Summary
여기, 우리는 transposase 액세스할 수 chromatin (ATAC-seq) 활성화 된 CD4 + 인간 림프 톨에 시퀀싱에 대 한 분석 결과 수행 하는 프로토콜을 제시. 프로토콜은 새로운 세포의 용 해 버퍼의 도입을 통해 3%로 50%에서 미토 콘 드리 아 DNA 읽기 오염 최소화 하기 위해 수정 되었습니다.
Abstract
ATAC seq 신속 하 고 간단한 접근 방식 게놈 넓은 접근 chromatin 매핑 때문에 epigenetics의 연구에 널리 사용 되는 방법론 되고있다. 이 문서에서 우리는 미토 콘 드리 아 DNA 읽기 오염 감소 하는 향상 된 ATAC seq 프로토콜 제시. 이 프로토콜에 최적화 된 세포의 용 해 버퍼 감소 3%의 평균에 미토 콘 드리 아 DNA 오염 이전 ATAC seq 프로토콜 분투 하는 동안 50% 오염 미토 콘 드리 아 DNA의 평균이 읽습니다. 이 향상 된 ATAC seq 프로토콜 시퀀싱 비용에 가까운 50% 감소를 허용 한다. 시연 어떻게이 높은-품질 ATAC seq 라이브러리 활성화 된 CD4 + 세포에서 준비 될 수 있다 데이터 분석을 통해 전체 혈액에서 CD4 + 림프 구 분리에서 단계별 지침을 제공 합니다. 이 향상 된 ATAC seq 프로토콜 다양 한 셀 형식에에서 검증은 고 chromatin 접근성을 공부 하는 연구원에 즉시 사용 될 것입니다.
Introduction
Transposase 액세스할 수 chromatin (ATAC-seq)을 시퀀싱에 대 한 분석 결과 빠르게 chromatin 구조 질의 대 한 주요 방법 되고있다. ATAC seq tagmentation, 분할 및 라이브러리는 시퀀싱 전체 게놈에서 chromatin 내게 필요한 옵션 확인 수를 생산 하는 동일한 효소에 의해 DNA의 태그의 과정을 통해 액세스할 수 있는 chromatin의 영역을 식별할 수 있습니다. 이 tagmentation 과정만 인하 nucleosomic 입체 지 장 때문 chromatin의 오픈 지역 활동적인 Tn5 transposase에 의해 중재 됩니다. 그것은 삭감으로 Tn5 transposase를 PCR에 의해 빠른 라이브러리 건설과 게놈 넓은 접근 chromatin1,2의 다음-세대 시퀀싱 시퀀싱 어댑터를 삽입 합니다.
ATAC seq 비교적 간단 하 고 빠른 프로토콜, 품질 및 그 결과, 그리고 시작 물자 필요의 작은 금액에서 결정 될 수 있는 정보의 범위 chromatin 접근성의 영역을 결정 하기 위해 선호 되는 방법 되고있다. 비해 DNase seq3 (는 또한 게놈 넓은 chromatin 접근성), MNase-seq4 (오픈 게놈 지역에 nucleosome 위치 결정), 그리고 포름알데히드 중재 시 키-seq5, ATAC seq 빠릅니다, 저렴 하 고 쉽게 재현 가능한1. 그것은 또한 더 중요 한 시작 물자의 500 핵, DNase seq3에 필요한 50 백만 핵에 비해 몇 가지 작업. ATAC seq는 또한 전사 인자 바인딩, nucleosome 위치, 및 오픈 chromatin 지역1의 영역을 포함 하 여 다른 방법 보다 chromatin 아키텍처에 대 한 자세한 정보를 얻을 수가 있다. 효과적인, 단일 셀 ATAC seq 프로토콜은 유효성이 검증, 단일 셀 레벨6,7chromatin 구조에 정보를 제공.
ATAC seq 식물8, 인간9, 그리고 다른 많은 유기 체를 포함 한 연구와 세포 종류의 넓은 스펙트럼에 걸쳐 chromatin 아키텍처의 특성에 사용 되었습니다. 그것은 또한 질병 상태7의 후 성적인 규칙 식별에 중요 한 되었습니다. 그러나, 가장 널리 사용 되는 ATAC seq 프로토콜 오염 시퀀싱 읽기 미토 콘 드리 아 DNA의 주요 단점은 포함합니다. 일부 데이터 집합에서이 오염 수준 시퀀싱 결과1의 60% 만큼 높을 수 있다. ATAC seq7,,1011의 더 효율적인 응용 프로그램을 허용 하려면 이러한 오염 미토 콘 드 리아 읽기를 줄이기 위해 필드에 공동된 노력이입니다. 여기 우리 현재 3%, 미토 콘 드리 아 DNA 오염 속도 감소 시키는 작업을 처리 하는 향상 된 ATAC seq 프로토콜 시퀀싱 비용10에서 약 50%의 감소를 허용 합니다. 이것은 CD4 + 림프 구 분리 및 활성화 및 미토 콘 드리 아 DNA 오염 최소화에 중요 한 향상 된 세포의 용 해 버퍼의 유선형된 과정에 의해 이루어집니다.
이 modifiedATAC-seq 프로토콜은 다양 한 인간의 기본 주변 혈액 단 세포 (PBMCs)10, 인간의 기본 monocytes 그리고 마우스 수지상 세포 (미 발표)을 포함 하 여 기본 셀 유효성이 검증 되었습니다. 그것은 또한 사용 되었습니다 성공적으로 비 코딩 요소11의 클러스터 정기적으로 interspaced 짧은 구조 반복 (CRISPR) 화면에서 흑색 종 세포 라인이. 또한,이 프로토콜에서 설명 하 고 GitHub에 제공 된 데이터 분석 패키지 제공 새로운 경험과 연구를 도구 ATAC seq 데이터를 분석 합니다. ATAC seq 전체 게놈에서 chromatin 접근성을 매핑하는 데 가장 효과적인 분석 결과 이며 여기에 도입 된 기존 프로토콜에 대 한 수정 연구원 낮은 미토 콘 드리 아 DNA 오염, 높은-품질 데이터를 생성 하면 시퀀싱 비용을 절감 하 고 ATAC seq 처리량을 개선.
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Protocol
이 향상 된 프로토콜 데이터 분석 (그림 1)을 통해 전체 혈액의 시작 물자에서 CD4 + 세포의 ATAC seq를 수행 하기 위한 단계별 지침을 제공 합니다.
1. 전체 혈액에서 CD4 + T 세포의 고립
참고: 이 프로토콜에 대 한 시작 물자는 선정 될 시작 물자의 소스 연구 요구 사항에 따라 수 있도록 표준 절차를 사용 하 여 수집 하는 신선한 전 혈의 15 mL 이다. 필요에 따라 프로토콜을 확장 합니다. 미리 따뜻한 인산 염 (PBS) + 2% 태아 종 아리 혈 청 (FCS) 실내 온도 (RT)를 버퍼링 하 고 CD4 + T 세포 농축 절차를 시작 하기 전에 rt 원심 분리기를 조정 합니다.
- 15 ml 50 mL 원뿔 튜브에 전체 혈액의 인간의 CD4 + T 세포 농축 칵테일의 750 µ L을 추가 하 고 반전에 의해 부드럽게 혼합. 20 분에 대 한 RT에서 품 어. 부 화 완료 되 면 튜브에 15 mL PBS + 2 %FCS 추가 하 고 반전에 의해 부드럽게 혼합.
- 15 mL 밀도 매체의 신선한 50 mL 원뿔 튜브를 준비 합니다. 조심 스럽게 희석된 혈액 샘플 밀도 매체/혈액 인터페이스를 형성을 방해 하지 않도록 되 고 밀도 매체의 상단에 레이어. 1과에서 내림차순 브레이크 설정 가속 g 와 RT x 1200에서 20 분 동안 원심 분리기.
참고: 그것은 1과 밀도 매체에 셀 계층의 혼란을 피하기 위해 원심 분리기에 떨어져 브레이크 하강 가속도 설정 하는 중요 한. - 좁은 줄기 전송 피 펫을 사용 하 여 밀도 매체/플라즈마 인터페이스에서 농축된 CD4 + T 세포를 수집 합니다. 신선한 50 mL 원뿔 튜브에 수집 된 세포를 전송. X g 와 실시간 423에서 8 분에 대 한 수집 된 CD4 + T 세포를 원심
참고: 1.3 단계와 다음 단계를 모두를 ON 9 및 내림차순 브레이크에 원심 가속도 반환 해야 합니다. - 상쾌한 고 PBS + 2 %FCS 50 mL로 두 번 셀 펠 릿을 세척, 423 x g 및 실시간 삭제에서 8 분에 대 한 최종 상쾌한 centrifuging 세척 하 고 씻어 셀 펠 릿 2 ml PBS + 2 %FCS 일시 중단.
- hemocytometer를 사용 하 여 셀을 계산 합니다. ATAC seq를 계속 하려면 2.3 단계로 진행 합니다. 나중에 처리에 대 한 셀을 고정 하려면 1.6 단계를 진행 합니다.
- 1 백만 세포 당 신선한 냉동 매체 (FCS 90% + 10% 디 메 틸 sulfoxide)의 1 mL를 추가 합니다. 극저온 안전 튜브에 중간에 셀의 aliquot 1 mL. -80 ° c 하룻밤 느린 냉동 컨테이너에서에서 튜브를 배치 합니다. 다음 날, 장기 저장을 위한 액체 질소에 튜브를 전송 합니다.
참고: 1 백만 CD4 + T 세포는 전체 혈액의 원래 볼륨의 2 mL 당 격리 될 것입니다. 냉동 매체의 1 mL aliquots에 500000 셀을 고정 합니다. 모든 사용에 신선한 냉동 매체를 확인 합니다.
2. 활성화 하 고 CD4 + T 세포를 정화
참고: 이 급속 한 프로토콜을 활성화 하 고 CD4 + T 세포만을 정화에 대 한 48 h와 95% 가능한 결과 CD4 + T 세포를 활성화 해야 합니다. 4 ° c 원심 분리기에서 프로토콜을 시작 하기 전에 냉각 하십시오.
- 얼음이 그냥 녹아 때까지 1 유리병 (500000) 37 ° C 물 목욕에 있는 CD4 + T 세포의 해 동. 부드럽게 미리 따뜻하게 로스웰 파크 기념 연구소-1640 (RPMI-1640) 미디어 라 함 완전 RPMI 10 %fcs 보충의 9 mL를 포함 하는 15 mL 원뿔 튜브에 세포를 전송 합니다.
참고: 셀 DMSO에 노출을 피하기 위해 완전히 해빙 못하게 합니다. - G 와 4 ° C x 1500 6 분 원심 분리기 삭제는 상쾌한 고 부드럽게 완전 한 RPMI의 2 mL에 펠 릿을 일시 중단. 아래로 스핀을 반복 하 고 상쾌한, 삭제 부드럽게 완전 한 RPMI의 0.5 mL에 셀을 일시 중단.
- hemocytometer를 사용 하 여 셀을 계산 합니다. 완전 한 RPMI 50000 셀 96 잘 라운드 바닥판의 당 200 µ L에 접시를 가진 세포 현 탁 액의 밀도 조정 합니다.
참고: 하나에서 500 K CD4 + T 세포, 잘 당 200 µ L에서 50000 CD4 + T 세포의 접시 10 우물의 튜브를 고정. -
마그네틱 구슬 인간 T-활성 제 안티-CD3 및 안티 CD28 항 체와 활용 준비.
- 1.5 mL 튜브에 ATAC seq 샘플 당 인간 T-활성 제 CD3/CD28 구슬의 aliquot 12.5 µ L. 1 x PBS의 1 mL와 구슬 세척 하 고 1 분에 대 한 자석에 튜브를 놓습니다.
- 조심 스럽게 제거 맑은 상쾌한 삭제, 자석에서 튜브를 제거 고 13에서 구슬 중단 µ L ATAC seq 샘플 당 RPMI 완료.
참고: ATAC seq 샘플 처리의 수에 따라 필요한 구슬의 양을 계산 합니다. 이 프로토콜 당 500000 셀, CD3/CD28 구슬의 한 ATAC seq 샘플 구성 12.5 µ L를 요구 한다.
- CD4 + T 세포를 활성화 합니다. 2.1 ml 15 mL 원뿔 튜브에 완전 한 RPMI 매체의 500000 세포를 수집 하 고 미리 씻어 인간 T-활성 제 구슬의 12.5 µ L을 추가. 부드럽게 튜브를 거꾸로 하 여 혼합.
- 부드럽게는 메 마른 저수지와 접시 200 µ L 셀 당 다중 채널 피 펫을 사용 하 여 둥근 바닥 96 잘 접시의 구슬의 구슬 가진 셀 전송. 37 ° C, 5% CO2 배양 기에서에서 48 h에 품 어.
- 인큐베이션 게시물, 원심 x g 와 실시간 제거 100 µ L 당 96 잘 접시, 구슬 손실 보장을 취소 하기 전에 원뿔 튜브에 수집에서 잘 매체의 423에서 8 분 96 잘 접시. 나머지 100 µ L에서 셀 펠 릿을 resuspend 하 고 모두 1.5 mL 튜브에에서 수집 합니다.
참고: 활성화 된 T 세포의 10 우물 1 mL 볼륨에 수집 됩니다. - CD4 + 격리를 수행 합니다. 500000 셀 완전 RPMI의 1 mL에 미리 씻어 CD4 활용 된 구슬의 50 µ L를 추가 합니다. 피 펫, 구슬 및 셀을 결합 한다. 냉장고에서 4 ° C에서 20 분 동안 품 어. 구슬 및 셀 혼합 매 6 분 교 반 하십시오.
참고: 이 프로토콜은 500000 셀의 한 샘플에 대 한 사용 될. 두 개 이상의 500000의 샘플에 대 한 필요에 따라 조정 합니다. - 부 화 완료 되 면 2 분을 제거 하 고 상쾌한 때 분명 삭제에 대 한 자석에 튜브를 놓습니다. 자석에서 튜브를 제거, 1 mL의 PBS + 2 %FCS 구슬 바인딩된 셀을 중단, 1 분에 대 한 자석에 튜브를 교체 및 명확한 상쾌한 삭제 구슬 바인딩된 셀을 씻어. 3 세척의 총에 대 한이 프로세스를 반복 합니다.
참고: 수 세척 하는 동안 어떤 구슬을 무시 하지 않도록 주의 하십시오. - 최종 세척 후 1 분 제거에 대 한 자석에 튜브를 배치 하 고 삭제는 상쾌한 얼음에 펠 릿을 놓습니다. 섹션 3 (ATAC-seq)를 진행 합니다.
3입니다. ATAC seq
참고: 이 단계에서 핵 ATAC-이 대 한 활성화 된 CD4 + T 세포에서 격리 됩니다. 이 프로토콜에 사용 되는 세포의 용 해 버퍼 보다 효율적인 소화와 높은 품질의 결과 결과로 핵에 gentler 되도록 향상 되었습니다. 모든 원심 분리 단계 섹션 3에서에서 4 ° c.에 유지 고정 각도 원심 분리기와 수행 프로토콜을 시작 하기 전에 원심 분리기를 냉각 하십시오.
- 핵 격리를 수행 합니다. Resuspend 구슬 및 찬 세포의 용 해 버퍼 (10 mM Tris HCl, pH 7.4, 10 m m NaCl, 3 m MgCl2, 0.03% 폴 20 m)와 셀. 4 ° c.에서 10 분 동안 500 x g 에서 즉시 원심 제거 하 고 삭제는 상쾌한.
- Transposase 반응을 수행 합니다. 50 µ L Tn5 transposase 혼합 (표 1)의 고립 된 핵 펠 릿을 일시 중단 합니다. 들고 끝나면 4 ° C에서 40 ° C 뚜껑, 37 ° C에서 30 분 동안 thermocycler에서 품 어.
- Thermocycling, 후 즉시 다운 빠른 벤치탑 원심 분리기 회전을 수행 하 고 구슬 제품에서 제거 하려면 1 분에 대 한 자석에 튜브를 놓습니다.
- DNA 정화 열 튜브 자석에 분명 상쾌한 전송. 열 번 버퍼 PB의 250 µ L 고 버퍼 PE의 750 µ L로 두 번 씻는 다. 차입 버퍼의 10 µ L에서 샘플 elute 3.5 단계 직접 진행.
참고: 이 단계는 여기 ATAC seq 라이브러리 라고 합자 어댑터와 DNA 파편을 증폭 한다. NGS 차선에서 실행 되도록 여러 ATAC seq 라이브러리 다중화 하기 위해서는 모든 예제 및 개별 샘플 (표 2)에 대 한 다른 인덱싱된 뇌관 2 인덱싱되지 않은 뇌관 1을 사용 합니다. 프라이 머는 1.25 µ M의 농도 작업에 사용 됩니다. - Nuclease 무료 PCR 튜브, 순서와 볼륨에 지정 된 구성 요소를 결합 하 여 초기 PCR 증폭 반응 설정 표 3. thermocycler에 PCR 튜브를 놓고 표 4에 지정 된 대로 순환 조건 PCR 증폭 프로그램을 실행 합니다.
-
정량에 의해 반응을 모니터링 합니다. 정량 Pcr 반응 nuclease 무료 PCR 튜브, 순서 및 금액 표 5에 지정 된 구성 요소를 결합 하 여 설정 합니다. 정량 Pcr 기계과 지정 된 테이블 6으로 주기.
- 나머지 45 µ L 반응에 주기 추가 확대의 최적 수를 확인 하려면 x 축 및 y 축에 상대 형광 (RFU)에 주기 수와 음모를 만듭니다. 최적의 횟수 추가 확대의 3 분의 1 사이클 정량 반응 고원에 도달에 대 한 걸리는 수가입니다.
참고: 정량 Pcr 반응 모니터링 PCR 주기 GC 콘텐츠 및 크기 편견을 최소화 하면서 최적의 라이브러리 조각 확대를 원하는 최적의 수의 결정에 대 한 수 있습니다.
- 나머지 45 µ L 반응에 주기 추가 확대의 최적 수를 확인 하려면 x 축 및 y 축에 상대 형광 (RFU)에 주기 수와 음모를 만듭니다. 최적의 횟수 추가 확대의 3 분의 1 사이클 정량 반응 고원에 도달에 대 한 걸리는 수가입니다.
- PCR 반응의 나머지 45 µ L의 최종 PCR 증폭을 완료 합니다. 다시는 thermocycler에에서 단계 3.5에서에서 증폭 반응 PCR 튜브를 놓고 표 7에 설명 된 대로 프로그램을 실행 합니다.
참고: 이 프로토콜에서 설명 된 대로 처리 하는 샘플에 대 한 PCR 확대 주기의 최적의 총 수는 12 되도록 결정 되었다. - 증폭 완료 되 면 라이브러리 제조업체의 프로토콜, 차입 버퍼의 25 µ L에서 방출 다음 PCR 정리 키트를 사용 하 여 정화.
참고: 증폭된 라이브러리는 최대 48 h 4 ° C에서 저장 하거나 장기 저장을 위한-20 ° C에서 냉동 수 있습니다.
4. ATAC seq 도서관 품질 분석
참고: 그것은 품질과 수량 다음-세대 시퀀싱 하기 전에 시퀀스 (seq) ATAC 라이브러리의 유효성을 검사 하는 것이 중요입니다. 품질 및 수량 라이브러리의 상용 키트 ( 재료의 표참조)를 사용 하 여 평가 되어야 한다.
- 크기 조정, 정량화 및 DNA의 품질 관리에 대 한 마이크로-기반 플랫폼을 사용 하 여 ATAC seq 라이브러리의 양과 품질을 평가 합니다. 대표적인 품질 평가 결과 그림 2 를 참조 하십시오.
참고: ATAC seq 라이브러리의 농도 여야 > 품질 시퀀싱 결과 얻기 위해 µ 1 ng/L. 평균, 30 nM 25 µ L에 취득 했다.
5. 시퀀싱 및 데이터 분석
참고: 이 분석 파이프라인 읽기 매핑 절차의 품질을 제어 하 고 실험 설계에 대 한 좌표를 조정 하 고, 다운스트림 분석에 대 한 봉우리를 호출 수 있습니다. 다음은 명령 선 및 실행의 설명입니다. 데이터 분석 패키지 (https://github.com/s18692001/bulk_ATAC_seq)에서 이용하실 수 있습니다.
- 샘플 당 42 백만 읽기의 평균 읽기 깊이를 다음 세대 시퀀서에 준비 된 라이브러리 순서.
- FastQC12 소프트웨어 패키지 명령을 사용 하 여 생성 된 파일을 선택 하 여 연속 읽기의 품질을 예상:
fastqc-o < output_directory >< fastq_file > - 트림 읽기의 기초 Trimmomatic13 소프트웨어에 의해 필요한 경우, 명령을 사용 하 여 FastQC 품질 검사에 의해 결정으로 (대 한 쌍-엔드):
자바-병 < trimmomatic jar 파일 경로 > PE < input1 >< input2 >< 쌍된 output1 >< 홀된 output1 >< 쌍된 output2 >< 홀된 output2 > HEADCROP: < 자르기 기지 > - Bowtie214 소프트웨어에 의해 인간의 참조 게놈 (hg38)에 정렬:
bowtie2-x < 참조 게놈 >-< 입력된 쌍 1 >< 1 입력된 쌍 2 > < 출력 SAM 파일 > S
참고: 인수-x 참조 게놈에 대 한 인덱스의 basename 이며 샘 형식 출력-S입니다. - Samtools15 flagstat 패키지를 사용 하 여 매핑된 읽기의 품질 확인:
samtools flagstat < BAM 파일 > - 매핑된 읽기 파일을 정렬 하 고 중복 피16 도구를 사용 하 여 제거:
자바-picard.jar SortSam 입력 항아리 < 입력된 SAM 파일 이름 > = 출력 = < 출력 정렬 BAM 파일 이름 > SORT_ORDER 좌표 = "및" java-picard.jar MarkDuplicates 입력 항아리 < 정렬 된 BAM 파일 > = 출력 < 중복 없이 출력 BAM 파일 > = REMOVE_DUPLICATES = TRUE - 인덱스 BAM 파일을 사용 하지 않는 염색체 읽기 손질과 ATAC seq17의 실험적인 이유에 대 한 좌표를 이동:
자바-picard.jar BuildBamIndex 입력 자 = < BAM 파일 >
samtools idxstats < 입력 BAM 파일 > | -f 1을 잘라 | grep-v chrY | grep-v chrM | grep-v chrUn | xargs samtools 볼-b < 입력 BAM 파일 >>< 출력 트림 BAM 파일 >
bedtools bamtobed-i < 입력 손질 BAM 파일 >>< 출력 트림 침대 파일 >
awk ' 시작 {OFS = "\t"}; {만약 ($6 = = "+") 인쇄 $1, $2 + 4, 3 + 4 달러, $4, $5, $6, $1, $2-5, 3-5 달러, $4, $5, $6 다른 인쇄}' < 입력 손질 침대 파일 >< 트림 된 침대 파일 이동 > - 삭제 부정적인 조정으로 이동 하는 읽기:
awk '{if ($2 > 0) 인쇄 $1 "\t" $2 "\t" $3 "\t" $4 "\t" $5 "\t" 6 달러}' < 입력 침대 파일 >< 출력 음수가 아닌 조정 침대 파일 >. - 다음 DiffBind18 분석용 BAM 파일 침대 파일 변환:
bedtools bedtobam-< 입력 침대 파일 > i-g < 참조 게놈 >< 출력 BAM 파일 > - 최대 호출 수행 DiffBind18 소프트웨어 패키지에 의해:
macs2 callpeak-t < 입력 BAM 파일 >-f BAM-g hs-nomodel-nolambda-유지-dup 모든-전화-정상-outdir < 출력 디렉터리 경로 >-n < 출력 이름 >-B-q 0.01-bdg-shift-100-extsize 200
참고: 필터링 후 샘플 당 37 백만 읽기의 중간값을 기대 합니다. 미토 콘 드리 아 DNA 오염에서 0.30%-5.39% (평균 1.96%) 범위 것입니다. 곱하기 매핑된 읽기 (평균 6.7%-56%, 19%)의 낮은 속도 그리고 핵 사용의 상대적으로 높은 비율 (60%-92%, 평균 79%)를 읽습니다.
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Representative Results
신선한 전 혈의 15 mL에서이 프로토콜 1 백만 CD4 + T 세포의 평균을 생성합니다. 이들은 나중에 처리에 대 한 동결 하거나 즉시 사용 될 수 있습니다. 신선한 또는 해 동, CD4 + T 세포의 생존 능력은 일관 되 게 > 95%. CD4 + T 세포 고립의이 메서드는 소스 재료와 컬렉션 시간에 유연성에 대 한 수 있습니다. 이 향상 된 ATAC seq 프로토콜 시퀀싱 µ 1 ng/L 보다 큰 마지막 라이브러리를 생성합니다. 상업적으로 사용할 수 있는 시스템을 사용 하 여 수행 하는 품질 관리 200 및 1000 bp (그림 2) 사이의 DNA 파편을 입증 해야 합니다. 시퀀싱은 고품질 라이브러리만 수행 되어야 한다.
모든 라이브러리 샘플 당 읽기 40 백만 이상의 평균 깊이에 시퀀싱 했다. ATAC seq 프로토콜을 일반적으로 사용 되는 총 읽기1 시퀀싱의 50%-60%에서 범위 수 있습니다 미토 콘 드 리아 DNA 시퀀싱 읽기를 오염에 의해 도전을 받고 하는 동안이 향상 된 프로토콜 문제를 제거 합니다. 이 프로토콜에 따라 준비 하는 라이브러리 포함 평균만 3% 미토 콘 드 리아 읽기 (그림 3A). 높은 비율의 사용 가능한 읽기 생물 복제 (그림 3B)에 걸쳐 충분히 상수 이다. 프로토콜 생물 복제 (그림 4C, D) 뿐만 아니라 기술 복제 (그림 4A, B)에 걸쳐 높은 재현성 결과 제공할 수 있었습니다. 또한, CD4 + T 세포 활성화 제시를 위한 프로토콜 48 h 보다는 1 주일 이상 소요와 재현 시퀀싱 결과 (그림 4A, B)에 의해 증명으로 일관 되 고 효율적인 활성화 결과. 예측된 ATAC seq 봉우리는 정확 하 게 분석 파이프라인 (그림 4E)에 의해 호출 됩니다. 시퀀싱 결과 분석 인간 T 세포 활성화 동안 chromatin 상태에서 명확한 변경 확인. 오픈 chromatin의 차동 액세스할 수 지역 활성화 (그림 5)의 48 h 전후 6 샘플 사이 확인 되었다.
그림 1: 수정된 ATAC seq 프로토콜의 실험 개요. (A) 샘플 수집 및 처리, CD4 + T을 통해 환자의 전체 혈액의 15 mL에서 세포 격리, 도금 및 핵 격리 향상 된 세포의 용 해 버퍼 된 및 T 세포의 활성화. (B)는 transposase 반응 및 시퀀싱 라이브러리의 PCR 증폭 (C) 품질 분석, 시퀀싱, 그리고 데이터 분석. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2: 크기 조정, 정량화 및 DNA의 품질 관리에 대 한 마이크로-기반 플랫폼에서 대표적인 고품질 ATAC seq 라이브러리. 200 / 1000 기본 쌍 사이의 띠와 샘플 b 1과 d 1의 (A) 전자 젤 이미지. (B와 C) Electropherogram 추적 결과의 샘플 B1 (B) 및 D1 (C), 200 그리고 1000 기본 쌍 사이의 봉우리. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3: 가능한 DNA 시퀀싱 읽기 증가 향상 ATAC seq 프로토콜 결과 미토 콘 드리 아 DNA 오염 감소. 사용할 수의 (A) 비교 읽습니다 (보라색), 중복 읽습니다 (녹색), 그리고 미토 콘 드리 아 읽기 (레드) CD4 + T 세포 ATAC seq 문학에서 프로 파일링. (B) 비교 가능한 읽습니다 (보라색), 중복 (녹색), 미토 콘 드 리아 읽습니다 (빨간색), 읽어들이고 매핑되지 않은 읽기 (파란색) CD4 + t 세포 ATAC seq 여러 건강 한 개인에서 프로 파일링 (n = 22). 이 그림은 청 외.10에서 수정 되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 4: ATAC seq 프로토콜 재현성 및 정확도 향상. 2 unstimulated의 실험을 복제 하는 동안 chromatin 접근성 (ATAC seq 신호, x 및 y 축)의 음모를 피해 라 (A; 36,486 번째 봉우리) 또는 활성화 (B; 52,154 Thstim 봉우리) T 세포 기술 재현성을 보여줍니다. Chromatin 접근성 개인 IGTB1191에서 활성화 된 T 세포에 대 한 (y 축) 및 IGTB1190 (x 축) (C) 52,154 Thstim 피크 (D)에 대 한 개인의 모든 쌍 사이 상관 관계의 히스토그램 재현성을 보여줍니다 사이 개인. (E) ATAC seq 19 Q13.12 염색체에 우리의 향상 된 ATAC seq 프로토콜 이라는 봉우리. 이 그림은 청 외.10에서 수정 되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 5: CD4 + T 세포 활성화 후 chromatin 상태에서 변경의 대표 ATAC seq 결과. (A) 실험 개요 (왼쪽) 그리고 전문 어 (오른쪽). (위, 일) 전에 6 샘플 (행)에 열린 염색 질 (열)의 (B) 차동 액세스할 수 영역 (아래, Thstim) 후 48 h 기본 CD4 + T 세포의 활성화. 이 그림은 청 외.10에서 수정 되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
| TD 버퍼 x 2 | 25 Μ L |
| TN5 효소 | 5 Μ L |
| Nuclease 무료 물 | 20 Μ L |
| 총 볼륨 | 50 Μ L |
표 1: 단계 3.2 transposase 반응 구성 요소.
| Ad1_noMX: AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCGTCGGCAGCGTCAGATGTG |
| Ad2.1_TAAGGCGA CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTCGCCTTAGTCTCGTGGGCTCGGAGATGT |
| Ad2.2_CGTACTAG CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCTAGTACGGTCTCGTGGGCTCGGAGATGT |
| Ad2.3_AGGCAGAA CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTTCTGCCTGTCTCGTGGGCTCGGAGATGT |
| Ad2.4_TCCTGAGC CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGCTCAGGAGTCTCGTGGGCTCGGAGATGT |
| Ad2.5_GGACTCCT CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATAGGAGTCCGTCTCGTGGGCTCGGAGATGT |
| Ad2.6_TAGGCATG CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCATGCCTAGTCTCGTGGGCTCGGAGATGT |
| Ad2.7_CTCTCTAC CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGTAGAGAGGTCTCGTGGGCTCGGAGATGT |
| Ad2.8_CAGAGAGG CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCCTCTCTGGTCTCGTGGGCTCGGAGATGT |
| Ad2.9_GCTACGCT CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATAGCGTAGCGTCTCGTGGGCTCGGAGATGT |
| Ad2.10_CGAGGCTG CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCAGCCTCGGTCTCGTGGGCTCGGAGATGT |
| Ad2.11_AAGAGGCA CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTGCCTCTTGTCTCGTGGGCTCGGAGATGT |
| Ad2.12_GTAGAGGA CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTCCTCTACGTCTCGTGGGCTCGGAGATGT |
| Ad2.13_GTCGTGAT CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATATCACGACGTCTCGTGGGCTCGGAGATGT |
| Ad2.14_ACCACTGT CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATACAGTGGTGTCTCGTGGGCTCGGAGATGT |
| Ad2.15_TGGATCTG CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCAGATCCAGTCTCGTGGGCTCGGAGATGT |
| Ad2.16_CCGTTTGT CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATACAAACGGGTCTCGTGGGCTCGGAGATGT |
| Ad2.17_TGCTGGGT CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATACCCAGCAGTCTCGTGGGCTCGGAGATGT |
| Ad2.18_GAGGGGTT CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATAACCCCTCGTCTCGTGGGCTCGGAGATGT |
| Ad2.19_AGGTTGGG CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCCCAACCTGTCTCGTGGGCTCGGAGATGT |
| Ad2.20_GTGTGGTG CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCACCACACGTCTCGTGGGCTCGGAGATGT |
| Ad2.21_TGGGTTTC CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGAAACCCAGTCTCGTGGGCTCGGAGATGT |
| Ad2.22_TGGTCACA CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTGTGACCAGTCTCGTGGGCTCGGAGATGT |
| Ad2.23_TTGACCCT CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATAGGGTCAAGTCTCGTGGGCTCGGAGATGT |
| Ad2.24_CCACTCCT CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATAGGAGTGGGTCTCGTGGGCTCGGAGATGT |
표 2: ATAC seq oligos 디자인 PCR에 사용.
| Nuclease 무료 물 | 11.9 Μ L |
| 100 µ M 사용자 지정 Nextera 뇌관 1 (표 2) | 0.6 Μ L |
| NEBNext-고화질 2 PCR 마스터 믹스 x | 25 Μ L |
| ATAC Seq 라이브러리 | 10 Μ L |
| 25 µ M 사용자 지정 Nextera 뇌관 2 (표 2) | 2.5 Μ L |
| 총 볼륨 | 50 Μ L |
표 3: 단계 3.5 초기 PCR 반응 혼합.
| 사이클 단계 | 온도 | 시간 | 사이클 |
| 확장 | 72 ° C | 5 분 | 1 |
| 초기 변성 | 98 ° C | 30 s | 1 |
| 변성 | 98 ° C | 10 s | 10 |
| 어 닐 링 | 63 ° C | 30 s | |
| 확장 | 72 ° C | 1 분 | |
| 보류 | 4 ° C | 무한대 | 1 |
표 4: 단계 3.5 초기 PCR 증폭 순환 프로그램.
| PCR 반응 약 수 | 5 Μ L |
| 표 3 0.6 x Syber 녹색에서 PCR 칵테일 | 10 Μ L |
표 5: 단계 3.6 정량 Pcr 반응 혼합.
| 사이클 단계 | 온도 | 시간 | 사이클 |
| 초기 변성 | 98 ° C | 30 s | 1 |
| 변성 | 98 ° C | 10 s | 20 |
| 어 닐 링 | 63 ° C | 30 s | |
| 확장 | 72 ° C | 1 분 | |
| 보류 | 4 ° C | 무한대 | 1 |
표 6: 단계 3.6 정량 순환 프로그램.
| 사이클 단계 | 온도 | 시간 | 사이클 |
| 초기 변성 | 98 ° C | 30 s | 1 |
| 변성 | 98 ° C | 10 s | 으로 결정 |
| 어 닐 링 | 63 ° C | 30 s | |
| 확장 | 72 ° C | 1 분 | |
| 보류 | 4 ° C | 무한대 | 1 |
표 7: 최종 PCR 확대를 위한 단계 3.7 PCR 순환 프로그램.
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Discussion
이 문서에 제공 된 수정된 ATAC seq 프로토콜 최소한의 미토 콘 드리 아 DNA 오염 재현 가능한 결과를 제공 합니다. 프로토콜이 되었습니다 사용 성공적으로 인간의 기본 PBMCs10, 인간 monocytes, (미 출판), 마우스 수지상 세포의 염색 질 건축 특징 및 교양된 흑색 종 세포 라인11. 우리는이 향상 된 세포 예상 상태 뿐만 아니라 다른 세포 유형 대 일 가능성이 있다. 그것 또한이 핵 격리 프로토콜 단일 핵 ATAC seq 프로토콜, 시퀀싱 결과 개선 하는 미토 콘 드리 아 DNA 오염 최소화와 호환 된다는 것을 예상 된다.
이 수정된 프로토콜의 추가 혜택을 환자 샘플의 여부에 따라 서로 다른 시간에 PBMCs에서 고립 된 CD4 + T 세포의 배치를 동결 능력입니다. ATAC seq 다음 모든 샘플에서 동시에 수행할 수 있습니다, transposase 반응 및 시퀀싱에 잠재적인 배치 효과 바이어스 최소화10이다. 그 어 중간이 동결-해 동 프로토콜 달성 높은 생존 능력을 유지 하기 위해 각 사용 신선한 만들어질 중요 하다. 격리 된 CD4 + T 세포의 90% 이상 transposase 반응1일반적인 소화를 피하기 위해 있어야 합니다.
그 더 최적화 변수 셀 종류와 수량이이 프로토콜을 사용 해야 할 수 있습니다 note 하십시오. Tn5 transposase-핵 비율 최적화이 프로토콜에 500000 핵 핵의 다른 번호로 ATAC seq를 수행 하는 경우, 이후 Tn5 transposase의 양은 적절 하 게 조정 되어야 한다. 때문에 Tn5의 과잉 핵의 이상 세포 닫힌된 chromatin에서 높은 배경으로 이어질 수 있습니다 고 시퀀싱 라이브러리, 아래 세포 완전 한 PCR을 제공 하지 수의 낮은 복잡성 증폭 라이브러리1. 이러한 합병증을 피하기 위하여 주의 핵 계산을 수행 하 고 필요에 따라 Tn5 비율을 최적화 하는 것이 좋습니다. 추가 데이터 품질 향상, 정량 모니터링 하 여 PCR 증폭 사이클을 최적화 하기 위해 조언 된다. 경우 마지막 라이브러리 너무 많은 증폭 사이클, 바이어스 시퀀싱 데이터2에 도입 된 수 있습니다. 시간과 비용을 절약 하기 위해 차세대 시퀀싱 전에 ATAC seq 라이브러리의 적절 한 품질 관리를 수행 하는 것이 좋습니다.
같이 우리는, 수정 된 세포의 용 해 버퍼 미토 콘 드리 아 DNA 오염 감소에 열쇠 이며 다양 한 셀 형식에 효과적 이다. 다른 프로토콜 대체 세포의 용 해 버퍼7,19 또는 CRISPR 중재 미토 콘 드리 아 DNA 소모20의 집중 과정으로 미토 콘 드 리아 오염의 문제를 해결 했습니다. 우리의 대체 ATAC seq 프로토콜 시퀀싱 읽기 향상 된 세포의 용 해 버퍼의 미토 콘 드리 아 DNA 오염와 같은 액세스할 수 있는 기술을 만드는 ATAC seq의 단순의 보존에 노력에 기여 한다. RNA-seq 및 단일 셀 시퀀싱, ATAC seq epigenetic 레 귤 레이 션을 탐험을 위한 강력한 도구입니다. 이 ATAC seq 프로토콜을 개선 하 고 데이터 분석 패키지 시퀀싱 비용을 감소 하 고 높은 품질의 결과 생산 하는 데 도움이 됩니다.
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Disclosures
저자는 공개 없다.
Acknowledgments
우리는 기술 지원에 대 한 Atsede Siba를 감사합니다. C.S.C.는 NIH 그랜트 1R61DA047032에 의해 지원 됩니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1x PBS, Sterile | Gibco | 10010023 | Can use other comparable products. |
| 5810/5810 R Swing Bucket Refrigerated Centrifuge with 50 mL, 15 mL, and 1.5 mL Tube Buckets | Eppendorf | 22625501 | Can use other comparable products. |
| 96 Well Round Bottom Plate | Thermo Scientific | 163320 | Can use other comparable products. |
| Agilent 4200 Tape Station System | Agilent | G2991AA | Suggested for quality assessment. |
| Cryotubes | Thermo Scientific | 374081 | Can use other comparable products. |
| DMSO | Sigma | D8418 | Can use other comparable products. |
| Dynabeads Human T-Activator CD3/CD28 | Invitrogen Life Technologies | 11131D | Critical Component |
| Dynabeads Untouched Human CD4 T Cells Kit | Invitrogen Life Technologies | 11346D | Critical Component |
| Dynamagnet | Invitrogen Life Technologies | 12321D | Critical Component |
| FCS | Gemini Bio Products | 100-500 | Can use other comparable products. |
| High Sensitivity DNA Kit | Agilent | 50674626 | Suggested for quality assessment. |
| Magnesium Chloride, Hexahydrate, Molecular Biology Grade | Sigma | M2393 | Can use other comparable products. |
| MinElute PCR Purification Kit (Buffer PB, Buffer PE, Elution Buffer) | Qiagen | 28004 | Critical Component |
| Mr. Frosty | Thermo Scientific | 5100-0001 | Can use other comparable products. |
| NaCl, Molecular Biology Grade | Sigma | S3014 | Can use other comparable products. |
| NEBNext High Fidelity 2x PCR Master Mix | New England BioLabs | M0541 | Critical Component |
| Nextera DNA Library Preparation Kit (2x TD Buffer, Tn5 Enzyme) | Illumina | FC1211030 | Critical Component |
| Nuclease Free Sterile dH20 | Gibco | 10977015 | Can use other comparable products. |
| Polysorbate 20 (Tween20) | Sigma | P9416 | Can use other comparable products. |
| PowerUp SYBR Green Master Mix | Applied Biosystems | A25780 | Critical Component |
| Precision Water Bath | Thermo Scientific | TSGP02 | Can use other comparable products. |
| QIAquick PCR Purification Kit | Qiagen | 28104 | Critical Component |
| Qubit dsDNA HS Assay Kit | Invitrogen Life Technologies | Q32851 | Suggested for quality assessment. |
| Qubit FlouroMeter | Invitrogen Life Technologies | Q33226 | Suggested for quality assessment. |
| Rosette Sep Human CD4+ Density Medium | Stem Cell Technologies | 15705 | Critical Component |
| Rosette Sep Human CD4+ Enrichment Cocktail | Stem Cell Technologies | 15022 | Critical Component |
| RPMI-1640 | Gibco | 11875093 | Can use other comparable products. |
| Sterile Resevoir | Thermo Scientific | 8096-11 | Can use other comparable products. |
| T100 Thermocycler with Heated Lid | BioRad | 1861096 | Can use other comparable products. |
| Tris-HCL | Sigma | T5941 | Can use other comparable products. |
References
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