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Cancer Research

Analyse pathologique des métastases pulmonaires après injection latérale de cellules tumorales dans la veine caudale

Published: May 20, 2020 doi: 10.3791/61270
Automatic Translation
1, 1, 2, 1
1Department of Radiation Oncology, Arthur G. James Comprehensive Cancer Center and Richard L. Solove Research Institute, The Ohio State University Medical Center, 2Department of Veterinary Biosciences, Comparative Pathology and Digital Imaging Shared Resource, The Ohio State University

ERRATUM NOTICE

Summary

L’injection intraveineuse de cellules cancéreuses est souvent utilisée dans la recherche sur les métastases, mais la charge tumorale métastatique peut être difficile à analyser. Ici, nous démontrons un modèle d’injection de métastases dans la veine de la queue et incluons une nouvelle approche pour analyser la charge tumorale pulmonaire métastatique qui en résulte.

Abstract

Les métastases, principale cause de morbidité et de mortalité chez la plupart des patients atteints de cancer, peuvent être difficiles à modéliser précliniquement chez la souris. Peu de modèles de métastases spontanées sont disponibles. Ainsi, le modèle expérimental de métastases impliquant l’injection de lignées cellulaires appropriées dans la veine caudale est un pilier de la recherche sur les métastases. Lorsque des cellules cancéreuses sont injectées dans la veine latérale de la queue, le poumon est leur site préféré de colonisation. Une limitation potentielle de cette technique est la quantification précise de la charge tumorale pulmonaire métastatique. Alors que certains chercheurs comptent les macrométastases d’une taille prédéfinie et/ou incluent des micrométastases après la coupe des tissus, d’autres déterminent la zone des lésions métastatiques par rapport à la zone tissulaire normale. Ces deux méthodes de quantification peuvent être extrêmement difficiles lorsque la charge métastatique est élevée. Ici, nous démontrons un modèle d’injection intraveineuse de métastases pulmonaires suivi d’une méthode avancée pour quantifier la charge tumorale métastatique à l’aide d’un logiciel d’analyse d’images. Ce processus permet d’étudier plusieurs paramètres du point final, y compris la taille moyenne des métastases, le nombre total de métastases et la zone totale des métastases, afin de fournir une analyse complète. De plus, cette méthode a été examinée par un pathologiste vétérinaire certifié par l’American College of Veterinary Pathologists (SEK) pour en assurer l’exactitude.

Introduction

Bien qu’il s’agisse d’un processus très complexe et inefficace1, les métastases contribuent de manière significative à la morbidité et à la mortalité des patients atteints de cancer2. En fait, la plupart des décès liés au cancer sont attribués à la propagation métastatique de la maladie3,4. Pour que les cellules tumorales réussissent à métastaser, elles doivent se détacher du site primaire, envahir par le stroma adjacent, s’intravaser dans la circulation sanguine ou lymphatique, se rendre au lit capillaire d’un site secondaire, extravaser dans le tissu secondaire et proliférer ou se développer pour former des lésions métastatiques5. L’utilisation de modèles murins a été essentielle pour approfondir la compréhension des mécanismes moléculaires responsables de l’ensemencement et de la croissance métastatiques6,7. Ici, nous nous concentrons sur les métastases du cancer du sein, pour lesquelles des modèles murins génétiquement modifiés ainsi que des méthodes de transplantation sont souvent utilisés – chacun avec son propre ensemble d’avantages et de limites.

Les modèles de tumeurs mammaires génétiquement modifiés utilisent des promoteurs spécifiques de la glande mammaire, y compris MMTV-LTR (mouse mammary tumor virus long terminal repeat) et WAP (Whey Acidic Protein), pour stimuler l’expression des transgènes dans l’épithélium mammaire8. Les oncogènes, y compris l’antigène T moyen polyoma (PyMT), ErbB2 / Neu, c-Myc, Wnt-1 et le virus simien 40 (SV40) ont été exprimés de cette manière9,10,11,12,13, et bien que ces modèles génétiques soient utiles pour étudier l’initiation et la progression de la tumeur primaire, peu se métastasent facilement vers des organes distants. De plus, ces modèles génétiques murins sont souvent plus longs et plus coûteux que les modèles de métastases spontanées ou expérimentales. Compte tenu de la limitation de la plupart des modèles de tumeurs mammaires génétiquement modifiés pour étudier les métastases, les techniques de transplantation sont devenues des méthodes attrayantes pour étudier ce processus complexe. Cela comprend l’injection orthotopique, veineuse de la queue, intracardiaque et intracrânienne de lignées cellulaires appropriées.

Bien que plusieurs lignées cellulaires de cancer du sein métastasent facilement après une injection orthotopique dans le coussinet adipeux mammaire14,15, la consistance et la reproductibilité de la charge tumorale métastatique peuvent être un défi, et la durée de telles études peut être de l’ordre de plusieurs mois. Pour évaluer les métastases pulmonaires, en particulier, l’injection intraveineuse dans la veine de la queue est souvent une méthode plus reproductible et plus rapide, la propagation métastatique se produisant généralement en l’espace de quelques semaines. Cependant, étant donné que le modèle d’injection intraveineuse contourne les étapes initiales de la cascade métastatique, il faut faire preuve de prudence dans l’interprétation des résultats de ces études. Dans cette démonstration, nous montrons l’injection de cellules tumorales mammaires dans la veine caudale ainsi qu’une méthode d’analyse précise et complète.

Même si le milieu de la recherche a fait des progrès importants dans la compréhension du processus complexe des métastases du cancer du sein, on estime que plus de 150 000 femmes sont actuellement atteintes d’un cancer du sein métastatique16. Parmi les personnes atteintes d’un cancer du sein de stade IV, >36 % des patientes ont des métastases pulmonaires17; toutefois, le profil et l’incidence des métastases propres au site peuvent varier en fonction du sous-type moléculaire18,19,20,21. Les patientes atteintes de métastases pulmonaires associées au cancer du sein ont une survie médiane de seulement 21 mois, ce qui souligne la nécessité d’identifier des traitements efficaces et de nouveaux biomarqueurs pour cette maladie17. L’utilisation de modèles expérimentaux de métastases, y compris l’injection intraveineuse de cellules tumorales, continuera de faire progresser nos connaissances sur cet important défi clinique. Lorsqu’elles sont combinées à la pathologie par imagerie numérique et à la méthode d’analyse de la charge tumorale pulmonaire métastatique décrite dans ce protocole, les injections de veines de la queue sont un outil précieux pour la recherche sur les métastases du cancer du sein.

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Protocol

L’utilisation des animaux a suivi les règlements de l’Université sur les ressources des animaux de laboratoire (ULAR) en vertu du protocole approuvé par le Comité institutionnel de soins et d’utilisation des animaux (IACUC) de l’OSU 2007A0120-R4 (PI: Dr Gina Sizemore).

1. Injection de cellules cancéreuses du sein dans la veine de la queue

  1. Préparation des cellules et seringue pour injection
    1. Plaquez un nombre approprié de cellules en fonction du nombre de souris et de la concentration cellulaire à utiliser.
      REMARQUE: Le nombre de cellules injectées et le temps nécessaire au développement des métastases dépendront de la lignée cellulaire utilisée et devront être optimisés. Dans cette démonstration, 1 x 106 cellules MDA-MB-231 sont injectées par voie intraveineuse dans des souris NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ (NSG), et des lésions pulmonaires macroscopiques sont observées au plus tard 24 jours après l’injection. Pour la lignée cellulaire tumorale mammaire murine MVT17, 3 x 106 cellules sont injectées à des souris FVB/N immunocompétentes avec de nombreuses métastases pulmonaires observées en 14 jours22,23.
    2. Aspirer les milieux et rincer les plaques cellulaires avec 1x PBS. Trypsiniser les cellules en volume minimal, ajouter un volume approprié de milieu et compter les cellules à l’aide d’un hématocytomètre ou d’une autre méthode préférée. Le bleu de trypan (0,4 %) ou d’autres colorants cellulaires vivants/morts peuvent être utilisés pour déterminer le nombre de cellules viables.
    3. Cellules à granulés en tournant à 180 x g pendant 5 min.
    4. Remettre en suspension un nombre approprié de cellules dans du PBS stérile 1x de telle sorte qu’un volume de 100 μL soit injecté par souris. Gardez la suspension cellulaire sur la glace pour maintenir la viabilité.
    5. Avant l’injection, remettez soigneusement en suspension les cellules avec une pipette de 200 μL ou 1 mL pour éviter l’agglutination. Prélever 100 μL dans une seringue à insuline de 28 G (voir tableau des matériaux).
    6. Éliminez les bulles d’air en maintenant la seringue verticale, en tapotant sur la seringue et en ajustant lentement le piston. L’injection de bulles d’air dans la veine est susceptible de provoquer une embolie air/gaz qui peut être fatale.
  2. Injection latérale de la veine caudale
    REMARQUE: Pour les tests expérimentaux de métastases du cancer du sein, les injections sont effectuées sur des souris femelles de > de 6 semaines.
    1. Manipulez la souris par la queue et faites glisser l’animal dans un tube/dispositif de retenue fendu d’une taille appropriée (voir le tableau des matériaux pour le dispositif de retenue utilisé).
    2. Insérez la partie plug du dispositif de retenue et positionnez la souris sur le côté de manière à ce que sa veine latérale de la queue soit facile à voir. La souris a une artère ventrale alignée avec les organes génitaux, une veine dorsale et deux veines caudales latérales.
    3. Nettoyez la surface de la queue de la souris avec une lingette aseptique. Saisissez la queue entre l’index et le pouce avec la main non dominante et appliquez une légère tension.
    4. En commençant par la partie distale de la queue, insérez l’aiguille parallèlement à la veine avec l’extrémité biseautée.
    5. Si cela est autorisé, récapitulez soigneusement l’aiguille et pliez-la à un angle de 20 à 30 °. Une approche à une seule main ou un dispositif de récapitulation à l’aiguille est fortement recommandé.
      REMARQUE: Il n’est pas nécessaire d’aspirer car cela peut provoquer l’effondrement de la veine. Cependant, un petit éclair de sang peut être vu lors de la première place. L’aiguille avancera en douceur dans la veine avec un placement approprié.
    6. Distribuer lentement le volume complet dans la veine. Il ne devrait pas y avoir de résistance lorsque le piston est poussé.
    7. Si une résistance se fait sentir, retirez rapidement l’aiguille de la seringue. Si nécessaire, réinsérez l’aiguille (idéalement pas plus de 3 tentatives) en vous déplaçant vers l’extrémité proximale de la queue ou la veine latérale opposée.
    8. Un petit volume de sang sera probablement déplacé après l’injection. Appliquez une légère pression avec de la gaze stérile et essuyez avec une lingette aseptique.
    9. Jetez rapidement la seringue dans un contenant approprié pour objets tranchants.
    10. Remettez la souris dans une cage propre et ventilée et surveillez les signes de détresse.
    11. Surveillez les souris 2-3x / semaine pour détecter les signes de formation de métastases (respiration laborieuse, posture voûtée, perte de poids) et de détresse générale. Le temps de développement des métastases dépendra de la lignée cellulaire et de la souche de souris.
    12. Si vous utilisez un dispositif d’imagerie d’animaux vivants in vivo, imagez des souris immédiatement après l’injection de veines caudales pour confirmer l’injection réussie de cellules et obtenir des données de temps « zéro » (des détails spécifiques sur l’imagerie par bioluminescence in vivo ne sont pas inclus ici, mais sont décrits par Yang et al.24).

2. Fixation du tissu pulmonaire et analyse de la charge tumorale pulmonaire métastatique

  1. Gonflage du tissu pulmonaire pour maintenir le format structurel des poumons pour l’histopathologie
    1. Après avoir suivi les procédures d’euthanasie approuvées (p. ex. dioxyde de carbone à un déplacement de 30 à 70 % du volume de la chambre/min), fixer la carcasse de la souris à une planche de dissection avec des broches. Vaporisez ou appliquez de l’éthanol à 70% pour garder la fourrure de la souris à l’écart pendant la dissection.
      REMARQUE: L’asphyxie au dioxyde de carbone peut provoquer une hémorhage pulmonaire comme lésion de fond attendue, en particulier à des débits plus lents.
    2. Ouvrez le thorax avec une incision médiane, étendez l’incision crânienne / caudale à travers le péritoine et coupez le diaphragme en saisissant le processus xyphoïde.
    3. À l’aide d’un jeu de ciseaux séparé pour ne pas ternir les lames, coupez les côtes de chaque côté du sternum et retirez soigneusement la cage thoracique en laissant de la place aux poumons pour se dilater.
    4. Isolez la trachée en enlevant les glandes salivaires sous-maxillaires et la musculature infrahyoïde. Placer des broches de chaque côté de la trachée peut empêcher les mouvements indésirables lors de l’insertion de l’aiguille.
    5. Remplissez une seringue de 26 G avec 2-3 mL de formol tamponné neutre à 10% et insérez-la dans la trachée.
    6. Injectez lentement du formol et surveillez l’expansion des poumons (nécessite généralement environ 1,5 mL de formol).
    7. Une fois que le formol commence à s’échapper des poumons (évitez le gonflage excessif), pincez la trachée avec une pince, retirez l’aiguille de la seringue et détachez tout l’appareil respiratoire. Placez les poumons, le cœur, etc. directement dans le formol car une coupe supplémentaire des tissus peut être effectuée après la fixation.
    8. Traitement complet, incorporation, sectionnement des tissus et coloration à l’hématoxyline et à l’éosine (H & E) à l’aide de méthodes standard.
  2. Analyse de la charge tumorale pulmonaire métastatique
    1. Scannez des sections pulmonaires colorées H&E sur un scanner de diapositives haute résolution à un grossissement de 40x (Figure 3).
    2. Importez des images dans un logiciel d’analyse d’images (par exemple, Visiopharm Image Analysis) pour quantifier les métastases pulmonaires.
      REMARQUE: Nous recommandons aux nouveaux utilisateurs d’obtenir une formation sur site ou en ligne pour utiliser le logiciel d’analyse d’images. De nombreux webinaires sont également disponibles sur la page Web commerciale.
    3. Sélectionnez l’application Visiopharm 10118 H&E Lung Metastasis dans la bibliothèque d’applications du logiciel.
      REMARQUE: Le but de cette application est d’étiqueter et de quantifier les métastases pulmonaires sur les lames colorées H & E. Dans le cadre de l’application 10118 H&E Lung Metastasis, la première étape de traitement d’image segmente le tissu pulmonaire avec l’application Tissue Detection. La deuxième étape de traitement d’image utilise l’application Metastasis Detect qui identifie les métastases à l’intérieur du tissu pulmonaire. Les métastases sont identifiées par la forme avec des régions qui sont soit trop déformées, soit trop rouges ou trop clairsemées pour être identifiées comme des métastases.
    4. Ajustez les paramètres définissant la forme et la rareté pour qu’ils s’adaptent au mieux aux images représentatives. Les zones segmentées des métastases tumorales et du tissu pulmonaire normal peuvent être affichées à l’aide d’étiquettes de couleur différentes pour chaque type de tissu.
      REMARQUE : Dans le cas où l’application ne peut pas séparer avec précision les métastases du tissu pulmonaire normal, une application personnalisée utilisant le programme Visiopharm Decision Forest peut devoir être écrite comme cela a été fait pour les expériences (voir Figure 2 et Figure 3). Les détails pour l’écriture d’un algorithme personnalisé suivent ci-dessous. Sinon, passez à l’étape 2.2.9.
    5. Ouvrez le programme Decision Forest, qui fonctionne en formant plusieurs classes [c.-à-d. tissu pulmonaire (non néoplasique), métastases, globules rouges, épithélium et / ou espace blanc] sur une image souhaitée. Dans la figure 2, les métastases tumorales sont bleues, le tissu normal est vert et l’épithélium bronchiolaire est jaune. En outre, les globules rouges sont dans les espaces rouges et les espaces d’air en rose.
    6. Suivez la série de questions par oui ou par non pour former correctement chaque classe à une image. La précision de l’algorithme déterminera le nombre de questions oui/non. Pour l’analyse, l’algorithme/l’application personnalisé a été écrit avec une précision définie sur 50 (plage 0-100).
    7. Ajustez les fonctionnalités pour chaque classe en appliquant des filtres pour affiner, flouter, trier par forme, etc. afin d’améliorer la précision de l’algorithme/de l’application. Visiopharm affiche chaque classe à travers un ou plusieurs objectifs appelés fonctionnalités. Les fonctionnalités modifient la façon dont la classe voit l’image pour faire ressortir certaines couleurs ou intensités.
      REMARQUE: Pour l’algorithme personnalisé, les métastases mesurant 8500 μm2 et plus sont étiquetées et mesurées comme métastases. Cela tient compte de la variance de taille et des métastases trop petites pour être détectées. Les petites zones déformées et les petites zones métastatiques inférieures à 8500 μm2 ont été incluses dans la quantification tissulaire normale.
    8. Enregistrez les paramètres modifiés à partir de l’application ou de l’algorithme personnalisé, puis appliquez l’algorithme / l’application à un ensemble entier ou à une série de tissus colorés H & E.
    9. Enfin, exportez toutes les variables de sortie, y compris celles répertoriées dans le tableau 1. L’aire en microns carrés (μm2) peut être quantifiée pour chaque type de tissu et les pourcentages sont dérivés de la surface nette nette totale de l’échantillon (c.-à-d. le tissu total moins l’espace d’air).
    10. Lors de la création d’un algorithme personnalisé, examinez les annotations tissulaires en consultation avec un pathologiste vétérinaire certifié par l’American College of Veterinary Pathologists pour assurer des mesures précises et différencier les types de tissus.

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Representative Results

Si vous utilisez des cellules non marquées pour l’injection de veines de la queue, il peut être difficile de confirmer la colonisation pulmonaire jusqu’à (1) le moment de la nécropsie si des macrométastases peuvent être observées ou (2) après une analyse histologique si des métastases microscopiques existent. Avec une charge de tumeur pulmonaire métastatique étendue, les souris auront une respiration laborieuse. Comme pour toute étude tumorale, les souris doivent être surveillées attentivement tout au long de la durée de l’étude. L’utilisation de cellules marquées est un moyen facile de confirmer le succès de l’injection de veine de la queue; d’où l’utilisation de cellules MDA-MB-231 marquées à la luciférase dans la démonstration. Cependant, l’imagerie in vivo n’est pas toujours possible ou nécessaire en fonction de la conception expérimentale et d’autres facteurs. La figure 1A montre le signal de bioluminescence dans l’espace thoracique moins de 2 heures après l’injection dans la veine caudale de cellules MDA-MB-231 marquées par la luciférase comme confirmation de l’injection précise. Pour cette expérience, le nombre de photons dans la région thoracique augmente avec le temps et un fort signal de bioluminescence est présent au jour 24 après l’injection (Figure 1B et C; notez le changement de barre d’échelle). Au moment de la nécropsie, de nombreuses lésions pulmonaires macroscopiques ont été observées chez ces souris (Figure 1D).

Après un traitement et une coloration appropriés des tissus, les sections pulmonaires colorées en H et E peuvent être scannées ou imagées. La quantification de la charge tumorale pulmonaire métastatique peut être réalisée efficacement à l’aide d’un logiciel d’analyse d’images et d’un algorithme personnalisé. À l’aide de l’algorithme personnalisé, le tissu pulmonaire entier est segmenté par différentes caractéristiques tissulaires (Figure 2A et B). En segmentant le tissu pulmonaire de cette manière, le logiciel peut quantifier les différents paramètres énumérés dans le tableau 1. Cette analyse a été réalisée sur du tissu pulmonaire de souris injectées avec des cellules MDA-MB-231 suivies d’un traitement avec un médicament conçu pour bloquer la colonisation métastatique ou un contrôle du véhicule (DMSO). Les données brutes de cette analyse sont présentées dans le tableau 2. De plus, la figure 3A montre des images H&E représentatives des métastases pulmonaires MDA-MB-231 provenant de DMSO ou de souris traitées par des médicaments. Bien qu’une différence dans la charge tumorale métastatique entre ces groupes de traitement ait pu facilement être négligée car le nombre total de nodules pulmonaires n’est pas différent, une analyse complète de tous les paramètres indique une différence significative dans la zone de métastase pulmonaire nette en pourcentage (Figure 3B, C). Cela souligne la nécessité d’une approche complète et approfondie pour analyser la charge tumorale pulmonaire métastatique telle que la méthode décrite ici.

Pour les données présentées à la figure 3, toutes les analyses statistiques ont été effectuées à l’aide de GraphPad Prism 7. Les données ont été considérées comme normalement distribuées après avoir réussi l’un des tests de normalité standard suivants : D’Agostino-Pearson omnibus, Shapiro-Wilk et Kolmogorov-Smirnov. La comparaison entre le véhicule et les groupes traités par la drogue (figure 3) a été effectuée par le test t de Student à deux queues non apparié. La signification statistique a été établie à P ≤ 0,05.

Figure 1
Figure 1 : Confirmation in vivo de la bioluminescence d’une injection réussie dans la veine de la queue.
(A) Signal de bioluminescence représentatif chez la souris 1 heure après l’injection dans la veine de la queue de cellules MDA-MB-231 marquées par la luciférase. (B) Signal de bioluminescence représentatif chez le même ensemble de souris que (A) 24 jours après l’injection dans la veine caudale de cellules MDA-MB-231 marquées par la luciférase. [Notez le changement de barre d’échelle entre (A) et (B)]. (C) Quantification du nombre de photons au fil du temps chez les souris injectées dans la veine de la queue MDA-MB-231. Les barres d’erreur représentent la moyenne ± SEM. (n = 8 souris) (D) Tissu pulmonaire représentatif non porteur de tumeur (droite) et macrométastases MDA-MB-231 dans les poumons (gauche) au moment de la nécropsie. Barres d’échelle = 50 mm. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 2
Figure 2 : Segmentation tissulaire à l’aide du logiciel Visiopharm.
(A) Extraits représentatifs de marques tissulaires non segmentées et segmentées à l’aide de l’algorithme logiciel personnalisé. (B) Légende pour toutes les catégories de tissus segmentées à l’aide d’un logiciel. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 3
Figure 3 : Analyse représentative de la charge tumorale pulmonaire métastatique des tissus colorés H&E.
(A) Coloration H&E représentative du tissu pulmonaire de souris non injectées et de souris témoins (DMSO) et de souris traitées par médicament après injection de cellules MDA-MB-231 dans la veine de la queue. Les métastases tumorales représentatives sont indiquées par des flèches. Barres d’échelle = 500 μm pour un grossissement 4x et 200 μm pour un grossissement 10x. (B) Graphique du pourcentage de la zone de contrôle des métastases pulmonaires nettes et des souris traitées par médicament. Les barres d’erreur représentent la moyenne ± SD. (*) P = 0,022 par le test t de Student. (C) Tableau résumant l’analyse de la charge de la tumeur pulmonaire métastatique (n = 9 DMSO; n = 9 traités par médicament). Après avoir vérifié la distribution normale des données, toutes les valeurs P du tableau ont été déterminées par le test t de Student non apparié à deux queues. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Paramètre Description
Surface tissulaire totale (μm2) Surface en microns carrés comprenant toutes les métastases tumorales, les poumons normaux et les zones de globules rouges.
Nombre de métastases Nombre total de métastases dans le tissu pulmonaire.
Pourcentage de surface de métastase (μm2) Zone totale de métastases divisée par la surface tissulaire nette x 100.
Tissu total + espace blanc (μm2) Surface en microns carrés, y compris tous les tissus et les espaces blancs.
Surface tissulaire nette (μm2) Zone tissulaire en microns carrés (mets et poumon normal) sans espace blanc ni globules rouges.
Surface totale des métastases (μm2) Surface totale de métastases en microns carrés segmentée par les algorithim de la forêt de décision.
Aire moyenne de métastases (μm2) Surface moyenne (moyenne) en microns carrés de métastases dans chaque image.
Zone médiane des métastases (μm2) Zone médiane des métastases en microns carrés. Un nombre égal de métastases tombe en dessous de cette valeur et un nombre égal de métastases est supérieur à la valeur médiane.

Tableau 1 : Paramètres mesurés à l’aide d’un logiciel. Liste des paramètres avec une description de chaque mesure calculée à l’aide de l’algorithme personnalisé.

Glisser Nombre de métastases Pourcentage de surface de métastase (μm2) Tissu total + espace blanc (μm2) Espace blanc total (μm2) Surface tissulaire nette (μm2) Surface totale des métastases (μm2) Zone des globules rouges (μm2) Aire moyenne de métastases (μm2) Zone médiane des métastases (μm2)
171 Poumon Diapositive 1 435 8.90 185698000 83201800 92031400 8189250 10464800 18825.86 14748.73
171 Poumon Diapositive 2 323 8.37 185698000 83201800 92054740 7708990 10441460 23866.84 14748.73
172 Poumon Diapositive 1 151 2.73 181546000 89509904 81571296 2225220 10464800 14736.56 12486.37
172 Poumon Diapositive 2 142 2.60 170708000 81735504 80558196 2093040 8414300 14739.72 12119.62
173 Poumon Diapositive 1 634 11.60 234104992 102153000 115606692 13406800 16345300 21146.37 15472.22
173 Poumon Diapositive 2 667 12.70 223180992 86778600 122374592 15542700 14027800 23302.40 16531.00
174 Poumon Diapositive 1 40 0.55 192452992 80340896 87591096 485121 24521000 12128.03 10484.05
174 Poumon Diapositive 2 34 0.51 183918000 71287904 91242796 464830 21387300 13671.47 11181.81
175 Poumon Diapositive 1 780 23.93 179544992 44799200 126995782 30388600 7750010 38959.74 19307.76
175 Poumon Diapositive 2 1001 12.58 169191536 43425608 120610754 15169100 5155174 15153.95 19703.08
188 Poumon Diapositive 1 569 13.20 162290000 54210000 98486310 12997300 9593690 22842.36 14463.91
188 Poumon Diapositive 2 271 5.15 157146000 54250800 91996500 4738100 10898700 17483.76 12657.83
189 Poumon Diapositive 1 74 1.70 185292992 95700800 77779392 1318820 11812800 17821.89 14551.08
189 Poumon Slide 2 74 1.76 182272992 95700800 74759392 1318820 11812800 17821.89 14551.08
816 Poumon Diapositive 1 246 5.65 185876000 87568896 81916204 4631050 16390900 18825.41 14371.99
816 Poumon Diapositive 2 565 6.05 183220000 76954304 90305396 5462670 15960300 9668.44 14244.82
876 Poumon Diapositive 1 468 10.36 208308000 99300096 100947064 10454500 8060840 22338.68 16011.37
876 Poumon Diapositive 2 528 11.74 199750896 81642568 110450391 12963400 7657937 24551.89 16699.13
877 Poumon Diapositive 1 732 17.98 219340992 99918600 107869992 19397100 11552400 26498.77 18137.52
877 Poumon Diapositive 2 605 14.64 207925504 88539712 108168329 15839700 11217463 26181.32 18014.64
878 Poumon Slide 1 377 10.05 178534000 85610896 81931104 8232340 10992000 21836.45 16671.03
878 Poumon Diapositive 2 376 9.88 170544000 75337904 86108406 8511710 9097690 22637.53 16754.38
879 Poumon Diapositive 1 205 5.22 167556000 89999000 68123630 3553860 9433370 17335.90 13845.69
879 Poumon Diapositive 2 213 4.64 167931008 80789400 78489588 3638720 8652020 17083.19 14058.12
881 Poumon Diapositive 1 1122 38.81 218880000 79713504 130893816 50802300 8272680 45278.34 22044.99
881 Poumon Diapositive 2 628 21.67 184200992 74502600 99122692 21475200 10575700 34196.18 19857.40
882 Poumon Diapositive 1 678 24.05 194476992 83941904 98484788 23684500 12050300 34932.89 20748.06
882 Poumon Diapositive 2 645 21.93 185537040 75790040 101412430 22241700 8334570 34483.26 20325.11
883 Poumon Diapositive 1 429 10.79 179400992 84955696 84699866 9138800 9745430 21302.56 15080.23
883 Poumon Diapositive 2 342 85.30 175220992 76210896 90472386 77170200 8537710 225643.86 17078.26
884 Poumon Diapositive 1 359 6.42 206751008 87752600 103825008 6669710 15173400 18578.58 14333.41
884 Poumon Diapositive 2 480 9.12 200990000 77052496 111060804 10125700 12876700 21095.21 15679.88
885 Poumon Diapositive 1 332 7.79 191398000 92896304 84752596 6605490 13749100 19896.05 14500.11
885 Poumon Diapositive 2 537 81.02 187475008 85938000 89378408 72411104 12158600 134843.77 15360.29
886 Poumon Diapositive 1 305 7.93 158435008 80433296 76541662 6068720 1460050 19897.44 14500.11
886 Poumon Diapositive 2 898 8.84 155460000 70808600 83457470 7380490 1193930 8218.81 14744.92

Tableau 2 : Tableau représentatif des résultats. Tableau des résultats pour chaque paramètre de l’algorithme d’une cohorte de souris veines de queue injectées avec des cellules MDA-MB-231.

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Discussion

Alors que les chercheurs continuent d’utiliser l’injection intraveineuse de cellules tumorales comme modèle expérimental pour les métastases, les pratiques standard pour analyser la charge tumorale métastatique qui en résulte font défaut. Dans certains cas, des différences significatives dans la charge tumorale métastatique lors de la manipulation de lignées cellulaires particulières et / ou de l’utilisation de composés chimiques peuvent être observées macroscopiquement. Cependant, dans d’autres cas, des différences subtiles dans l’ensemencement et la croissance métastatiques peuvent être négligées ou mal interprétées sans analyse pathologique approfondie. Cette étude fait progresser les protocoles d’injection de la veine de la queue précédemment publiés en incluant une méthode complète d’analyse de la charge tumorale pulmonaire métastatique. Il est important de noter que cette méthode d’analyse de pathologie numérique peut également être appliquée à la quantification de la charge tumorale métastatique pulmonaire après l’injection orthotopique de cellules tumorales capables de métastases spontanées ainsi que d’autres modèles expérimentaux de métastases (intracardiaques, etc.) et de modèles de xénogreffes dérivées du patient (PDX). L’utilisation de l’imagerie numérique et le développement d’algorithmes logiciels par les pathologistes vétérinaires garantissent la reproductibilité, la précision et la rigueur de cette approche pour analyser la charge tumorale pulmonaire métastatique25.

Une décision réfléchie des lignées cellulaires, de la concentration cellulaire et des paramètres en fonction d’études publiées précédemment ou d’une optimisation expérimentale minutieuse est absolument nécessaire. Étant donné que l’ensemencement et la colonisation métastatiques dépendent fortement des interactions avec diverses populations de cellules immunitaires26,27, l’utilisation de souris immunocompétentes est idéale, bien que pas toujours réalisable. Pour la même raison, l’interprétation des études expérimentales sur les métastases utilisant des souris athymiques ou NSG, qui manquent de composants cellulaires immunitaires clés, doit être prise avec prudence. Il existe plusieurs lignées de cellules tumorales mammaires de souris, y compris les cellules MVT1 utilisées dans cette étude, qui ont été dérivées de la souche de souris FVB / N22,28,29. D’autres modèles syngéniques existent également. En ce qui concerne la concentration cellulaire, l’injection d’un grand nombre de cellules peut accélérer considérablement et augmenter la charge de tumeur pulmonaire métastatique. Cependant, si les poumons sont submergés, il peut être difficile de distinguer les foyers métastatiques individuels et les embolies sont plus susceptibles de se produire. En outre, la procédure d’injection de la veine de la queue nécessite une pratique et une formation suffisantes avant d’effectuer des injections en toute sécurité et / ou de routine. De nombreuses institutions offriront une formation technique et peuvent fournir des souris à des fins de pratique. Un bon placement de l’aiguille et une injection en douceur devraient indiquer le succès; cependant, à des fins de formation et de pratique, le colorant Evans Blue peut être utilisé pour aider à déterminer le succès de l’injection (1% dans le PBS stérile). Les extrémités de la souris deviendront bleues peu de temps après l’injection, mais l’animal doit être euthanasié par la suite.

De plus, on ne soulignera jamais assez l’importance des techniques standard de nécropsie et d’échantillonnage des tissus pour contrôler et prévenir les artefacts de lames susceptibles d’entraver la numérisation et l’analyse des lames par le logiciel d’analyse d’images. Le gonflage des poumons au moment de la nécropsie est une étape critique dans le maintien de l’intégrité des tissus et améliore la coloration H & E ultérieure ainsi que l’analyse finale. Pour assurer la cohérence avec la résolution et la reproductibilité, il est recommandé de numériser toutes les diapositives d’un ensemble d’études avec le même objectif. Dans cette étude, toutes les lames ont été scannées à 40x pour assurer la précision des paramètres de l’algorithme et l’identification correcte des métastases tumorales lorsqu’elles sont appliquées à des champs analysés. Pour chaque lame, les mêmes lobes pulmonaires ont été systématiquement scannés et analysés pour chaque souris. Il est également fortement recommandé qu’un pathologiste examine les annotations tissulaires pour vérifier l’exactitude de l’algorithme appliqué et que le même algorithme soit appliqué à chaque diapositive d’une étude.

Le protocole présenté peut être modifié en fonction de la conception expérimentale, des préférences de l’utilisateur et des mesures de résultats souhaitées. L’une de ces modifications comprend l’utilisation d’une chambre d’induction d’anesthésie plutôt que d’un dispositif de retenue conventionnel pour un animal conscient. En termes de santé et de bien-être des animaux, aucune des deux approches n’est supérieure à l’autre et chacune a son propre ensemble d’avantages ainsi que des limites30. En outre, pour les souris noires ou brunes, une source de lumière ou un dispositif de chauffage peut être nécessaire pour visualiser les veines de la queue. Des lampes infrarouges ou un bain d’eau chaude peuvent être utilisés pour dilater les veines. Cependant, la température doit être surveillée attentivement. En outre, il existe des dispositifs de retenue éclairés ainsi que d’autres versions commerciales de dispositifs de retenue pour rongeurs. Certains chercheurs préfèrent les seringues Luer-Lok pour les injections. Nous trouvons plus difficile d’éliminer les bulles d’air avec les seringues Luer-Lok, mais c’est une question de préférence. La viabilité des cellules est une considération importante pour la procédure d’injection de la veine de la queue et, par conséquent, un nombre précis de cellules ainsi que le maintien des cellules sur la glace avant l’injection sont des étapes nécessaires. Si l’on compare l’ensemencement pulmonaire et la colonisation de lignées cellulaires manipulées, il est essentiel de déterminer toute différence dans la taille et la viabilité des cellules avant l’injection, car cela peut compliquer l’interprétation des résultats. La mort cellulaire et/ou des dommages peuvent survenir lors de l’utilisation d’une aiguille de calibre étroit; cependant, il n’est pas recommandé d’utiliser une aiguille de plus de 25 G, car elle pourrait causer de la douleur et de l’inconfort à l’animal.

Afin de valider que les lésions pulmonaires sont formées par des cellules tumorales injectées, l’immunocoloration peut être effectuée sur des coupes de tissus. Si vous utilisez des lignées cellulaires humaines, des anticorps spécifiques à l’homme peuvent être utilisés pour discerner les lésions métastatiques. Alternativement, si vous utilisez des lignées cellulaires marquées (par exemple, GFP), les anticorps correspondants peuvent être utilisés. En outre, de nombreuses lignées cellulaires de cancer du sein sont positives pour les marqueurs épithéliaux (c.-à-d. cytokératines, E-cadhérine et EpCAM), mais une connaissance préalable de l’expression est essentielle. Cependant, l’épithélium pulmonaire qui tapisse les voies respiratoires sera également positif pour ces marqueurs et, par conséquent, la structure doit également être prise en compte. Il peut y avoir des cas dans lesquels le développement d’une tumeur pulmonaire primaire doit être exclu. Pour ce faire, la coloration immunohistochimique du facteur de transcription thyroïdien 1 (TTF1) peut être utilisée comme marqueur de l’adénocarcinome pulmonaire primaire. La coloration TTF1 doit être évaluée par un pathologiste certifié.

Ici, un algorithme personnalisé a été écrit à l’aide d’un algorithme de classification de la forêt de décision parce que l’algorithme établi de métastases pulmonaires ne pouvait pas être affiné pour une détection précise des métastases de taille variable. Cet algorithme personnalisé permet des mesures complexes, permet une segmentation précise des métastases par taille et prend en charge une coupure de taille afin que les petites zones déformées et les structures normales ne soient pas mal interprétées et puissent donc être incluses dans l’ensemble de données final. Nous prévoyons que cet algorithme sera applicable à la plupart des études sur les métastases pulmonaires in vivo, mais les utilisateurs devront peut-être ajuster les paramètres du logiciel pour répondre à leurs besoins individuels. Cependant, cet algorithme sert de plate-forme pour les chercheurs souhaitant analyser la charge métastatique pulmonaire de la même manière. Il existe de nombreuses options différentes pour les plates-formes d’analyse d’images où l’accès ou la disponibilité, le coût et la formation, ainsi que le niveau d’expérience peuvent dicter la meilleure plate-forme à utiliser36. La gamme d’options comprend des plates-formes gratuites telles que QuPath et des plates-formes plus coûteuses, mais sophistiquées, telles que Visiopharm. Il est conseillé de consulter un noyau de pathologie d’analyse d’images et un pathologiste pour décider quelle plate-forme peut être disponible et la mieux utilisée pour un projet de recherche particulier.

Les modèles spontanés de tumeur mammaire de souris (par exemple, MMTV-PyMT) ou les méthodes d’injection orthotopique de coussinet adipeux mammaire représentent le modèle le plus physiologiquement pertinent pour l’étude des métastases pulmonaires. Un inconvénient sérieux du modèle d’injection de la veine de la queue est qu’il ne récapitule pas la cascade métastatique complète et se limite donc à l’étude de l’extravasation des cellules tumorales et de la colonisation des organes secondaires. Cependant, ce modèle expérimental de métastases est pertinent pour la recherche sur le cancer du sein, car les métastases pulmonaires formées après l’injection de veines de la queue ont des profils génomiques similaires aux lésions métastatiques qui se développent après l’implantation orthotopique des mêmes cellules31. Afin d’établir un modèle de métastase pulmonaire, un grand nombre de cellules sont souvent injectées par voie intraveineuse, ce qui peut ne pas représenter avec précision le processus de métastase en ce qui concerne l’ensemencement, la réaction immunitaire et la dormance. En outre, sur la base de la voie circulatoire, les métastases pulmonaires sont plus fréquentes avec l’injection de veine de la queue32. Avec la plupart des lignées cellulaires de cancer du sein, les rapports publiés indiquent une incidence relativement faible de métastases osseuses, hépatiques ou cérébrales après l’injection de veines de la queue7. D’autres méthodes expérimentales de métastases telles que les injections intracardiaques, intratibiales, de veines portes et intracarotidiennes sont plus appropriées pour examiner les métastases vers d’autres sites33,34,35,36,37. Encore une fois, les modèles de tumeurs mammaires spontanées ou les méthodes d’injection de coussinets adipeux orthotopiques qui récapitulent toutes les étapes de la cascade métastatique sont préférés. Les problèmes liés à la charge tumorale métastatique constante, à la durée de l’étude et au nombre d’animaux requis pour de telles études sont un inconvénient. Cependant, la méthode d’analyse de pathologie numérique présentée ici peut être appliquée aux métastases pulmonaires formées par n’importe quel modèle de métastase spontanée ou expérimentale.

La méthode d’analyse donne également certaines limites telles que la subjectivité dans la création d’algorithmes. Même si l’imagerie de lames entières permet une analyse numérique sur une section entière de tissu et sur tous les lobes pulmonaires d’une seule souris, elle se limite à une analyse bidimensionnelle d’un tissu 3D. La stéréologie devient une pratique courante qui obtient des informations 3D pour l’analyse d’images et peut tenir compte de facteurs tels que le rétrécissement des tissus qui se produit pendant le traitement des tissus38. La stéréologie, cependant, a ses propres limites telles que les tissus, les ressources et les contraintes de temps.

Compte tenu du nombre de patients cancéreux touchés par la propagation métastatique de leur maladie, la méthode d’injection de la veine de la queue pour étudier les métastases continuera d’être un outil utile pour comprendre la biologie complexe de la propagation métastatique et pour déterminer l’efficacité préclinique de nouveaux traitements. Les modèles murins in vivo de métastases, en particulier ceux utilisant des animaux immunocompétents, deviennent encore plus importants pour la recherche sur le cancer compte tenu de l’intérêt généralisé pour l’immunothérapie29. En outre, les modèles expérimentaux de métastases sont essentiels pour étudier les gènes suppresseurs de métastases (c’est-à-dire ceux qui suppriment le potentiel métastatique des cellules cancéreuses sans affecter la croissance tumorale primaire) et continuent donc d’être un outil de recherche précieux.

L’imagerie numérique et l’analyse de lames sont rapidement devenues un pilier de la modélisation diagnostique et expérimentale de souris39. L’utilisation du type d’approche décrit ici pour analyser la charge tumorale métastatique pulmonaire permettra des analyses à haut débit de manière plus complète et plus précise. En outre, la pathologie par imagerie numérique offre une avenue pour des projets de recherche plus collaboratifs impliquant des pathologistes spécialisés dans des domaines tels que les modèles murins de métastases du cancer du sein. Au fur et à mesure que les méthodes d’imagerie tissulaire multiplex et les technologies d’imagerie 3D (comme mentionné ci-dessus) continuent d’être développées, la pathologie d’imagerie numérique, les logiciels sophistiqués d’analyse d’images et l’expertise des pathologistes seront certainement nécessaires pour faire progresser la recherche sur les métastases.

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Disclosures

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Acknowledgments

Les données représentatives ont été financées par l’Institut national du cancer (K22CA218549 à S.T.S). En plus de leur aide dans le développement de la méthode d’analyse complète décrite ici, nous remercions l’Ohio State University Comprehensive Cancer Center Comparative Pathology and Mouse Phenotyping Shared Resource (Directrice – Krista La Perle, DVM, PhD) pour les services d’histologie et d’immunohistochimie et le Pathology Imaging Core pour le développement et l’analyse d’algorithmes.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
alcohol prep pads Fisher Scientific 22-363-750 for cleaning tail prior to injection
dissection scissors Fisher Scientific 08-951-5 for mouse dissection and lung tissue inflation
DMEM with L-Glutamine, 4.5g/L Glucose and Sodium Pyruvate Fisher Scientific MT10013CV cell culture media base for MDA-MB-231 and MVT1 cell lines
Dulbecco's Phosphate-Buffered Salt Solution 1x Fisher Scientific MT21030CV used for resuspending tumor cells for injection
ethanol (70 % solution) OSU used to minimize mouse's fur during dissection; use caution - flammable
Evan's blue dye Millipore Sigma E2129 used at 1 % in sterile PBS for practice with tail-vein injection method; use caution - dangerous reagent
Fetal Bovine Serum Millipore Sigma F4135 cell culture media additive; used at 10% in DMEM
forceps Fisher Scientific 10-270 for dissection and lung tissue inflation
FVB/NJ mice The Jackson Laboratory 001800 syngeneic mouse strain for MVT1 cells
hemacytometer (Bright-Line) Millipore Sigma Z359629 for use in cell culture to obtain cell counts
insulin syringe (28 G) Fisher Scientific 14-829-1B for tail-vein injections (BD 329424)
MDA-MB-231 cells ATCC human breast cancer cell line
MVT1 cells mouse mammary tumor cells
needles (26 G) Fisher Scientific 14-826-15 used to inflate the mouse's lungs
neutral buffered formalin (10%) Fisher Scientific 245685 used as a tissue fixative and to inflate lung tissue; use caution - dangerous reagent
NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ (NSG) mice The Jackson Laboratory 005557 maintained by OSUCCC Target Validation Shared Resource
Penicillin Streptomycin 100x ThermoFisher 15140163 cell culture media additive
sterile gauze Fisher Scientific NC9379092 for applying pressue to mouse's tail if bleeding occurs
syringe (5 mL) Fisher Scientific 14-955-458 used to inflate mouse lung tissue
tail-vein restrainer Braintree Scientific, Inc. TV-150 STD used to restrain mouse for tail-vein injections
Trypan blue (0.4 %) ThermoFisher 15250061 used in cell culture to assess viability
Trypsin-EDTA 0.25 % ThermoFisher 25200-114 used in cell culture to detach tumor cells from plate

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Cancer Research Numéro 159 injection de veines de la queue cancer du sein métastases pulmonaires sections colorées H&E pathologie numérique quantitative analyse d’images

Erratum

Formal Correction: Erratum: Pathological Analysis of Lung Metastasis Following Lateral Tail-Vein Injection of Tumor Cells
Posted by JoVE Editors on 12/02/2020. Citeable Link.

An erratum was issued for: Pathological Analysis of Lung Metastasis Following Lateral Tail-Vein Injection of Tumor Cells. The author list was updated.

The author list was updated from:

Katie A. Thies1, Sue E. Knoblaugh2, and Steven T. Sizemore1
1Department of Radiation Oncology, Arthur G. James Comprehensive Cancer Center and Richard L. Solove Research Institute, The Ohio State University Medical Center
2Department of Veterinary Biosciences, Comparative Pathology and Digital Imaging Shared Resource, The Ohio State University

to:

Katie A. Thies1, Sarah Steck1, Sue E. Knoblaugh2, and Steven T. Sizemore1
1Department of Radiation Oncology, Arthur G. James Comprehensive Cancer Center and Richard L. Solove Research Institute, The Ohio State University Medical Center
2Department of Veterinary Biosciences, Comparative Pathology and Digital Imaging Shared Resource, The Ohio State University

Analyse pathologique des métastases pulmonaires après injection latérale de cellules tumorales dans la veine caudale
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Thies, K. A., Steck, S., Knoblaugh,… More

Thies, K. A., Steck, S., Knoblaugh, S. E., Sizemore, S. T. Pathological Analysis of Lung Metastasis Following Lateral Tail-Vein Injection of Tumor Cells. J. Vis. Exp. (159), e61270, doi:10.3791/61270 (2020).

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