité des bibliothèques ATAC-seq avant séquençage nouvelle génération. La qualité et la quantité des bibliothèques devraient être évalués à l’aide de trousses disponibles dans le commerce (voir Table des matières).
- Évaluer la qualité et la quantité des bibliothèques ATAC-seq en utilisant une plate-forme microfluidique de dimensionnement, de quantification et de contrôle de la qualité de l’ADN. Voir la Figure 2 pour les résultats de l’évaluation qualité représentatif.
Remarque : La concentration des bibliothèques ATAC-seq doit être > 1 ng/µL à obtenir des résultats de séquençage de qualité. Le moyen, 30 nM à 25 µL ont été obtenus.
5. le séquençage et l’analyse des données
Remarque : Ce pipeline analyse permet aux utilisateurs de contrôler la qualité des lectures mappage de procédure, ajuster les coordonnées pour la conception expérimentale et appeler les pics pour l’analyse en aval. Voici les lignes de commandes et l’explication de l’exécution. Le package d’analyse de données est disponible à (https://github.com/s18692001/bulk_ATAC_seq).
- Séquencer les bibliothèques de prêts sur un séquenceur de prochaine génération à une profondeur moyenne de 42 millions de lectures par exemple.
- Estimer la qualité des lectures de séquençage en vérifiant les fichiers générés par FastQC12 progiciel à l’aide de la commande :
fastqc -o < output_directory >< fastq_file > - Couper les bases des lectures par Trimmomatic13 logiciel, le cas échéant, tel que déterminé par le contrôle de qualité de FastQC, à l’aide de la commande (à paire asymétrique) :
Java-jar < chemin d’accès au fichier jar trimmomatic > PE < input1 >< input2 >< appariés output1 >< non apparié output1 >< appariés output2 >< non apparié output2 > HEADCROP : < recadrer les bases > - Aligner les lectures au génome humain de référence (hg38) par Bowtie214 software :
bowtie2 - x < génome de référence > -1 < paire d’entrée 1 >< paire d’entrée 2 > -S < fichier de sortie SAM >
Remarque : L’argument - x est pour le nom de la base de l’indice pour le génome de référence, et est -S pour la sortie de format SAM. - Vérifiez telsqueles mappé se lit à l’aide de Samtools15 flagstat package :
SamTools flagstat < fichier BAM > - Trier le fichier mappé lectures et supprimer les doublons en utilisant outil16 Picard :
Java-jar picard.jar d’entrée SortSam = < nom du fichier d’entrée SAM > sortie = < nom du fichier sortie tri BAM > SORT_ORDER = coordonnée » et « java-jar picard.jar MarkDuplicates entrée = < fichier trié de BAM > sortie = < fichier de sortie BAM sans doublons > REMOVE_DUPLICATES = TRUE - Fichier index BAM, tailler les lectures de chromosome inutilisés et passer les coordonnées pour la raison expérimentale de ATAC-seq17:
Java-jar picard.jar BuildBamIndex entrée = < fichier BAM >
SamTools idxstats < fichier entrée BAM > | couper -f 1 | grep - v chrY | grep - v chrM | grep - v chrUn | xargs samtools découvre -b < fichier entrée BAM >>< garnis de sortie fichier BAM >
BEDTools bamtobed -i < Input garnis de fichier BAM >>< garnis de sortie fichier lit >
awk ' BEGIN {OFS = « \t »} ; {Si (6 $ == « + ») print $1, $2 + 4, 3 + 4 $, 4 $, 5 $, 6 $; else print $1, $2-5, 3-5 $, 4 $, 5 $, 6 $} ' < Input garnis de fichier lit >< boîte décalé fichier lit > - Supprimez les lectures qui sont décalés vers la coordination négative :
awk « {if ($2 > 0) print $1 « \t » $2 « \t » $3 « \t » $4 « \t » $5 « \t » $6} » < fichier entrée lit >< fichier de sortie non négatif coordination lit >. - Convertir le fichier lit vers BAM pour analyse de18 DiffBind suivante :
BEDTools bedtobam -i < Input lit dossier > -g < référence génome >< fichier de sortie BAM > - Effectuer des appels de crête par DiffBind18 progiciel :
macs2 callpeak -t < fichier entrée BAM > f - BAM -g hs - nomodel--nolambda--keep-dup tous--appel-sommets--outdir < chemin de répertoire de sortie > - n < nom de sortie > -B - q 0,01--bdg--Maj -100--extsize 200
Remarque : Après filtrage, s’attendre à une moyenne de 37 millions de lectures par exemple. Contamination de l’ADN mitochondriale variera de 0,30 % à 5,39 % (1,96 % en moyenne). Il y aura un faible taux de multiplier mappés lectures (6,7 % à 56 %, 19 % en moyenne) et un pourcentage relativement élevé d’utilisables nucléaire lit (60 % à 92 %, 79 % en moyenne).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
A partir de 15 mL de sang total frais, ce protocole génère une moyenne de 1 million de cellules T CD4 +. Ceux-ci peuvent être congelés pour un traitement ultérieur ou utilisés immédiatement. La viabilité des cellules T CD4 +, fraîches ou décongelées, était systématiquement > 95 %. Cette méthode d’isolement de cellules T CD4 + permet une flexibilité dans le temps de matériel et de la collection source. Ce protocole ATAC-seq amélioré produit une bibliothèque finale supérieure à 1 ng/µL pour le séquençage. Contrôle de la qualité effectuée à l’aide de systèmes disponibles dans le commerce doivent démontrer des fragments d’ADN entre 200 et 1 000 bp (Figure 2). Séquençage ne doit être effectué avec les bibliothèques de haute qualité.
Toutes les bibliothèques ont été séquencés jusqu'à une profondeur moyenne de plus de 40 millions lire par exemple. Bien que couramment utilisés ATAC-seq protocoles ont été contestés par contaminer les lectures de séquençage de l’ADN mitochondrial qui peut varier entre 50-60 % du total séquençage lectures1 ce protocole amélioré élimine le problème. Bibliothèques préparés suite à ce protocole contiennent en moyenne seulement 3 % mitochondrial se lit comme suit (Figure 3 a). Le pourcentage élevé de lectures utilisables est suffisamment constant à travers les réplicats biologiques (Figure 3 b). Le protocole a été en mesure de fournir des résultats hautement reproductibles à travers les répétitions techniques (Figure 4 a, B) ainsi que des réplicats biologiques (Figure 4, D). En outre, le protocole pour l’activation des cellules T CD4 + présenté prend 48 h plutôt qu’une semaine ou plus et entraîne l’activation cohérente et efficace, comme en témoignent les résultats du séquençage reproductible (Figure 4 a, B). Prédite ATAC-seq pics sont appelés avec précision par le pipeline de l’analyse (Figure 4E). Analyse des résultats de séquençage identifié annuler les modifications dans l’état de la chromatine au cours de l’activation des cellules T humaines. Différentiellement accessibles régions de chromatine ouverte ont été identifiées entre six échantillons avant et après 48 h d’activation (Figure 5).
Figure 1 : expérimentale vue d’ensemble du protocole mis à jour le ATAC-seq. (A) échantillon acquisition et traitement, cellule de 15 mL de sang total patient par le biais de lymphocytes T CD4 + isolation, placage et activation des cellules T et isolement des noyaux avec le tampon de lyse améliorée. (B) la transposase réaction et amplification par PCR de la bibliothèque de séquençage. (C) analyse qualité, séquençage et l’analyse des données. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : bibliothèques ATAC-seq représentatif de haute qualité depuis une plate-forme microfluidique de dimensionnement, de quantification et de contrôle de la qualité de l’ADN. (A) image de gel électronique des échantillons B1 et D1 avec des bandes entre 200 et 1 000 paires de bases. (B et C) Electrophoregramme résultat du suivi des échantillons B1 (B) et D1 (C), avec des pics entre 200 et 1 000 paires de bases. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : a diminué la contamination ADN mitochondriale avec les résultats de protocole ATAC-seq améliorées à une augmentation de lectures de séquençage ADN utilisables. (A) comparaison des utilisable lit (violette), double lit (vert) et lectures mitochondriales (rouge) de lymphocytes T CD4 + cellules ATAC-seq profilage dans la littérature. (B) comparaison des utilisable lit (violette), double lit (vert), lit mitochondriale (rouge) et non mappés lectures (bleu) des lymphocytes T CD4 + cellules ATAC-seq, profilage de plusieurs individus sains (n = 22). Ce chiffre a été modifié par Cheng et al.,10. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 4 : amélioré ATAC-seq protocole reproductibilité et précision. Disperser les parcelles d’accessibilité de la chromatine (signal de ATAC-seq, x et y) pour répliquer les deux expériences de non stimulées (A; 36 486 Th pics) ou activée (B; 52 154 Thstim pics) cellules T montre la reproductibilité technique. L’accessibilité de la chromatine pour les lymphocytes T activés par des individus IGTB1191 (axe y) et IGTB1190 (axe x) (C) et l’histogramme des corrélations entre chaque paires d’individus pour les pics de Thstim 52 154 (D) montre la reproductibilité entre les individus. (E) ATAC-seq pics appelée avec notre protocole ATAC-seq améliorée au chromosome 19 Q13.12. Ce chiffre a été modifié par Cheng et al.,10. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 5 : résultats représentant ATAC-seq des changements dans l’état de la chromatine après activation des lymphocytes T CD4 +. (A) vue d’ensemble expérimental (à gauche) et nomenclature (à droite). (B) différentiellement accessibles régions de chromatine ouverte (colonnes) dans six échantillons (lignes) avant (en haut, Th) et après (en bas, estim) activation de 48 h de cellules T CD4 + primaires. Ce chiffre a été modifié par Cheng et al.,10. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
| 2 x TD tampon | 25 ΜL |
| Tn5 Enzyme | 5 ΜL |
| Nucléase eau libre | 20 ΜL |
| Volume total | 50 ΜL |
Tableau 1 : Composants de réaction étape 3.2 transposase.
| Ad1_noMX : AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCGTCGGCAGCGTCAGATGTG |
| AD2.1_TAAGGCGA CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTCGCCTTAGTCTCGTGGGCTCGGAGATGT |
| AD2.2_CGTACTAG CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCTAGTACGGTCTCGTGGGCTCGGAGATGT |
| AD2.3_AGGCAGAA CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTTCTGCCTGTCTCGTGGGCTCGGAGATGT |
| AD2.4_TCCTGAGC CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGCTCAGGAGTCTCGTGGGCTCGGAGATGT |
| AD2.5_GGACTCCT CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATAGGAGTCCGTCTCGTGGGCTCGGAGATGT |
| AD2.6_TAGGCATG CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCATGCCTAGTCTCGTGGGCTCGGAGATGT |
| AD2.7_CTCTCTAC CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGTAGAGAGGTCTCGTGGGCTCGGAGATGT |
| AD2.8_CAGAGAGG CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCCTCTCTGGTCTCGTGGGCTCGGAGATGT |
| AD2.9_GCTACGCT CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATAGCGTAGCGTCTCGTGGGCTCGGAGATGT |
| AD2.10_CGAGGCTG CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCAGCCTCGGTCTCGTGGGCTCGGAGATGT |
| AD2.11_AAGAGGCA CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTGCCTCTTGTCTCGTGGGCTCGGAGATGT |
| AD2.12_GTAGAGGA CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTCCTCTACGTCTCGTGGGCTCGGAGATGT |
| AD2.13_GTCGTGAT CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATATCACGACGTCTCGTGGGCTCGGAGATGT |
| AD2.14_ACCACTGT CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATACAGTGGTGTCTCGTGGGCTCGGAGATGT |
| AD2.15_TGGATCTG CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCAGATCCAGTCTCGTGGGCTCGGAGATGT |
| AD2.16_CCGTTTGT CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATACAAACGGGTCTCGTGGGCTCGGAGATGT |
| AD2.17_TGCTGGGT CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATACCCAGCAGTCTCGTGGGCTCGGAGATGT |
| AD2.18_GAGGGGTT CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATAACCCCTCGTCTCGTGGGCTCGGAGATGT |
| AD2.19_AGGTTGGG CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCCCAACCTGTCTCGTGGGCTCGGAGATGT |
| AD2.20_GTGTGGTG CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCACCACACGTCTCGTGGGCTCGGAGATGT |
| AD2.21_TGGGTTTC CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGAAACCCAGTCTCGTGGGCTCGGAGATGT |
| AD2.22_TGGTCACA CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTGTGACCAGTCTCGTGGGCTCGGAGATGT |
| AD2.23_TTGACCCT CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATAGGGTCAAGTCTCGTGGGCTCGGAGATGT |
| AD2.24_CCACTCCT CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATAGGAGTGGGTCTCGTGGGCTCGGAGATGT |
Tableau 2 : ATAC-seq oligos modèles utilisés pour l’ACP.
| Nucléase eau libre | 11,9 ΜL |
| 100µm Nextera personnalisé Primer 1 (tableau 2) | 0,6 ΜL |
| NEBNext haute fidélité 2 x PCR Master Mix | 25 ΜL |
| ATAC-Seq bibliothèque | 10 ΜL |
| 25 µM Nextera personnalisé Primer 2 (tableau 2) | 2,5 ΜL |
| Volume total | 50 ΜL |
Tableau 3 : Mélange de réaction PCR initial étape 3.5.
| ÉTAPE DU CYCLE | TEMPÉRATURE | TEMPS | CYCLES |
| Extension | 72 ° C | 5 min | 1 |
| Dénaturation initiale | 98 ° C | 30 s | 1 |
| Dénaturation | 98 ° C | 10 s | 10 |
| Recuit | 63 ° C | 30 s | |
| Extension | 72 ° C | 1 min | |
| Maintenez | 4 ° C | Infini | 1 |
Tableau 4 : Programme de cyclisme 3.5 étape initial PCR amplification.
| Aliquote de réaction PCR | 5 ΜL |
| Cocktail PCR du tableau 3 avec 0,6 x Syber vert | 10 ΜL |
Tableau 5 : Mélange de réaction de qPCR étape 3.6.
| ÉTAPE DU CYCLE | TEMPÉRATURE | TEMPS | CYCLES |
| Dénaturation initiale | 98 ° C | 30 s | 1 |
| Dénaturation | 98 ° C | 10 s | 20 |
| Recuit | 63 ° C | 30 s | |
| Extension | 72 ° C | 1 min | |
| Maintenez | 4 ° C | Infini | 1 |
Tableau 6 : Programme de cyclisme de qPCR étape 3.6.
| ÉTAPE DU CYCLE | TEMPÉRATURE | TEMPS | CYCLES |
| Dénaturation initiale | 98 ° C | 30 s | 1 |
| Dénaturation | 98 ° C | 10 s | Comme l’a déterminé |
| Recuit | 63 ° C | 30 s | |
| Extension | 72 ° C | 1 min | |
| Maintenez | 4 ° C | Infini | 1 |
Tableau 7 : Programme de cyclisme étape 3,7 PCR pour l’amplification PCR finale.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
ATAC-seq mis à jour le protocole présenté dans cet article fournit des résultats reproductibles avec une contamination ADN mitochondriale minimale. Le protocole a été avec succès utilisé pour caractériser l’architecture de la chromatine des humains primaires PBMC10, des monocytes, cellules dendritiques de souris (non publiées) et cellules de mélanome cultivées les lignes11. Nous prévoyons que cette amélioration lyse condition a la possibilité de travailler pour les autres types de cellules. Il est également prévu que ce protocole d’isolement de noyaux sera compatible avec les protocoles ATAC-seq, réduisant au minimum la contamination ADN mitochondriale pour améliorer les résultats du séquençage des noyaux unique.
Un avantage supplémentaire de ce protocole modifié est la possibilité de geler les lots de cellules T CD4 + isolées de PBMC à des moments différents selon la disponibilité des échantillons de patients. ATAC-seq peut ensuite être exécutée simultanément sur tous les échantillons, biais d’effet lot potentiel dans la réaction de la transposase et le séquençage est réduit au minimum10. Il est essentiel que médium gel faire frais à chaque utilisation, afin de maintenir la viabilité haute qui est atteint avec ce protocole de gel-dégel. Viabilité des cellules T CD4 + isolées doit rester supérieure à 90 % afin d’éviter la digestion non spécifiques à la transposase réaction1.
Veuillez noter que l’optimisation supplémentaire peut être nécessaire pour utiliser ce protocole avec les quantités et les types de cellules variables. Étant donné que le ratio de transposase-à-noyaux Tn5 a été optimisé pour 500 000 noyaux dans le présent protocole, s’effectuant ATAC-seq avec un nombre différent de noyaux, la quantité de Tn5 transposase doit être ajustée en conséquence. Lyse excessive des noyaux en raison d’un excès de Tn5 peut conduire à fond important de chromatine fermée et faible complexité des bibliothèques de séquençage, tandis que sous lyse ne peut pas fournir une PCR complet amplifié bibliothèque1. Afin d’éviter ces complications, il est conseillé d’effectuer des noyaux prudents comptage et optimiser le ratio Tn5 si nécessaire. Afin d’améliorer la qualité des données, il est conseillé d’optimiser les cycles d’amplification PCR en qPCR surveillant. Si la bibliothèque finale subit trop de cycles d’amplification, il peut y avoir des biais dans les données de séquençage2. Il est recommandé d’effectuer le bon contrôle de la qualité des bibliothèques ATAC-seq avant séquençage de prochaine génération afin d’économiser temps et argent.
Comme nous l’avons démontré, un tampon de lyse modifiée est la clé de la réduction de la contamination de l’ADN mitochondriale et est efficace sur un large éventail de types de cellules. Autres protocoles ont abordé la question de la contamination mitochondriale avec lyse rechange tampons7,19 , ou par le processus intensif d’un médiation CRISPR mitochondrial DNA épuisement20. Notre protocole alternatif de ATAC-seq contribue à l’effort pour diminuer la contamination d’ADN mitochondriale de séquençage se lit avec un tampon de lyse améliorée et la conservation de la simplicité de l’ATAC-seq, ce qui rend une telle technique accessible. Ainsi que RNA-seq et séquençage des unicellulaires, ATAC-seq est un outil puissant pour explorer la régulation épigénétique. Cette amélioration ATAC-seq protocole et progiciel d’analyse de données aidera à diminuer les coûts de séquençage et de produire des résultats de qualité supérieures.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Acknowledgments
Nous remercions Atsede Siba pour le support technique. C.S.C. est pris en charge par les NIH grant 1R61DA047032.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1x PBS, Sterile | Gibco | 10010023 | Can use other comparable products. |
| 5810/5810 R Swing Bucket Refrigerated Centrifuge with 50 mL, 15 mL, and 1.5 mL Tube Buckets | Eppendorf | 22625501 | Can use other comparable products. |
| 96 Well Round Bottom Plate | Thermo Scientific | 163320 | Can use other comparable products. |
| Agilent 4200 Tape Station System | Agilent | G2991AA | Suggested for quality assessment. |
| Cryotubes | Thermo Scientific | 374081 | Can use other comparable products. |
| DMSO | Sigma | D8418 | Can use other comparable products. |
| Dynabeads Human T-Activator CD3/CD28 | Invitrogen Life Technologies | 11131D | Critical Component |
| Dynabeads Untouched Human CD4 T Cells Kit | Invitrogen Life Technologies | 11346D | Critical Component |
| Dynamagnet | Invitrogen Life Technologies | 12321D | Critical Component |
| FCS | Gemini Bio Products | 100-500 | Can use other comparable products. |
| High Sensitivity DNA Kit | Agilent | 50674626 | Suggested for quality assessment. |
| Magnesium Chloride, Hexahydrate, Molecular Biology Grade | Sigma | M2393 | Can use other comparable products. |
| MinElute PCR Purification Kit (Buffer PB, Buffer PE, Elution Buffer) | Qiagen | 28004 | Critical Component |
| Mr. Frosty | Thermo Scientific | 5100-0001 | Can use other comparable products. |
| NaCl, Molecular Biology Grade | Sigma | S3014 | Can use other comparable products. |
| NEBNext High Fidelity 2x PCR Master Mix | New England BioLabs | M0541 | Critical Component |
| Nextera DNA Library Preparation Kit (2x TD Buffer, Tn5 Enzyme) | Illumina | FC1211030 | Critical Component |
| Nuclease Free Sterile dH20 | Gibco | 10977015 | Can use other comparable products. |
| Polysorbate 20 (Tween20) | Sigma | P9416 | Can use other comparable products. |
| PowerUp SYBR Green Master Mix | Applied Biosystems | A25780 | Critical Component |
| Precision Water Bath | Thermo Scientific | TSGP02 | Can use other comparable products. |
| QIAquick PCR Purification Kit | Qiagen | 28104 | Critical Component |
| Qubit dsDNA HS Assay Kit | Invitrogen Life Technologies | Q32851 | Suggested for quality assessment. |
| Qubit FlouroMeter | Invitrogen Life Technologies | Q33226 | Suggested for quality assessment. |
| Rosette Sep Human CD4+ Density Medium | Stem Cell Technologies | 15705 | Critical Component |
| Rosette Sep Human CD4+ Enrichment Cocktail | Stem Cell Technologies | 15022 | Critical Component |
| RPMI-1640 | Gibco | 11875093 | Can use other comparable products. |
| Sterile Resevoir | Thermo Scientific | 8096-11 | Can use other comparable products. |
| T100 Thermocycler with Heated Lid | BioRad | 1861096 | Can use other comparable products. |
| Tris-HCL | Sigma | T5941 | Can use other comparable products. |
References
- Buenrostro, J. D., Giresi, P. G., Zaba, L. C., Chang, H. Y., Greenleaf, W. J. Transposition of native chromatin for fast and sensitive epigenomic profiling of open chromatin, DNA-binding proteins and nucleosome position. Nature Methods. 10 (12), 1213-1218 (2013).
- Buenrostro, J. D., Wu, B., Chang, H. Y., Greenleaf, W. J. ATAC-seq: A Method for Assaying Chromatin Accessibility Genome-Wide. Current Protocols in Molecular Biology. 21, 1-29 (2015).
- Song, L., Crawford, G. E. DNase-seq: a high-resolution technique for mapping active gene regulatory elements across the genome from mammalian cells. Cold Spring Harbor Protocols. (2), (2010).
- Pajoro, A., Muiño, J. M., Angenent, G. C., Kaufmann, K. Profiling Nucleosome Occupancy by MNase-seq: Experimental Protocol and Computational Analysis. Methods in Molecular Biology. 1675, 167-181 (2018).
- Giresi, P. G., Kim, J., McDaniell, R. M., Iyer, V. R., Lieb, J. D. FAIRE (Formaldehyde-Assisted Isolation of Regulatory Elements) isolates active regulatory elements from human chromatin. Genome Research. 17 (6), 877-885 (2007).
- Rosenberg, A. B., et al. Single-cell profiling of the developing mouse brain and spinal cord with split-pool barcoding. Science. 360 (6385), 176-182 (2018).
- Corces, M. R., et al. Lineage-specific and single-cell chromatin accessibility charts human hematopoiesis and leukemia evolution. Nature Genetics. 48 (10), 1193-1203 (2016).
- Lu, Z., Hofmeister, B. T., Vollmers, C., DuBois, R. M., Schmitz, R. J. Combining ATAC-seq with nuclei sorting for discovery of cis-regulatory regions in plant genomes. Nucleic Acids Research. 45 (6), e41 (2017).
- Lara-Astiaso, D., et al. Chromatin state dynamics during blood formation. Science. 345 (6199), 943-949 (2014).
- Gate, R. E., et al. Genetic determinants of co-accessible chromatin regions in activated T cells across humans. Nature Genetics. , (2018).
- Sanjana, N. E., et al. High-resolution interrogation of functional elements in the noncoding genome. Science. 353 (6307), 1545-1549 (2016).
- Andrews, S. FastQC A Quality Control tool for High Throughput Sequence Data. Babraham Bioinformatics. , Available from: https://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc (2018).
- Bolger, A. M., Lohse, M., Usadel, B. Trimmomatic: a flexible trimmer for Illumina sequence data. Bioinformatics. 30 (15), 2114-2120 (2014).
- Langmead, B., Salzberg, S. L. Fast gapped-read alignment with Bowtie 2. Nature Methods. 9 (4), 357-359 (2012).
- Li, H., et al. The Sequence Alignment/Map format and SAMtools. Bioinformatics. 25 (16), 2078-2079 (2009).
- Broad Institute. Picard Tools. , Available from: http://broadinstitute.github.io/picard/ (2018).
- Quinlan, A. R., Hall, I. M. BEDTools: a flexible suite of utilities for comparing genomic features. Bioinformatics. 26 (6), 841-842 (2010).
- Stark, R., Brown, G. DiffBind: Differential Binding Analysis of ChIP-Seq Peak Data. , Available from: http://bioconductor.org/packages/devel/bioc/vignettes/DiffBind/inst/doc/DiffBind.pdf (2018).
- Corces, M. R., et al. An improved ATAC-seq protocol reduces background and enables interrogation of frozen tissues. Nature Methods. 14 (10), 959-962 (2017).
- Wu, J., et al. The landscape of accessible chromatin in mammalian preimplantation embryos. Nature. 534 (7609), 652-657 (2016).
