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Cancer Research

腫瘍細胞の横尾静脈注入後の肺転移の病理学的解析

Published: May 20, 2020 doi: 10.3791/61270
Automatic Translation
1, 1, 2, 1
1Department of Radiation Oncology, Arthur G. James Comprehensive Cancer Center and Richard L. Solove Research Institute, The Ohio State University Medical Center, 2Department of Veterinary Biosciences, Comparative Pathology and Digital Imaging Shared Resource, The Ohio State University

ERRATUM NOTICE

Summary

癌細胞の静脈内注射は転移研究でよく用いられるが、転移性腫瘍の負担は分析が難しい。本明細書において、転移の尾静脈注入モデルを示し、生じる転移性肺腫瘍の負担を分析する新しいアプローチを含む。

Abstract

ほとんどのがん患者の罹患率と死亡率の主な原因である転移は、マウスの前臨床的にモデル化するのが難しい場合があります。自然転移モデルはごくわずかです。したがって、適切な細胞株の尾静脈注入を伴う実験転移モデルは転移研究の主力である。癌細胞が横尾静脈に注入されるとき、肺は植民地化の彼らの好ましい部位である。この技術の潜在的な制限は、転移性肺腫瘍の負担の正確な定量化である。一部の研究者は、事前に定義されたサイズのマクロ転移を数える、または/または組織の切除後の微小転移を含むが、他の研究者は正常な組織領域に対する転移性病変の領域を決定する。これらの定量方法はいずれも転移負担が高い場合に非常に困難な場合があります。本明細書において、画像解析ソフトを用いて転移性腫瘍負担を定量化するための高度な方法を用いて、肺転移の静脈内注射モデルを示す。このプロセスにより、平均転移サイズ、転移の総数、総転移領域など、複数のエンドポイントパラメータを調査して包括的な分析を行うことができます。さらに、この方法は、正確性を確保するために、米国獣医病理学者会(SEK)によって認定された獣医病理学者委員会によって見直されました。

Introduction

非常に複雑で非効率的なプロセス1であるにもかかわらず、転移は癌患者の罹患率と死亡率に大きく寄与する2である。実際、ほとんどの癌関連死は、疾患の転移性広がりに起因する3,4である。腫瘍細胞が正常に転移するためには、一次部位から切り離し、隣接する間質を通って侵入し、血液循環またはリンパ管に浸潤し、二次部位の毛細血管床に移動し、二次組織に飛び出し、増殖または成長して転移病変を形成する必要がある。マウスモデルの使用は、転移性播種および成長を担う分子機構の理解を深める上で重要であった6,7。ここでは、遺伝子組み換えマウスモデルと移植方法の両方がしばしば使用される乳がん転移に焦点を当てています。

遺伝子組み換え乳腺腫瘍モデルは、MMTV-LTR(マウス乳腺腫瘍ウイルス長末反復)およびWAP(乳清酸性タンパク質)を含む乳腺特異的プロモーターを利用して、乳腺上皮8の遺伝子導入の発現を促進する。ポリオーマ中期T抗原(PyMT)、ErbB2/Neu、c-Myc、Wnt-1、シミアンウイルス40(SV40)を含む腫瘍遺伝子は、この方法で発現されており、これらの遺伝モデルは原発性腫瘍の開始および進行を研究するのに有用であるが、遠くの器官に容易に転移する。さらに、これらの遺伝的マウスモデルは、多くの場合、自発的または実験的な転移モデルよりも時間とコストが非常に高いです。転移を研究する最も遺伝子組み換え乳腺腫瘍モデルの限界を考えると、移植技術はこの複雑なプロセスを研究する魅力的な方法となっています。これには、適切な細胞株の正交性、尾静脈、心臓内注射、頭蓋内注射が含まれる。

いくつかの乳癌細胞株は、乳腺脂肪パッド14,15への交所注入後に容易に転移するが、転移性腫瘍負担の一貫性および再現性は困難であり、そのような研究の持続期間は数ヶ月のオーダーで可能である。肺転移を評価するために、特に、尾静脈への静脈内注射は、典型的には数週間のスパンで起こる転移性広がりを伴うより再現性が高く、時間効果の高い方法である。しかし、静脈内注入モデルは転移性カスケードの初期ステップをバイパスするので、これらの研究の結果を解釈する際に注意が必要である。本デモでは、乳腺腫瘍細胞の尾静脈注射と、正確かつ包括的な分析方法を示す。

研究コミュニティは乳がん転移の複雑なプロセスを理解する上で大きな進歩を遂げましたが、現在150,000人以上の女性が転移性乳癌を持っていると推定されています16。ステージIV乳癌の患者のうち、>36%の患者が肺転移17を有する。しかし、部位特異的パターンおよび転移の発生率は、分子サブタイプ18、19、20、21に基づいて変化する可能性がある。乳癌関連肺転移を有する患者は、この疾患に対する有効な治療法および新規バイオマーカーを同定する必要性を強調するわずか21ヶ月の生存期間の中央値を有する17。腫瘍細胞の静脈内注射を含む実験的転移モデルの使用は、この重要な臨床的課題に関する我々の知識を引き続き進める。デジタルイメージング病理と、このプロトコルに記載されている転移性肺腫瘍負担分析の方法と組み合わせると、尾静脈注射は乳癌転移研究にとって貴重なツールです。

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Protocol

動物の使用は、OSU機関動物の世話と使用委員会(IACUC)承認プロトコル2007A0120-R4(PI:ジーナ・サイズモア博士)の下で大学実験動物資源(ULAR)規制に従いました。

1. 乳がん細胞の尾静脈注射

  1. 注射用細胞および注射器の調製
    1. 使用するマウスの数と細胞濃度に基づいて適切な数の細胞をプレートします。
      注: 注入される細胞の数と転移の発生に要する時間は、使用される細胞のラインによって異なっており、最適化する必要があります。本デモでは、1 x 106個のMDA-MB-231細胞を NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ(NSG)マウスに静脈内注射し、注射後24日以上で巨視的な肺病変が観察される。MVT1マウス乳腺腫瘍細胞株17に対して、3 x 106細胞が免疫に優れたFVB/Nマウスに注入され、14日22,23で多数の肺転移が観察される。
    2. 吸気培地と1x PBSで細胞プレートをすすいだ。細胞を最小量でトリプシン化し、適切な量の培地を加え、造馬計または別の好ましい方法を用いて細胞を数える。トリパンブルー(0.4%)または他の生きている/死んだ細胞色素を使用して、生存可能な細胞数を決定することができます。
    3. ペレット細胞は180xgで5分間回転する。
    4. 1回のマウスに100 μLの体積が注入されるよう、滅菌1x PBSの細胞の適切な数を再中断します。生存率を維持するために、細胞懸濁液を氷の上に保管してください。
    5. 注入する前に、凝集を避けるために200 μLまたは1 mLピペットで細胞を十分に再懸濁させる。28Gインシュリンシリンジで100μLを引き上げる( 材料表参照)。
    6. シリンジを垂直に保ち、シリンジをタップし、プランジャーをゆっくりと調整して、気泡を除去します。静脈への気泡の注入は、致命的な可能性がある空気/ガス塞栓症を引き起こす可能性があります。
  2. 横尾静脈注射
    注:実験的な乳癌転移アッセイの場合、注射は生後6週齢の雌マウス>に対して行われる。
    1. 尾でマウスを処理し、適切なサイズのスロットチューブ/拘束装置に動物をスライドさせます(使用する拘束装置 については、材料表 を参照)。
    2. 拘束装置のプラグ部分を挿入し、横方向の尾静脈が見えやすいような側にマウスを置きます。マウスは生殖器、後部静脈、および2つの側尾静脈に沿った腹側動脈を有する。
    3. 無菌ワイプでマウスの尾の表面をきれいにします。人差し指と親指の間の尾を非支配的な手で握り、わずかな緊張を加えます。
    4. 尾の遠位部分から始まり、ベベルが終わる静脈に平行に針を挿入します。
    5. 許可されている場合は、 慎重に 針を要約し、20〜30°の角度に曲げ。片手でアプローチまたは針のリタッピング装置を強くお勧めします。
      注:これは静脈が崩壊する可能性があるため、吸引する必要はありません。しかし、最初に置かれたときに血の小さなフラッシュが見られるかもしれません。針は適切な配置で静脈にスムーズに進みます。
    6. ゆっくりと静脈に完全なボリュームを分配します。プランジャーを押しても抵抗があってはならない。
    7. 抵抗が感じられる場合は、速やかに注射針を取り外します。必要に応じて、尾部の近位端または反対側の側面静脈に向かって移動する針(理想的には3回以下)を再挿入します。
    8. 少量の血液は、注射後に置き換えられる可能性が高い。滅菌ガーゼで穏やかな圧力をかけ、無菌ワイプで拭きます。
    9. 適切なシャープ容器に注射器を速やかに処分する。
    10. 清潔で換気の良いケージにマウスを戻し、苦痛の兆候を監視します。
    11. マウスの転移形成(呼吸困難、姿勢のハンチ、体重減少)および一般的な苦痛の徴候を、週2~3倍に監視する。転移の発生までの時間は、細胞株とマウス株に依存します。
    12. in vivo生きた動物イメージング装置を用いる場合、尾静脈注射直後の画像マウスは、細胞の正常な注入を確認し、時間「ゼロ」データを得る(インビボ生物発光イメージングに関する具体的な詳細はここに含まれていないが、Yangらららによって記載されている)。

2. 肺組織の固定と転移性肺腫瘍の負担の解析

  1. 組織病理学のための肺の構造様式を維持するための肺組織の膨張
    1. 承認された安楽死手順(例えば、チャンバー容積/分の30〜70%の変位で二酸化炭素)が続いた後、マウスの死骸をピンで解剖板に固定します。スプレーまたは70%エタノールを適用して、解剖中にマウスの毛皮を邪魔さないようにします。
      注:二酸化炭素窒息は、特に遅い流速で、期待される背景病変として肺出血を引き起こす可能性があります。
    2. 正中線切開で胸郭を開き、腹膜を通して切開を頸部/尾様に伸ばし、xyphoidプロセスをつかんで横隔膜を切り取る。
    3. 刃を鈍らせないように別のハサミのセットを使用して、胸骨の両側に沿って肋骨を切断し、慎重に肺が拡大するための余地を残す肋骨ケージを取り除きます。
    4. 下顎下唾液腺とインフラヒロイド筋肉を除去することによって気管を分離します。気管の両側にピンを置くと、針の挿入中に不要な動きを防ぐことができます。
    5. 26 G シリンジに 2~3 mL の 10% 中性緩衝ホルマリンを充填し、気管に挿入します。
    6. ゆっくりとホルマリンを注入し、肺が拡大するのを見てください(通常、ホルマリンの約1.5 mLが必要です)。
    7. ホルマリンが肺から漏れ始めたら(インフレを避ける)、鉗子で気管をつまみ、注射針を取り外し、呼吸器装置全体を取り外します。組織の追加のトリミングが後に行うことができるように、肺、心臓などをホルマリンに直接入れる。
    8. 完全な処理、埋め込み、組織の切片、および標準的な方法を使用してヘマトキシリンおよびエオシン(H&E)染色。
  2. 転移性肺腫瘍の負担の解析
    1. H&E染色された肺のセクションを、40倍の倍率で高解像度のスライドスキャナーでスキャンします(図3)。
    2. 肺転移の定量化のための画像解析ソフトウェア(例えば、Visiopharm画像解析)に画像をインポートします。
      注: 新しいユーザーは、画像解析ソフトウェアを使用するためにオンサイトまたはオンラインのトレーニングを受けることをお勧めします。市販のウェブページからも多数のウェビナーが利用できます。
    3. ソフトウェアのアプリライブラリから、Visiopharm 10118 H&E肺転移アプリを選択します。
      注:このアプリの目的は、H&E染色されたスライドに肺転移をラベル付けし、定量化することです。10118 H&E肺転移アプリの一部として、最初の画像処理ステップは、組織検出アプリで肺組織をセグメント化します。第二の画像処理ステップは、肺組織内の転移を識別する転移検出アプリを使用しています。転移は、形状が間違っている領域、赤すぎる領域、または転移として識別するにはまばらすぎる領域と共に識別されます。
    4. 形状とスパースを定義するパラメータを調整して、代表的な画像に最適にフィットします。腫瘍転移および正常肺組織のセグメント化領域は、組織タイプごとに異なる色ラベルを使用して表示することができる。
      注: アプリが正常な肺組織から正確に転移を分離できない場合、Visiopharm Decision Forest プログラムを使用するカスタム アプリは、実験で行われたように記述する必要があります ( 図 2 および 図 3 を参照)。カスタム アルゴリズムを記述する詳細は以下のとおりです。それ以外の場合は、ステップ 2.2.9 に進みます。
    5. 所望の画像上の複数の クラス (すなわち、肺組織(非腫瘍性)、転移、赤血球、上皮、および/または白いスペースを訓練することによって動作するDecision Forestプログラムを開きます。 図2では、腫瘍転移は青色、正常組織は緑色、気管支上皮は黄色である。また、赤血球は赤と空気空間にピンク色です。
    6. プロンプトされた一連のイエスまたはノーの質問に従って、各 クラス を適切に画像に合わせて訓練します。アルゴリズムの精度は、イエス/ノーの質問の数を決定します。分析のために、カスタム アルゴリズム/アプリは 50 (範囲 0 から 100) に設定された精度で書き込まれました。
    7. アルゴリズム/App. Visiopharm は、機能と呼ばれる 1 つまたは複数のレンズを通じて各クラスを表示する精度を高めるために、シャープ、ぼかし、形状による並べ替えなどを行うフィルターを適用して、各クラスの機能を調整します。特徴は、特定の色や強度を引き出すために、クラスが画像を見る方法を変更します。
      注: カスタムアルゴリズムでは、8500 μm2 以上のメタスタは、メタスタとしてラベル付けされ、測定されます。これは、サイズの差異と転移が小さすぎて検出できない場合を示します。小さな誤った形状の領域と8500 μm2 の下の小さな転移領域は、正常な組織定量に含まれていた。
    8. アプリまたはカスタムアルゴリズムのいずれかから変更された設定を保存し、その後、全体のセットまたは一連のH&E染色組織にアルゴリズム/アプリを適用します。
    9. 最後に、 表 1 に示した出力変数を含むすべての出力変数をエクスポートします。ミクロン二乗(μm2)の面積は、組織タイプごとに定量化することができ、パーセンテージは標本の総正味組織面積(すなわち、総組織から空気空間を差し引いた)に由来する。
    10. カスタムアルゴリズムを作成する場合は、米国獣医病理学者の米国大学によって認定された獣医病理学者の理事会と協議して組織マークアップをレビューし、正確な測定を保証し、組織タイプを区別します。

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Representative Results

尾静脈注射に標識されていない細胞を用いる場合、(1)マクロメタスターゼが観察される場合は壊死時まで肺の植民地化を確認することが困難であり、顕微鏡転移が存在する場合は(2)組織学的分析に従う。広範な転移性肺腫瘍の負担で、マウスは呼吸を働かされるであろう。他の腫瘍研究と同様に、マウスは研究期間中を通して注意深く監視されるべきである。標識された細胞の使用は、成功した尾静脈注射を確認する簡単な方法です;したがって、デモでルシメラーゼタグ付きMDA-MB-231細胞を使用する。しかし、インビボイメージングは、実験計画やその他の要因に応じて必ずしも可能または必要とは限らない。 図1Aは 、正確な注入の確認として、ルシメラーゼタグ付きMDA-MB-231細胞の尾静脈注入後2時間未満の胸腔における生物発光シグナルを示す。この実験では、胸部領域の光子数は時間の経過とともに増加し、強力な生物発光シグナルは24日目の注射後に存在する(図1BおよびC;スケールバーの変化に注意する)。壊死時には、これらのマウスでは多くの巨視的な肺病変が観察された(図1D)。

適切な組織処理と染色後、H&E染色された肺切片をスキャンまたは画像化することができます。転移性肺腫瘍の負担定量は、画像解析ソフトとカスタムアルゴリズムを用いて効果的に達成できる。カスタマイズされたアルゴリズムを使用して、肺組織全体が異なる組織特徴によってセグメント化される(図2AおよびB)。このようにして肺組織を分別することにより、ソフトウェアは 、表1に示す様々なパラメータを定量化することができる。この分析は、MDA-MB-231細胞を注射したマウスから肺組織に対して行われ、続いて転移性コロニー形成または車両制御(DMSO)を遮断するように設計された薬物による治療が行われた。この分析の生データを 表2に示す。さらに、 図3A は、DMSOまたは薬物処理マウスのいずれかからのMDA-MB-231肺転移の代表的なH&E画像を示す。これらの治療群間の転移性腫瘍の負担の差は、肺結節の総数が変わらないので見落とされやすいかもしれませんが、全てのパラメータの包括的な分析は、正味肺転移面積の割合に有意差を示しています(図3B,C)。これは、本明細書に記載されている方法のような転移性肺腫瘍の負担を分析するための包括的かつ徹底的なアプローチの必要性を強調する。

図3に示すデータについては、すべての統計分析をグラフパッドプリズム7を用いて行った。データは、次の標準的な正規性テストのいずれかに合格したときに正常に分布していると考えられました: ダゴスティーノピアソンオムニバス, シャピロ・ウィルク, コルモゴロフ・スミルノフ.車両と薬物処理群の比較(図3)は、ペアになっていない両手の学生のt検定によって行われた。統計的有意性はP≤0.05で確立された。

Figure 1
図1:インビボにおける自己発光の成功した尾静脈注入の確認。
(A)ルシファーゼタグ付きMDA-MB-231細胞の尾静脈注射の1時間後のマウスにおける代表的な生物発光シグナル。(B)ルシファーゼタグ付きMDA-MB-231細胞の尾静脈注射の24日後に(A)と同一のマウスセットにおける代表的な生物発光シグナル。[(A)と(B)の間のスケールバーの変化に注意してください。(C)MDA-MB-231尾静脈注入マウスにおける経時の光子数の定量化。誤差範囲は、SEM±平均値(n=8匹)(D)壊死時の肺における代表的な非腫瘍性肺組織(右)およびMDA-MB-231マクロメタスタ(左)を表す。スケールバー= 50 mm. この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

Figure 2
図2:Visiopharmソフトウェアを用いた組織のセグメンテーション
(A) カスタマイズされたソフトウェアアルゴリズムを使用した、セグメント化されていない組織マークアップとセグメント化された組織マークアップの代表的なスニップ。(B) ソフトウェアを使用してセグメント化されたすべての組織カテゴリの凡例。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

Figure 3
図3:H&E染色組織の代表的な転移性肺腫瘍負担分析。
(A) MDA-MB-231細胞の尾静脈注射後の未注射マウスおよびコントロール(DMSO)および薬物処理マウスからの肺組織の代表的なH&E染色。代表的な腫瘍転移は矢印で示される。スケールバー= 4倍の倍率で500 μm、10倍の拡大に200 μm。(B)コントロールおよび薬物処理マウスの割合正肺転移領域のグラフ。エラーバーは、学生±t検定によるSDの平均値(*) P = 0.022を表します。(C)転移性肺腫瘍負担分析を要約した表(n=9 DMSO;n=9薬物治療)。データの正規分布をチェックした後、表内のすべての P値は、ペアになっていない、両側のスチューデントのt検定によって決定されました。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

パラメーター 形容
全組織面積 (μm2) すべての腫瘍転移、正常な肺および赤血球の領域を含む正方形のミクロンの領域。
転移数 肺組織内の転移の総数。
転移面積率(μm2) 総転移面積を正味組織面積x100で割った。
全組織+ ホワイトスペース領域 (μm2) すべての組織および白いスペースを含む正方形のミクロンの区域。
ネット組織面積(μm2) 白いスペースおよび赤血球なしで正方形のミクロン(会合および正常肺)のティッシュ領域。
総転移面積 (μm2) 決定の森アルゴリテムによってセグメント化された正方形のミクロン中の総転移領域。
平均転移領域 (μm2) 各画像内の転移の平方ミクロン中の平均面積(平均)。
中央値転移領域 (μm2) 平方ミクロン中の中央値転移領域。同じ数の転移がこの値を下回り、同数の転移が中央値より大きい。

表1:ソフトウェアで測定したパラメータ カスタム アルゴリズムを使用して計算される各測定値の説明と共にパラメーターの一覧。

滑る 転移数 転移面積率(μm2) 全組織+ ホワイトスペース領域 (μm2) 合計ホワイトスペース(μm2) ネット組織面積(μm2) 総転移面積 (μm2) 赤血球領域(μm2) 平均転移面積 (μm2) 中央値転移領域 (μm2)
171肺スライド1 435 8.90 185698000 83201800 92031400 8189250 10464800 18825.86 14748.73
171肺スライド2 323 8.37 185698000 83201800 92054740 7708990 10441460 23866.84 14748.73
172肺スライド1 151 2.73 181546000 89509904 81571296 2225220 10464800 14736.56 12486.37
172肺スライド2 142 2.60 170708000 81735504 80558196 2093040 8414300 14739.72 12119.62
173 肺スライド1 634 11.60 234104992 102153000 115606692 13406800 16345300 21146.37 15472.22
173 肺スライド2 667 12.70 223180992 86778600 122374592 15542700 14027800 23302.40 16531.00
174 肺スライド1 40 0.55 192452992 80340896 87591096 485121 24521000 12128.03 10484.05
174 肺スライド2 34 0.51 183918000 71287904 91242796 464830 21387300 13671.47 11181.81
175 肺スライド1 780 23.93 179544992 44799200 126995782 30388600 7750010 38959.74 19307.76
175 肺スライド2 1001 12.58 169191536 43425608 120610754 15169100 5155174 15153.95 19703.08
188肺スライド1 569 13.20 162290000 54210000 98486310 12997300 9593690 22842.36 14463.91
188肺スライド2 271 5.15 157146000 54250800 91996500 4738100 10898700 17483.76 12657.83
189肺スライド1 74 1.70 185292992 95700800 77779392 1318820 11812800 17821.89 14551.08
189肺スライド2 74 1.76 182272992 95700800 74759392 1318820 11812800 17821.89 14551.08
816 肺スライド1 246 5.65 185876000 87568896 81916204 4631050 16390900 18825.41 14371.99
816 肺スライド2 565 6.05 183220000 76954304 90305396 5462670 15960300 9668.44 14244.82
876 肺スライド1 468 10.36 208308000 99300096 100947064 10454500 8060840 22338.68 16011.37
876 肺スライド2 528 11.74 199750896 81642568 110450391 12963400 7657937 24551.89 16699.13
877 肺スライド1 732 17.98 219340992 99918600 107869992 19397100 11552400 26498.77 18137.52
877肺スライド2 605 14.64 207925504 88539712 108168329 15839700 11217463 26181.32 18014.64
878 肺スライド1 377 10.05 178534000 85610896 81931104 8232340 10992000 21836.45 16671.03
878 肺スライド2 376 9.88 170544000 75337904 86108406 8511710 9097690 22637.53 16754.38
879 肺スライド1 205 5.22 167556000 89999000 68123630 3553860 9433370 17335.90 13845.69
879 肺スライド2 213 4.64 167931008 80789400 78489588 3638720 8652020 17083.19 14058.12
881肺スライド1 1122 38.81 218880000 79713504 130893816 50802300 8272680 45278.34 22044.99
881肺スライド2 628 21.67 184200992 74502600 99122692 21475200 10575700 34196.18 19857.40
882 肺スライド1 678 24.05 194476992 83941904 98484788 23684500 12050300 34932.89 20748.06
882 肺スライド2 645 21.93 185537040 75790040 101412430 22241700 8334570 34483.26 20325.11
883 肺スライド1 429 10.79 179400992 84955696 84699866 9138800 9745430 21302.56 15080.23
883 肺スライド2 342 85.30 175220992 76210896 90472386 77170200 8537710 225643.86 17078.26
884 肺スライド1 359 6.42 206751008 87752600 103825008 6669710 15173400 18578.58 14333.41
884 肺スライド2 480 9.12 200990000 77052496 111060804 10125700 12876700 21095.21 15679.88
885 肺スライド1 332 7.79 191398000 92896304 84752596 6605490 13749100 19896.05 14500.11
885 肺スライド2 537 81.02 187475008 85938000 89378408 72411104 12158600 134843.77 15360.29
886 肺スライド1 305 7.93 158435008 80433296 76541662 6068720 1460050 19897.44 14500.11
886 肺スライド2 898 8.84 155460000 70808600 83457470 7380490 1193930 8218.81 14744.92

表2:結果の代表表 MDA-MB-231細胞を注射したマウスの尾静脈のコホートからのアルゴリズムの各パラメータの結果の表。

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Discussion

研究者が転移の実験モデルとして腫瘍細胞の静脈内注射を使用し続ける中で、得られた転移性腫瘍の負担を分析するための標準的な慣行は欠けている。場合によっては、特定の細胞株の操作や化学化合物の使用時に転移性腫瘍の負担に有意な差が認められる。しかし、他の例では、転移性播種と成長の微妙な違いは、徹底的な病理学的分析なしに見落とされたり、誤って解釈されたりする可能性があります。この研究は、転移性肺腫瘍負担分析の包括的な方法を含めることによって、以前に発表された尾静脈注射プロトコルを進める。重要なことに、このデジタル病理解析法は、自発的転移が可能な腫瘍細胞の交所注入後の肺転移性腫瘍負荷の定量化、ならびに他の実験転移モデル(すなわち心臓内等)および患者由来異種移植片(PDX)モデルにも適用できる。獣医病理学者によるデジタル画像化およびソフトウェアアルゴリズムの開発の使用は転移性肺腫瘍の負担25を分析するためにこのアプローチの再現性、正確さおよび徹底を保障する。

以前に発表された研究または慎重な実験最適化のいずれかに基づいて細胞株、細胞濃度、およびエンドポイントの思慮深い決定は絶対に必要です。転移性播種およびコロニー形成は、種々の免疫細胞集団26,27との相互作用に大きく依存していることを考えると、免疫能力のあるマウスの使用は理想的であるが、必ずしも実現可能ではない。同じ理由から、主要な免疫細胞成分を欠くアミチミックマウスまたはNSGマウスを用いた実験的転移研究の解釈も慎重に行う必要がある。この研究で使用されたMVT1細胞を含むいくつかのマウス乳腺腫瘍細胞株があり、FVB/Nマウス株22,28,29に由来している。他の同系モデルも存在します。細胞濃度に関しては、多数の細胞の注入は、転移性肺腫瘍の負担を大幅に加速し、増強し得る。しかし、肺が圧倒されると、個々の転移性病巣を区別することが困難であり、塞栓症が発生する可能性が高い。また、尾静脈注射手順は、安全かつ/または日常的に注射を行う前に、十分な練習と訓練を必要とします。多くの機関は、技術的な訓練を提供し、練習目的のためにマウスを提供することができます。針の適切な配置と滑らかな注射は成功を示す必要があります。しかし、トレーニング/練習目的で、エバンスブルー染料は、正常な注射(滅菌PBSで1%)を決定するのに役立ちます。マウスの四肢は注射後すぐに青くなるが、その後動物は安楽死させるべきです。

さらに、画像解析ソフトウェアによるスライドのスキャンや解析を損なう可能性のあるスライドアーチファクトを制御および防止するための標準的な壊死および組織サンプリング技術の重要性は、十分に強調することはできません。壊死時の肺の膨張は、組織の完全性を維持する上で重要なステップであり、その後のH&E染色と最終分析を改善する。解像度と再現性を一貫性のある方法で行うには、スタディ セット内のすべてのスライドを同じ目的でスキャンすることをお勧めします。本研究では、アルゴリズム設定の正確性と、分析されたフィールドに適用された腫瘍転移の適切な同定を確実にするために、すべてのスライドを40倍でスキャンした。各スライドについて、同じ肺葉を一貫してスキャンし、各マウスについて分析した。また、病理学者が適用されたアルゴリズムの正確性について組織マークアップをレビューし、同じアルゴリズムを研究のすべてのスライドに適用することも強く推奨されます。

提示されたプロトコルは、実験設計、ユーザーの好み、および望ましい結果測定に従って変更することができます。そのような改変の1つは、意識的な動物のための従来の抑制装置ではなく麻酔誘導室の使用を含む。動物の健康とウェルネスの面では、どちらのアプローチも他のアプローチよりも優れていると、それぞれが利点の独自のセットだけでなく、制限30を持っています。また、黒色マウスまたは褐色マウスの場合、尾静脈を可視化するために光源または加熱装置が必要となる場合があります。赤外線ランプや温水浴は、静脈を拡張するために使用することができます。ただし、温度は注意深く監視する必要があります。さらに、げっ歯類の拘束装置の他の商業版と同様に利用できる照明付きの拘束装置がある。一部の研究者は、注射のためにLuer-Lok注射器を好みます.Luer-Lok注射器で気泡を除去することはより困難ですが、好みの問題です。細胞の生存率は、尾静脈注入手順の重要な考慮事項であり、したがって、正確な細胞数だけでなく、注入前に氷上の細胞を維持することが必要なステップである。肺の播種と操作された細胞株のコロニー形成を比較する場合、これらは結果の解釈を複雑にする可能性があるため、注射前に細胞サイズと生存率の違いを決定することが重要です。狭いゲージ針を使用すると、細胞死や損傷が発生する可能性があります。しかし、動物に痛みや不快感を与える可能性があるため、25Gより大きい針を使用することはお勧めできません。

肺病変が注射された腫瘍細胞によって形成されることを検証する方法として、免疫染色は組織切片で行うことができる。ヒト細胞株を用いる場合、ヒト特異的抗体を使用して転移病変を識別することができる。あるいは、タグ付き細胞株(例えばGFP)を用いる場合、対応する抗体が使用できる。また、多くの乳癌細胞株は上皮マーカー(すなわち、サイトケラチン、Eカドヘリン、およびEpCAM)に陽性であるが、発現の事前知識は必須である。しかし、気道を裏打ちする肺上皮もこれらのマーカーに対して陽性となるため、構造も考慮されなければならない。原発性肺腫瘍の発症を排除しなければならない場合があります。そのために、甲状腺転写因子-1(TTF1)に対する免疫ヒストリカル染色を原発性肺腺癌のマーカーとして用いることができる。TTF1染色は、認定病理医によって評価されるべきである。

ここでは、確立された肺転移アルゴリズムが、サイズが変化する転移の正確な検出のために微調整できなかったため、カスタムアルゴリズムがDecision Forest分類アルゴリズムを使用して作成されました。このカスタマイズされたアルゴリズムは、複雑な測定を可能にし、サイズによるメタスターゼの正確なセグメンテーションを可能にし、サイズカットオフをサポートして、小さな誤った形状の領域と通常の構造が誤って解釈され、最終的なデータセットに含めることができるようにします。このアルゴリズムは、ほとんどのin vivo肺転移研究に適用されると予想されますが、ユーザーは個々の研究ニーズに合わせてソフトウェア内の設定を調整する必要があります。しかし、このアルゴリズムは、同様の方法で肺転移性負担を分析したい研究者のためのプラットフォームとして機能します。画像解析プラットフォームには、アクセスや可用性、コストとトレーニング、および経験レベルが利用するのに最適なプラットフォームを決定するさまざまなオプションがあります36。オプションの範囲には、QuPathなどの無料のプラットフォームや、より高価で洗練されたプラットフォーム(Visiopharmなど)が含まれます。特定の研究プロジェクトで利用可能で最適なプラットフォームを決定する際には、画像解析病理学コアおよび病理学者と相談することをお勧めします。

自発的なマウス乳腺腫瘍モデル(MMTV-PyMTなど)または異形性乳腺脂肪パッドの注入方法は、肺転移を研究するための最も生理学的に関連するモデルを表す。尾静脈注射モデルの重大な欠点は、完全転移カスケードを再現せず、腫瘍細胞の外挿および二次臓器の植民地化の研究に限定される点である。しかし、この実験転移モデルは、尾静脈注射後に形成される肺転移が同一細胞31の正腸移植後に発症する転移性病変に類似したゲノムプロファイルを有するので、乳癌研究に関連する。肺転移モデルを確立するために、多くの場合、大量の細胞が静脈内に注入され、播種、免疫反応、休眠に関連する転移の過程を正確に表さない場合があります。また、循環経路に基づいて、肺転移は尾静脈注射32と最も一般的である。ほとんどの乳癌細胞株では、公表された報告書は、尾静脈注射後の骨、肝臓、または脳転移の発生率が比較的低いことを示している。心臓内、脛骨内、門脈および頸動脈内注射などの代替実験転移法は、他の部位への転移を調べる場合により適している33,34,35,36,37。繰り返しますが、転移性カスケードのすべてのステップを再現する自発的な乳腺腫瘍モデルまたは直交性脂肪パッド注入方法が好ましい。一貫した転移性腫瘍の負担、研究期間、およびそのような研究に必要な動物の数の問題は欠点です。しかし、ここで提示されるデジタル病理解析の方法は、任意の自発的または実験的転移モデルを介して形成された肺転移に適用することができる。

また、アルゴリズム作成における主観性など、一定の制限があります。全体のスライド画像は、組織のセクション全体と単一のマウスのすべての肺葉のデジタル分析を可能にするが、それは3D組織の2次元分析に限定される。ステレロジーは、画像解析のための3D情報を取得し、組織処理中に発生する組織収縮などの要因を説明することができる一般的な方法になりつつあります38。しかし、ステレロジーには、組織、資源、時間の制約などの独自の制限があります。

転移性転移の影響を受けるがん患者の数を考えると、転移を研究する尾静脈注射法は、転移広がりの複雑な生物学を理解し、新しい治療法の前臨床効果を決定する上で有用なツールであり続けるであろう。生体内マウスの転移モデル、特に免疫に優れた動物を用いたモデルは、免疫療法への関心が広がっており、がん研究においてさらに重要になってきている。また、実験転移モデルは、転移抑制遺伝子(すなわち、原発性腫瘍の増殖に影響を与えることなく癌細胞の転移能を抑制するもの)の研究において重要であり、したがって、貴重な研究ツールであり続けている。

デジタルイメージングおよびスライド解析は、診断および実験用マウスモデリング39における急速な主力となっている。肺転移性腫瘍の負担を分析するために本明細書に記載されたアプローチのタイプを使用すると、より包括的かつ正確な方法で高スループット分析が可能になります。さらに、デジタルイメージング病理は、乳がん転移のマウスモデルなどの分野に特化した病理学者を含む、より共同研究的な研究プロジェクトへの道を提供します。多重組織イメージング法や3Dイメージング技術(上記)の開発が続く中、デジタルイメージング病理、画像解析のための高度なソフトウェアプログラム、および転移研究を進めるには病理学者の専門知識が必要です。

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Disclosures

著者らは開示するものは何もない。

Acknowledgments

代表的なデータは、国立がん研究所(K22CA218549からS.T.S.)を通じて資金提供されました。ここに報告された包括的な分析方法の開発に協力することに加えて、我々は、オハイオ州立大学総合癌センター比較病理学およびマウスフェノタイピング共有リソース(ディレクター - クリスタ・ラ・ペルル、DVM、博士号)の組織学および免疫組織化学サービス、およびアルゴリズムの開発および分析のための病理イメージングコアに感謝します。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
alcohol prep pads Fisher Scientific 22-363-750 for cleaning tail prior to injection
dissection scissors Fisher Scientific 08-951-5 for mouse dissection and lung tissue inflation
DMEM with L-Glutamine, 4.5g/L Glucose and Sodium Pyruvate Fisher Scientific MT10013CV cell culture media base for MDA-MB-231 and MVT1 cell lines
Dulbecco's Phosphate-Buffered Salt Solution 1x Fisher Scientific MT21030CV used for resuspending tumor cells for injection
ethanol (70 % solution) OSU used to minimize mouse's fur during dissection; use caution - flammable
Evan's blue dye Millipore Sigma E2129 used at 1 % in sterile PBS for practice with tail-vein injection method; use caution - dangerous reagent
Fetal Bovine Serum Millipore Sigma F4135 cell culture media additive; used at 10% in DMEM
forceps Fisher Scientific 10-270 for dissection and lung tissue inflation
FVB/NJ mice The Jackson Laboratory 001800 syngeneic mouse strain for MVT1 cells
hemacytometer (Bright-Line) Millipore Sigma Z359629 for use in cell culture to obtain cell counts
insulin syringe (28 G) Fisher Scientific 14-829-1B for tail-vein injections (BD 329424)
MDA-MB-231 cells ATCC human breast cancer cell line
MVT1 cells mouse mammary tumor cells
needles (26 G) Fisher Scientific 14-826-15 used to inflate the mouse's lungs
neutral buffered formalin (10%) Fisher Scientific 245685 used as a tissue fixative and to inflate lung tissue; use caution - dangerous reagent
NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ (NSG) mice The Jackson Laboratory 005557 maintained by OSUCCC Target Validation Shared Resource
Penicillin Streptomycin 100x ThermoFisher 15140163 cell culture media additive
sterile gauze Fisher Scientific NC9379092 for applying pressue to mouse's tail if bleeding occurs
syringe (5 mL) Fisher Scientific 14-955-458 used to inflate mouse lung tissue
tail-vein restrainer Braintree Scientific, Inc. TV-150 STD used to restrain mouse for tail-vein injections
Trypan blue (0.4 %) ThermoFisher 15250061 used in cell culture to assess viability
Trypsin-EDTA 0.25 % ThermoFisher 25200-114 used in cell culture to detach tumor cells from plate

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Tags

がん研究、第159号、尾静脈注射、乳がん、肺転移、H&E染色切片、定量的デジタル病理、画像解析

Erratum

Formal Correction: Erratum: Pathological Analysis of Lung Metastasis Following Lateral Tail-Vein Injection of Tumor Cells
Posted by JoVE Editors on 12/02/2020. Citeable Link.

An erratum was issued for: Pathological Analysis of Lung Metastasis Following Lateral Tail-Vein Injection of Tumor Cells. The author list was updated.

The author list was updated from:

Katie A. Thies1, Sue E. Knoblaugh2, and Steven T. Sizemore1
1Department of Radiation Oncology, Arthur G. James Comprehensive Cancer Center and Richard L. Solove Research Institute, The Ohio State University Medical Center
2Department of Veterinary Biosciences, Comparative Pathology and Digital Imaging Shared Resource, The Ohio State University

to:

Katie A. Thies1, Sarah Steck1, Sue E. Knoblaugh2, and Steven T. Sizemore1
1Department of Radiation Oncology, Arthur G. James Comprehensive Cancer Center and Richard L. Solove Research Institute, The Ohio State University Medical Center
2Department of Veterinary Biosciences, Comparative Pathology and Digital Imaging Shared Resource, The Ohio State University

腫瘍細胞の横尾静脈注入後の肺転移の病理学的解析
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Thies, K. A., Steck, S., Knoblaugh,… More

Thies, K. A., Steck, S., Knoblaugh, S. E., Sizemore, S. T. Pathological Analysis of Lung Metastasis Following Lateral Tail-Vein Injection of Tumor Cells. J. Vis. Exp. (159), e61270, doi:10.3791/61270 (2020).

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