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Cancer Research

Análisis patológico de metástasis pulmonares después de la inyección lateral de células tumorales en la vena de la cola

Published: May 20, 2020 doi: 10.3791/61270
Automatic Translation
1, 1, 2, 1
1Department of Radiation Oncology, Arthur G. James Comprehensive Cancer Center and Richard L. Solove Research Institute, The Ohio State University Medical Center, 2Department of Veterinary Biosciences, Comparative Pathology and Digital Imaging Shared Resource, The Ohio State University

ERRATUM NOTICE

Summary

La inyección intravenosa de células cancerosas se usa a menudo en la investigación de metástasis, pero la carga tumoral metastásica puede ser difícil de analizar. Aquí, demostramos un modelo de metástasis de inyección en la vena de la cola e incluimos un enfoque novedoso para analizar la carga tumoral de pulmón metastásica resultante.

Abstract

La metástasis, la principal causa de morbilidad y mortalidad para la mayoría de los pacientes con cáncer, puede ser difícil de modelar preclínicamente en ratones. Pocos modelos de metástasis espontáneas están disponibles. Por lo tanto, el modelo experimental de metástasis que implica la inyección de la vena de la cola de líneas celulares adecuadas es un pilar de la investigación de metástasis. Cuando las células cancerosas se inyectan en la vena de la cola lateral, el pulmón es su sitio preferido de colonización. Una limitación potencial de esta técnica es la cuantificación precisa de la carga tumoral pulmonar metastásica. Mientras que algunos investigadores cuentan macrometástasis de un tamaño predefinido y/o incluyen micrometástasis después de la seccionamiento del tejido, otros determinan el área de lesiones metastásicas en relación con el área normal del tejido. Ambos métodos de cuantificación pueden ser extremadamente difíciles cuando la carga metastásica es alta. Aquí, demostramos un modelo de inyección intravenosa de metástasis pulmonar seguido de un método avanzado para cuantificar la carga tumoral metastásica utilizando un software de análisis de imágenes. Este proceso permite la investigación de múltiples parámetros de punto final, incluido el tamaño promedio de la metástasis, el número total de metástasis y el área total de metástasis, para proporcionar un análisis completo. Además, este método ha sido revisado por un patólogo veterinario certificado por el Colegio Americano de Patólogos Veterinarios (SEK) para garantizar la precisión.

Introduction

A pesar de ser un proceso altamente complejo e ineficiente1, la metástasis es un contribuyente significativo a la morbilidad y mortalidad de los pacientes con cáncer2. De hecho, la mayoría de las muertes relacionadas con el cáncer se atribuyen a la propagación metastásica de la enfermedad3,4. Para que las células tumorales hagan metástasis con éxito, deben desprenderse del sitio primario, invadir a través del estroma contiguo, intravasar en la circulación sanguínea o linfática, viajar al lecho capilar de un sitio secundario, extravasar en el tejido secundario y proliferar o crecer para formar lesiones metastásicas5. El uso de modelos de ratón ha sido fundamental para avanzar en la comprensión de los mecanismos moleculares responsables de la siembra y el crecimiento metastásico6,7. Aquí, nos centramos en la metástasis del cáncer de mama, para la cual a menudo se utilizan tanto modelos de ratón modificados genéticamente como métodos de trasplante, cada uno con su propio conjunto de ventajas y limitaciones.

Los modelos de tumores mamarios genéticamente modificados hacen uso de promotores específicos de la glándula mamaria, incluyendo MMTV-LTR (repetición terminal larga del virus tumoral mamario de ratón) y WAP (Proteína ácida de suero de leche), para impulsar la expresión de transgenes en el epitelio mamario8. Los oncogenes que incluyen el antígeno T medio del polioma (PyMT), ErbB2 / Neu, c-Myc, Wnt-1 y el virus simio 40 (SV40) se han expresado de esta manera9,10,11,12,13, y aunque estos modelos genéticos son útiles para estudiar el inicio y la progresión del tumor primario, pocos hacen metástasis fácilmente en órganos distantes. Además, estos modelos genéticos de ratón son a menudo más prohibitivos en tiempo y costo que los modelos de metástasis espontáneas o experimentales. Dada la limitación de la mayoría de los modelos de tumores mamarios genéticamente modificados para estudiar la metástasis, las técnicas de trasplante se han convertido en métodos atractivos para estudiar este complejo proceso. Esto incluye la inyección ortotópica, de la vena de la cola, intracardíaca e intracraneal de líneas celulares adecuadas.

Aunque varias líneas celulares de cáncer de mama hacen metástasis fácilmente después de la inyección ortotópica en la almohadilla de grasa mamaria14,15, la consistencia y reproducibilidad de la carga tumoral metastásica puede ser un desafío, y la duración de dichos estudios puede ser del orden de varios meses. Para evaluar la metástasis pulmonar, en particular, la inyección intravenosa en la vena de la cola es a menudo un método más reproducible y efectivo en el tiempo con diseminación metastásica que generalmente ocurre en el lapso de unas pocas semanas. Sin embargo, dado que el modelo de inyección intravenosa omite los pasos iniciales de la cascada metastásica, se debe tener cuidado al interpretar los resultados de estos estudios. En esta demostración, mostramos la inyección de células tumorales mamarias en la vena de la cola junto con un método de análisis preciso y completo.

A pesar de que la comunidad investigadora ha logrado avances significativos en la comprensión del complejo proceso de la metástasis del cáncer de mama, se estima que más de 150.000 mujeres tienen actualmente cáncer de mama metastásico16. De las pacientes con cáncer de mama en estadio IV, >36% de las pacientes presentan metástasis pulmonar17; sin embargo, el patrón específico del sitio y la incidencia de metástasis pueden variar según el subtipo molecular18,19,20,21. Las pacientes con metástasis pulmonares asociadas al cáncer de mama tienen una mediana de supervivencia de solo 21 meses, lo que pone de manifiesto la necesidad de identificar tratamientos efectivos y nuevos biomarcadores para esta enfermedad17. El uso de modelos experimentales de metástasis, incluida la inyección intravenosa de células tumorales, continuará avanzando en nuestro conocimiento de este importante desafío clínico. Cuando se combinan con la patología de imágenes digitales y el método de análisis de la carga tumoral pulmonar metastásica descrito en este protocolo, las inyecciones de la vena de la cola son una herramienta valiosa para la investigación de metástasis del cáncer de mama.

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Protocol

El uso de animales siguió las regulaciones de Recursos Animales de Laboratorio de la Universidad (ULAR) bajo el protocolo aprobado por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) de OSU 2007A0120-R4 (PI: Dra. Gina Sizemore).

1. Inyección de células de cáncer de mama en la vena de la cola

  1. Preparación de células y jeringa para inyección
    1. Placa un número apropiado de células en función del número de ratones y la concentración de células que se utilizará.
      NOTA: El número de células inyectadas y el tiempo hasta el desarrollo de metástasis dependerá de la línea celular utilizada y deberá optimizarse. En esta demostración, 1 x 106 células MDA-MB-231 se inyectan por vía intravenosa en ratones NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ (NSG), y se observan lesiones pulmonares macroscópicas a más tardar 24 días después de la inyección. Para la línea celular tumoral mamaria murina MVT117, se inyectan 3 x 106 células en ratones FVB/N inmunocompetentes con numerosas metástasis pulmonares observadas a los 14 días22,23.
    2. Aspirar medios y enjuagar placas celulares con 1x PBS. Tripsinizar las células en un volumen mínimo, agregar el volumen apropiado de medios y contar las células utilizando un hematocitómetro u otro método preferido. El azul de tripano (0,4%) u otros colorantes de células vivas / muertas se pueden usar para determinar recuentos de células viables.
    3. Células de pellets girando a 180 x g durante 5 min.
    4. Resuspender el número apropiado de células en 1x PBS estéril de tal manera que se inyecte un volumen de 100 μL por ratón. Mantenga la suspensión celular en hielo para mantener la viabilidad.
    5. Antes de la inyección, resuspenda completamente las células con una pipeta de 200 μL o 1 ml para evitar la aglomeración. Extraiga 100 μL en una jeringa de insulina de 28 G (ver Tabla de Materiales).
    6. Elimine las burbujas de aire manteniendo la jeringa vertical, golpeando la jeringa y ajustando lentamente el émbolo. Es probable que la inyección de burbujas de aire en la vena cause una embolia de aire / gas que puede ser fatal.
  2. Inyección lateral de la vena de la cola
    NOTA: Para los ensayos experimentales de metástasis de cáncer de mama, las inyecciones se realizan en ratones hembra de > 6 semanas de edad.
    1. Manipule el ratón por la cola y deslice al animal en un tubo ranurado / dispositivo de sujeción de un tamaño apropiado (consulte la Tabla de materiales para el dispositivo de sujeción utilizado).
    2. Inserte la parte del tapón del dispositivo de sujeción y coloque el mouse de lado de modo que su vena de la cola lateral sea fácil de ver. El ratón tiene una arteria ventral en línea con los genitales, una vena dorsal y dos venas caudales laterales.
    3. Limpie la superficie de la cola del ratón con una toallita aséptica. Agarre la cola entre el dedo índice y el pulgar con la mano no dominante y aplique una ligera tensión.
    4. Comenzando en la porción distal de la cola, inserte la aguja paralela a la vena con el bisel terminado.
    5. Si está permitido, vuelva a tapar cuidadosamente la aguja y doblar a un ángulo de 20-30 °. Se recomienda encarecidamente un enfoque con una sola mano o un dispositivo de recapitulación con aguja.
      NOTA: No es necesario aspirar, ya que esto puede hacer que la vena colapse. Sin embargo, se puede ver un pequeño destello de sangre cuando se coloca por primera vez. La aguja avanzará suavemente hacia la vena con la colocación adecuada.
    6. Dispense lentamente el volumen completo en la vena. No debe haber resistencia cuando se empuja el émbolo.
    7. Si se siente alguna resistencia, retire inmediatamente la aguja de la jeringa. Si es necesario, vuelva a insertar la aguja (idealmente no más de 3 intentos) moviéndose hacia el extremo proximal de la cola o la vena lateral opuesta.
    8. Es probable que un pequeño volumen de sangre se desplace después de la inyección. Aplique una presión suave con una gasa estéril y limpie con una toallita aséptica.
    9. Deseche rápidamente la jeringa en un recipiente apropiado para objetos punzantes.
    10. Devuelva el ratón a una jaula limpia y ventilada y monitoree los signos de angustia.
    11. Monitoree a los ratones 2-3 veces por semana para detectar signos de formación de metástasis (dificultad para respirar, postura encorvada, pérdida de peso) y angustia general. El tiempo hasta el desarrollo de la metástasis dependerá de la línea celular y la tensión del ratón.
    12. Si se utiliza un dispositivo de imágenes de animales vivos in vivo, tome imágenes de ratones inmediatamente después de la inyección de la vena de la cola para confirmar la inyección exitosa de células y obtener datos de tiempo "cero" (los detalles específicos sobre las imágenes de bioluminiscencia in vivo no se incluyen aquí, pero se describen por Yang et al.24).

2. Fijación del tejido pulmonar y análisis de la carga tumoral pulmonar metastásica

  1. Inflado del tejido pulmonar para mantener el formato estructural de los pulmones para la histopatología
    1. Después de seguir los procedimientos de eutanasia aprobados (por ejemplo, dióxido de carbono al 30 - 70% de desplazamiento del volumen de la cámara / min), asegure la carcasa del ratón a una placa de disección con alfileres. Rocíe o aplique etanol al 70% para mantener el pelaje del ratón fuera del camino durante la disección.
      NOTA: La asfixia por dióxido de carbono puede causar hemorragia pulmonar como una lesión de fondo esperada, especialmente a velocidades de flujo más lentas.
    2. Abra el tórax con una incisión en la línea media, extienda la incisión cranealmente / caudalmente a través del peritoneo y corte el diafragma agarrando el proceso xifoideo.
    3. Usando un juego separado de tijeras para no opacar las cuchillas, corte las costillas a lo largo de cada lado del esternón y retire cuidadosamente la caja torácica dejando espacio para que los pulmones se expandan.
    4. Aislar la tráquea mediante la extirpación de las glándulas salivales submandibulares y la musculatura infrahioidea. Colocar alfileres a cada lado de la tráquea puede evitar el movimiento no deseado durante la inserción de la aguja.
    5. Llene una jeringa de 26 G con 2-3 ml de formalina tamponada neutra al 10% e insértela en la tráquea.
    6. Inyecte lentamente formalina y observe si los pulmones se expanden (generalmente requiere ~ 1.5 ml de formalina).
    7. Una vez que la formalina comienza a filtrarse de los pulmones (evite el inflado excesivo), pellizque la tráquea con un par de fórceps, retire la aguja de la jeringa y desprenda todo el aparato respiratorio. Coloque los pulmones, el corazón, etc. directamente en la formalina, ya que se puede realizar un recorte adicional del tejido después de la fijación.
    8. Procesamiento completo, incrustación, seccionamiento de tejido y tinción de hematoxilina y eosina (H&E) utilizando métodos estándar.
  2. Análisis de la carga tumoral pulmonar metastásica
    1. Escanee las secciones pulmonares teñidas con H&E en un escáner deslizante de alta resolución con un aumento de 40x (Figura 3).
    2. Importe imágenes en software de análisis de imágenes (por ejemplo, Visiopharm Image Analysis) para la cuantificación de metástasis pulmonares.
      NOTA: Recomendamos que los nuevos usuarios obtengan capacitación in situ o en línea para usar el software de análisis de imágenes. Numerosos seminarios web también están disponibles a través de la página web comercial.
    3. Seleccione la aplicación Visiopharm 10118 H&E Lung Metastasis de la biblioteca de aplicaciones del software.
      NOTA: El propósito de esta aplicación es etiquetar y cuantificar la metástasis pulmonar en diapositivas teñidas de H&E. Como parte de la aplicación 10118 H&E Lung Metastasis, el primer paso de procesamiento de imágenes segmenta el tejido pulmonar con la aplicación de detección de tejidos. El segundo paso de procesamiento de imágenes utiliza la aplicación Metastasis Detect que identifica las metástasis dentro del tejido pulmonar. Las metástasis se identifican a través de la forma junto con regiones que están demasiado deformadas, demasiado rojas o demasiado escasas para ser identificadas como metástasis.
    4. Ajuste los parámetros que definen la forma y la dispersión para que se ajusten mejor a las imágenes representativas. Las áreas segmentadas de metástasis tumorales y tejido pulmonar normal se pueden mostrar utilizando etiquetas de diferentes colores para cada tipo de tejido.
      Nota : en el caso de que la aplicación no pueda separar con precisión las metástasis del tejido pulmonar normal, es posible que sea necesario escribir una aplicación personalizada que use el programa Bosque de decisión de Visiopharm como se hizo para los experimentos (consulte la Figura 2 y la Figura 3). Los detalles para escribir un algoritmo personalizado siguen a continuación. De lo contrario, continúe con el paso 2.2.9.
    5. Abra el programa Decision Forest, que funciona entrenando múltiples clases [es decir, tejido pulmonar (no neoplásico), metástasis, glóbulos rojos, epitelio y / o espacio en blanco] en una imagen deseada. En la Figura 2, las metástasis tumorales son azules, el tejido normal es verde y el epitelio bronquiolar es amarillo. Además, los glóbulos rojos están en rojo y los espacios de aire en rosa.
    6. Siga la serie de preguntas de sí o no que se le indique para entrenar adecuadamente a cada clase para una imagen. La precisión del algoritmo determinará el número de preguntas sí/no. Para el análisis, el algoritmo / aplicación personalizado se escribió con una precisión establecida en 50 (rango 0-100).
    7. Ajuste las características de cada clase aplicando filtros para enfocar, desenfocar, ordenar por forma, etc. para mejorar la precisión del algoritmo/aplicación. Visiopharm ve cada clase a través de uno o varios objetivos conocidos como características. Las características cambian la forma en que la clase ve la imagen para resaltar ciertos colores o intensidades.
      NOTA: Para el algoritmo personalizado, las metástasis que miden 8500 μm2 y superiores se etiquetan y miden como metástasis. Esto explica la varianza de tamaño y las metástasis demasiado pequeñas para detectarlas. En la cuantificación normal de tejidos se incluyeron pequeñas áreas mal formadas y pequeñas áreas metastásicas inferiores a 8500 μm2 .
    8. Guarde la configuración modificada de la aplicación o del algoritmo personalizado y, a continuación, aplique el algoritmo/aplicación a un conjunto completo o serie de tejidos teñidos con H&E.
    9. Por último, exporte todas las variables de salida, que incluyen las enumeradas en la Tabla 1. El área en micras al cuadrado (μm2) se puede cuantificar para cada tipo de tejido y los porcentajes se derivan del área neta total de tejido de la muestra (es decir, el tejido total menos el espacio de aire).
    10. Al crear un algoritmo personalizado, revise las marcas de tejido en consulta con un patólogo veterinario certificado por el Colegio Americano de Patólogos Veterinarios para garantizar mediciones precisas y diferenciar entre los tipos de tejidos.

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Representative Results

Si se utilizan células no marcadas para la inyección de la vena de la cola, puede ser difícil confirmar la colonización pulmonar hasta (1) el momento de la necropsia si se pueden observar macrometástasis o (2) después del análisis histológico si existen metástasis microscópicas. Con una extensa carga de tumores pulmonares metastásicos, los ratones tendrán dificultad para respirar. Al igual que con cualquier estudio de tumores, los ratones deben ser monitoreados cuidadosamente durante toda la duración del estudio. El uso de células marcadas es una manera fácil de confirmar el éxito de la inyección de la vena de la cola; de ahí el uso de células MDA-MB-231 marcadas con luciferasa en la demostración. Sin embargo, las imágenes in vivo no siempre son posibles o necesarias dependiendo del diseño experimental y otros factores. La Figura 1A muestra la señal de bioluminiscencia en el espacio torácico menos de 2 horas después de la inyección en la vena de la cola de células MDA-MB-231 marcadas con luciferasa como confirmación de la inyección precisa. Para este experimento, los recuentos de fotones en la región torácica aumentan con el tiempo y una fuerte señal de bioluminiscencia está presente en el día 24 después de la inyección (Figura 1B y C; nótese el cambio en la barra de escala). En el momento de la necropsia, se observaron muchas lesiones pulmonares macroscópicas en estos ratones (Figura 1D).

Después del procesamiento y tinción adecuada del tejido, las secciones pulmonares teñidas con H&E se pueden escanear o tomar imágenes. La cuantificación de la carga tumoral de pulmón metastásica se puede lograr de manera efectiva utilizando un software de análisis de imágenes y un algoritmo personalizado. Utilizando el algoritmo personalizado, todo el tejido pulmonar se segmenta por diferentes características del tejido (Figura 2A y B). Al segmentar el tejido pulmonar de esta manera, el software puede cuantificar los diversos parámetros enumerados en la Tabla 1. Este análisis se ha realizado en tejido pulmonar de ratones inyectados con células MDA-MB-231 seguido de tratamiento con un fármaco diseñado para bloquear la colonización metastásica o un vehículo de control (DMSO). Los datos brutos de este análisis se muestran en la Tabla 2. Además, la Figura 3A muestra imágenes representativas de H&E de metástasis pulmonares MDA-MB-231 de ratones DMSO o tratados con fármacos. Si bien una diferencia en la carga tumoral metastásica entre estos grupos de tratamiento puede haberse pasado por alto fácilmente ya que el número total de nódulos pulmonares no es diferente, un análisis exhaustivo de todos los parámetros indica una diferencia significativa en el porcentaje neto de metástasis pulmonares (Figura 3B, C). Esto subraya la necesidad de un enfoque integral y exhaustivo para analizar la carga tumoral pulmonar metastásica, como el método descrito en este documento.

Para los datos presentados en la Figura 3, todos los análisis estadísticos se realizaron utilizando GraphPad Prism 7. Los datos se consideraron normalmente distribuidos al pasar cualquiera de las siguientes pruebas de normalidad estándar: D'Agostino-Pearson omnibus, Shapiro-Wilk y Kolmogorov-Smirnov. La comparación entre el vehículo y los grupos tratados con drogas (Figura 3) se realizó mediante la prueba t de Student de dos colas no apareadas. La significación estadística se estableció en P ≤ 0,05.

Figure 1
Figura 1: Confirmación de bioluminiscencia in vivo de la inyección exitosa de la vena de la cola.
(A) Señal de bioluminiscencia representativa en ratones 1 hora después de la inyección en la vena de la cola de células MDA-MB-231 marcadas con luciferasa. (B) Señal de bioluminiscencia representativa en el mismo conjunto de ratones que (A) 24 días después de la inyección en la vena de la cola de células MDA-MB-231 marcadas con luciferasa. [Nótese el cambio en la barra de escala entre (A) y (B)]. (C) Cuantificación de los recuentos de fotones a lo largo del tiempo en ratones inyectados con vena de cola MDA-MB-231. Las barras de error representan la media ± SEM. (n = 8 ratones) (D) Tejido pulmonar no tumoral representativo (derecha) y macrometástasis MDA-MB-231 en los pulmones (izquierda) en el momento de la necropsia. Barras de escala = 50 mm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2: Segmentación de tejidos mediante el software Visiopharm.
(A) Recortes representativos de marcas de tejidos no segmentados y segmentados utilizando el algoritmo de software personalizado. (B) Leyenda para todas las categorías de tejidos segmentadas mediante software. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3: Análisis representativo de la carga tumoral de pulmón metastásico de tejidos teñidos con H&E.
(A) Tinción representativa de H&E de tejido pulmonar de ratones no inyectados y ratones de control (DMSO) y ratones tratados con medicamentos después de la inyección en la vena de la cola de células MDA-MB-231. Las metástasis tumorales representativas se indican con flechas. Barras de escala = 500 μm para aumento 4x y 200 μm para aumento 10x. (B) Gráfico del porcentaje neto de metástasis pulmonares en el área de control y ratones tratados con fármacos. Las barras de error representan la media ± SD. (*) P = 0.022 por la prueba t de Student. (C) Tabla que resume el análisis de la carga tumoral pulmonar metastásica (n = 9 DMSO; n = 9 tratados con fármacos). Después de verificar la distribución normal de los datos, todos los valores de P en la tabla se determinaron mediante la prueba t de Student de dos colas no emparejada. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Parámetro Descripción
Área total de tejido (μm2) Área en micras cuadradas que incluye todas las metástasis tumorales, pulmón normal y áreas de glóbulos rojos.
Recuento de metástasis Número total de metástasis dentro del tejido pulmonar.
Porcentaje de área de metástasis (μm2) Área total de metástasis dividida por área de tejido neto x 100.
Tejido total + área de espacio en blanco (μm2) Área en micras cuadradas que incluye todo el tejido y el espacio en blanco.
Área neta de tejido (μm2) Área de tejido en micras cuadradas (mets y pulmón normal) sin espacio en blanco y glóbulos rojos.
Área de metástasis total (μm2) Área de metástasis total en micras cuadradas segmentada por el algorithim del Bosque de Decisión.
Área media de metástasis (μm2) Área media (promedio) en micras cuadradas de metástasis dentro de cada imagen.
Área mediana de metástasis (μm2) Área mediana de metástasis en micras cuadradas. Un número igual de metástasis cae por debajo de este valor y un número igual de metástasis es mayor que el valor medio.

Tabla 1: Parámetros medidos con software. Lista de parámetros junto con una descripción de cada medición que se calcula utilizando el algoritmo personalizado.

Diapositiva Recuento de metástasis Porcentaje de área de metástasis (μm2) Tejido total + área de espacio en blanco (μm2) Espacio en blanco total (μm2) Área neta de tejido (μm2) Área de metástasis total (μm2) Área de glóbulos rojos (μm2) Área media de metástasis (μm2) Área mediana de metástasis (μm2)
171 Diapositiva pulmonar 1 435 8.90 185698000 83201800 92031400 8189250 10464800 18825.86 14748.73
171 Diapositiva pulmonar 2 323 8.37 185698000 83201800 92054740 7708990 10441460 23866.84 14748.73
172 Diapositiva pulmonar 1 151 2.73 181546000 89509904 81571296 2225220 10464800 14736.56 12486.37
172 Diapositiva pulmonar 2 142 2.60 170708000 81735504 80558196 2093040 8414300 14739.72 12119.62
173 Diapositiva pulmonar 1 634 11.60 234104992 102153000 115606692 13406800 16345300 21146.37 15472.22
173 Diapositiva pulmonar 2 667 12.70 223180992 86778600 122374592 15542700 14027800 23302.40 16531.00
174 Diapositiva pulmonar 1 40 0.55 192452992 80340896 87591096 485121 24521000 12128.03 10484.05
174 Diapositiva pulmonar 2 34 0.51 183918000 71287904 91242796 464830 21387300 13671.47 11181.81
175 Pulmón Diapositiva 1 780 23.93 179544992 44799200 126995782 30388600 7750010 38959.74 19307.76
175 Lung Slide 2 1001 12.58 169191536 43425608 120610754 15169100 5155174 15153.95 19703.08
188 Diapositiva pulmonar 1 569 13.20 162290000 54210000 98486310 12997300 9593690 22842.36 14463.91
188 Diapositiva pulmonar 2 271 5.15 157146000 54250800 91996500 4738100 10898700 17483.76 12657.83
189 Diapositiva pulmonar 1 74 1.70 185292992 95700800 77779392 1318820 11812800 17821.89 14551.08
189 Diapositiva pulmonar 2 74 1.76 182272992 95700800 74759392 1318820 11812800 17821.89 14551.08
816 Diapositiva pulmonar 1 246 5.65 185876000 87568896 81916204 4631050 16390900 18825.41 14371.99
816 Diapositiva pulmonar 2 565 6.05 183220000 76954304 90305396 5462670 15960300 9668.44 14244.82
876 Diapositiva pulmonar 1 468 10.36 208308000 99300096 100947064 10454500 8060840 22338.68 16011.37
876 Diapositiva pulmonar 2 528 11.74 199750896 81642568 110450391 12963400 7657937 24551.89 16699.13
877 Diapositiva pulmonar 1 732 17.98 219340992 99918600 107869992 19397100 11552400 26498.77 18137.52
877 Diapositiva pulmonar 2 605 14.64 207925504 88539712 108168329 15839700 11217463 26181.32 18014.64
878 Diapositiva pulmonar 1 377 10.05 178534000 85610896 81931104 8232340 10992000 21836.45 16671.03
878 Diapositiva pulmonar 2 376 9.88 170544000 75337904 86108406 8511710 9097690 22637.53 16754.38
879 Diapositiva pulmonar 1 205 5.22 167556000 89999000 68123630 3553860 9433370 17335.90 13845.69
879 Diapositiva pulmonar 2 213 4.64 167931008 80789400 78489588 3638720 8652020 17083.19 14058.12
881 Diapositiva pulmonar 1 1122 38.81 218880000 79713504 130893816 50802300 8272680 45278.34 22044.99
881 Diapositiva pulmonar 2 628 21.67 184200992 74502600 99122692 21475200 10575700 34196.18 19857.40
882 Lung Slide 1 678 24.05 194476992 83941904 98484788 23684500 12050300 34932.89 20748.06
882 Diapositiva pulmonar 2 645 21.93 185537040 75790040 101412430 22241700 8334570 34483.26 20325.11
883 Diapositiva pulmonar 1 429 10.79 179400992 84955696 84699866 9138800 9745430 21302.56 15080.23
883 Diapositiva pulmonar 2 342 85.30 175220992 76210896 90472386 77170200 8537710 225643.86 17078.26
884 Lung Slide 1 359 6.42 206751008 87752600 103825008 6669710 15173400 18578.58 14333.41
884 Lung Slide 2 480 9.12 200990000 77052496 111060804 10125700 12876700 21095.21 15679.88
885 Lung Slide 1 332 7.79 191398000 92896304 84752596 6605490 13749100 19896.05 14500.11
885 Diapositiva pulmonar 2 537 81.02 187475008 85938000 89378408 72411104 12158600 134843.77 15360.29
886 Diapositiva pulmonar 1 305 7.93 158435008 80433296 76541662 6068720 1460050 19897.44 14500.11
886 Diapositiva pulmonar 2 898 8.84 155460000 70808600 83457470 7380490 1193930 8218.81 14744.92

Tabla 2: Tabla representativa de resultados. Tabla de resultados para cada parámetro del algoritmo de una cohorte de ratones con vena caudal inyectada con células MDA-MB-231.

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Discussion

A medida que los investigadores continúan utilizando la inyección intravenosa de células tumorales como modelo experimental para la metástasis, faltan prácticas estándar para analizar la carga tumoral metastásica resultante. En algunos casos, se pueden observar diferencias significativas en la carga tumoral metastásica tras la manipulación de líneas celulares particulares y/o el uso de compuestos químicos por vía macroscópica. Sin embargo, en otros casos, las diferencias sutiles en la siembra y el crecimiento metastásicos pueden pasarse por alto o malinterpretarse sin un análisis patológico exhaustivo. Este estudio avanza los protocolos de inyección de la vena de la cola publicados anteriormente al incluir un método integral de análisis de la carga tumoral pulmonar metastásica. Es importante destacar que este método de análisis de patología digital también se puede aplicar a la cuantificación de la carga tumoral metastásica pulmonar después de la inyección ortotópica de células tumorales que son capaces de metástasis espontáneas, así como otros modelos experimentales de metástasis (es decir, intracardíaco, etc.) y modelos de xenoinjerto derivado del paciente (PDX). El uso de imágenes digitales y el desarrollo de algoritmos de software por parte de patólogos veterinarios garantiza la reproducibilidad, precisión y minuciosidad de este enfoque para analizar la carga tumoral pulmonar metastásica25.

Es absolutamente necesaria una decisión cuidadosa de las líneas celulares, la concentración celular y los puntos finales basada en estudios publicados previamente o en una cuidadosa optimización experimental. Dado que la siembra y colonización metastásicas dependen en gran medida de las interacciones con diversas poblaciones de células inmunitarias26,27, el uso de ratones inmunocompetentes es ideal, aunque no siempre factible. Por la misma razón, la interpretación de los estudios experimentales de metástasis con ratones atímicos o NSG, que carecen de componentes clave de células inmunes, debe tomarse con precaución. Existen varias líneas celulares de tumores mamarios de ratón, incluidas las células MVT1 utilizadas en este estudio, que se han derivado de la cepa de ratón FVB/N22,28,29. También existen otros modelos singénicos. Con respecto a la concentración celular, la inyección de un gran número de células puede acelerar y mejorar en gran medida la carga tumoral pulmonar metastásica. Sin embargo, si los pulmones están abrumados, puede ser difícil distinguir los focos metastásicos individuales y los émbolos tienen más probabilidades de ocurrir. Además, el procedimiento de inyección de la vena de la cola requiere una amplia práctica y capacitación antes de realizar inyecciones de manera segura y / o rutinaria. Muchas instituciones ofrecerán capacitación técnica y pueden proporcionar ratones para fines de práctica. La colocación adecuada de la aguja y una inyección suave deben indicar el éxito; sin embargo, para fines de entrenamiento / práctica, el tinte Evans Blue se puede usar para ayudar a determinar la inyección exitosa (1% en PBS estéril). Las extremidades del ratón se volverán azules poco después de la inyección, pero el animal debe ser sacrificado después.

Además, no se puede enfatizar lo suficiente la importancia de las técnicas estándar de necropsia y muestreo de tejidos para controlar y prevenir los artefactos de diapositivas que pueden afectar el escaneo y análisis de diapositivas por parte del software de análisis de imágenes. El inflado de los pulmones en el momento de la necropsia es un paso crítico para mantener la integridad del tejido y mejora la tinción posterior de H&E, así como el análisis final. Para mayor coherencia con la resolución y la reproducibilidad, se recomienda que todas las diapositivas de un conjunto de estudio se escaneen con el mismo objetivo. En este estudio, todas las diapositivas se escanearon a 40x para garantizar la precisión de la configuración del algoritmo y la identificación adecuada de las metástasis tumorales cuando se aplican a los campos analizados. Para cada diapositiva, los mismos lóbulos pulmonares se escanearon y analizaron consistentemente para cada ratón. También se recomienda encarecidamente que un patólogo revise las marcas de tejido para verificar la precisión del algoritmo aplicado y que se aplique el mismo algoritmo a cada diapositiva de un estudio.

El protocolo presentado se puede modificar de acuerdo con el diseño experimental, las preferencias del usuario y las mediciones de resultados deseadas. Una de estas modificaciones incluye el uso de una cámara de inducción de anestesia en lugar de un dispositivo de restricción convencional para un animal consciente. En términos de salud y bienestar animal, ninguno de los dos enfoques es superior al otro y cada uno tiene su propio conjunto de ventajas y limitaciones30. Además, para ratones negros o marrones, se puede necesitar una fuente de luz o un dispositivo de calentamiento para visualizar las venas de la cola. Se pueden usar lámparas infrarrojas o un baño de agua tibia para dilatar las venas. Sin embargo, la temperatura debe ser monitoreada cuidadosamente. Además, hay dispositivos de retención iluminados disponibles, así como otras versiones comerciales de dispositivos de retención de roedores. Algunos investigadores prefieren las jeringas Luer-Lok para inyecciones. Nos resulta más difícil eliminar las burbujas de aire con jeringas Luer-Lok, pero es una cuestión de preferencia. La viabilidad de las células es una consideración importante para el procedimiento de inyección de la vena de la cola y, por lo tanto, los recuentos celulares precisos, así como el mantenimiento de las células en el hielo antes de la inyección son pasos necesarios. Si se compara la siembra pulmonar y la colonización de líneas celulares manipuladas, es fundamental determinar cualquier diferencia en el tamaño celular y la viabilidad antes de la inyección, ya que pueden complicar la interpretación de los resultados. La muerte celular y / o daño puede ocurrir cuando se usa una aguja de calibre estrecho; sin embargo, no se recomienda que se use una aguja mayor de 25 G, ya que puede causar dolor e incomodidad al animal.

Como una forma de validar que las lesiones pulmonares están formadas por células tumorales inyectadas, la inmunotinción se puede hacer en secciones de tejido. Si se utilizan líneas celulares humanas, se pueden usar anticuerpos específicos para humanos para discernir lesiones metastásicas. Alternativamente, si se utilizan líneas celulares marcadas (por ejemplo, GFP), se pueden usar los anticuerpos correspondientes. Además, muchas líneas celulares de cáncer de mama son positivas para marcadores epiteliales (es decir, citoqueratinas, E-cadherina y EpCAM), pero el conocimiento previo de la expresión es esencial. Sin embargo, el epitelio pulmonar que recubre las vías respiratorias también será positivo para estos marcadores y, por lo tanto, también se debe considerar la estructura. Puede haber casos en los que se deba descartar el desarrollo de tumores pulmonares primarios. Para ello, la tinción inmunohistoquímica para el factor de transcripción tiroidea-1 (TTF1) se puede utilizar como marcador de adenocarcinoma pulmonar primario. La tinción de TTF1 debe ser evaluada por un patólogo certificado.

Aquí, se escribió un algoritmo personalizado utilizando un algoritmo de clasificación del Bosque de Decisión porque el algoritmo de metástasis pulmonar establecido no se pudo ajustar para la detección precisa de metástasis que variaban en tamaño. Este algoritmo personalizado permite mediciones complejas, permite una segmentación precisa de las metástasis por tamaño y admite un corte de tamaño para que las pequeñas áreas deformadas y las estructuras normales no se malinterpreten y, por lo tanto, puedan incluirse en el conjunto de datos final. Anticipamos que este algoritmo será aplicable a la mayoría de los estudios de metástasis pulmonar in vivo, pero los usuarios pueden necesitar ajustar la configuración dentro del software para adaptarse a sus necesidades de estudio individuales. Sin embargo, este algoritmo sirve como una plataforma para los investigadores que desean analizar la carga metastásica pulmonar de una manera similar. Existen muchas opciones diferentes para las plataformas de análisis de imágenes en las que el acceso o la disponibilidad, el costo y la capacitación, así como el nivel de experiencia, pueden dictar la mejor plataforma para utilizar36. La gama de opciones incluye plataformas gratuitas como QuPath y plataformas más caras, pero sofisticadas, como Visiopharm. Se recomienda que se consulte con un núcleo de patología de análisis de imágenes y un patólogo al decidir qué plataforma puede estar disponible y utilizarse mejor para un proyecto de investigación en particular.

Los modelos espontáneos de tumores mamarios de ratón (por ejemplo, MMTV-PyMT) o los métodos de inyección ortotópica de almohadilla de grasa mamaria representan el modelo fisiológicamente más relevante para estudiar la metástasis pulmonar. Un inconveniente grave del modelo de inyección de la vena de la cola es que no recapitula la cascada metastásica completa y, por lo tanto, se limita al estudio de la extravasación de células tumorales y la colonización secundaria de órganos. Sin embargo, este modelo experimental de metástasis es relevante para la investigación del cáncer de mama ya que las metástasis pulmonares formadas tras la inyección de la vena de la cola tienen perfiles genómicos similares a las lesiones metastásicas que se desarrollan tras la implantación ortotópica de las mismas células31. Para establecer un modelo de metástasis pulmonar, a menudo se inyecta un gran número de células por vía intravenosa, lo que puede no representar con precisión el proceso de metástasis en lo que respecta a la siembra, la reacción inmune y la latencia. Además, según la vía circulatoria, las metástasis pulmonares son más frecuentes con la inyección de la vena de la cola32. Con la mayoría de las líneas celulares de cáncer de mama, los informes publicados indican una incidencia relativamente baja de metástasis óseas, hepáticas o cerebrales después de la inyección de la vena de la cola7. Los métodos alternativos de metástasis experimentales como las inyecciones intracardíacas, intratibiales, portas e intracarotidas son más apropiados para examinar las metástasis en otros sitios33,34,35,36,37. Una vez más, se prefieren los modelos de tumores mamarios espontáneos o los métodos de inyección de almohadillas de grasa ortotópicas que recapitulan todos los pasos de la cascada metastásica. Los problemas con la carga constante del tumor metastásico, la duración del estudio y el número de animales necesarios para tales estudios son una desventaja. Sin embargo, el método de análisis de patología digital presentado aquí en se puede aplicar a las metástasis pulmonares formadas a través de cualquier modelo de metástasis espontánea o experimental.

El método de análisis también arroja ciertas limitaciones como la subjetividad en la creación de algoritmos. Aunque las imágenes de diapositivas completas permiten el análisis digital en toda una sección de tejido y en todos los lóbulos pulmonares de un solo ratón, se limita a un análisis bidimensional de un tejido 3D. La estereología se está convirtiendo en una práctica común que obtiene información 3D para el análisis de imágenes y puede explicar factores como la contracción del tejido que ocurre durante el procesamiento de tejidos38. La estereología, sin embargo, tiene sus propias limitaciones, como el tejido, los recursos y las limitaciones de tiempo.

Dado el número de pacientes con cáncer afectados por la propagación metastásica de su enfermedad, el método de inyección de la vena de la cola para estudiar la metástasis seguirá siendo una herramienta útil en términos de comprender la complicada biología de la propagación metastásica y en la determinación de la eficacia preclínica de las nuevas terapias. Los modelos de metástasis de ratón in vivo, en particular los que utilizan animales inmunocompetentes, son cada vez más importantes para la investigación del cáncer dado el interés generalizado en la inmunoterapia29. Además, los modelos experimentales de metástasis son críticos en términos de investigación de genes supresores de metástasis (es decir, aquellos que suprimen el potencial metastásico de las células cancerosas sin afectar el crecimiento del tumor primario) y, por lo tanto, continúan siendo una valiosa herramienta de investigación.

Las imágenes digitales y el análisis de diapositivas se han convertido rápidamente en un pilar en el modelado diagnóstico y experimental de ratones39. El uso del tipo de enfoque descrito en este documento para analizar la carga tumoral metastásica de pulmón permitirá realizar análisis de alto rendimiento de una manera más completa y precisa. Además, la patología de imágenes digitales proporciona una vía para proyectos de investigación más colaborativos que involucran a patólogos que se especializan en áreas como modelos de ratón de metástasis de cáncer de mama. A medida que los métodos de imágenes de tejidos multiplex y las tecnologías de imágenes 3D (como se mencionó anteriormente) continúan desarrollándose, la patología de imágenes digitales, los sofisticados programas de software para el análisis de imágenes y la experiencia de los patólogos serán ciertamente necesarios para avanzar en la investigación de metástasis.

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Disclosures

Los autores no tienen nada que revelar.

Acknowledgments

Los datos representativos se financiaron a través del Instituto Nacional del Cáncer (K22CA218549 a S.T.S). Además de su asistencia en el desarrollo del método de análisis integral que se informa en este documento, agradecemos a The Ohio State University Comprehensive Cancer Center Comparative Pathology and Mouse Phenotyping Shared Resource (Director – Krista La Perle, DVM, PhD) por los servicios de histología e inmunohistoquímica y al Pathology Imaging Core por el desarrollo y análisis de algoritmos.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
alcohol prep pads Fisher Scientific 22-363-750 for cleaning tail prior to injection
dissection scissors Fisher Scientific 08-951-5 for mouse dissection and lung tissue inflation
DMEM with L-Glutamine, 4.5g/L Glucose and Sodium Pyruvate Fisher Scientific MT10013CV cell culture media base for MDA-MB-231 and MVT1 cell lines
Dulbecco's Phosphate-Buffered Salt Solution 1x Fisher Scientific MT21030CV used for resuspending tumor cells for injection
ethanol (70 % solution) OSU used to minimize mouse's fur during dissection; use caution - flammable
Evan's blue dye Millipore Sigma E2129 used at 1 % in sterile PBS for practice with tail-vein injection method; use caution - dangerous reagent
Fetal Bovine Serum Millipore Sigma F4135 cell culture media additive; used at 10% in DMEM
forceps Fisher Scientific 10-270 for dissection and lung tissue inflation
FVB/NJ mice The Jackson Laboratory 001800 syngeneic mouse strain for MVT1 cells
hemacytometer (Bright-Line) Millipore Sigma Z359629 for use in cell culture to obtain cell counts
insulin syringe (28 G) Fisher Scientific 14-829-1B for tail-vein injections (BD 329424)
MDA-MB-231 cells ATCC human breast cancer cell line
MVT1 cells mouse mammary tumor cells
needles (26 G) Fisher Scientific 14-826-15 used to inflate the mouse's lungs
neutral buffered formalin (10%) Fisher Scientific 245685 used as a tissue fixative and to inflate lung tissue; use caution - dangerous reagent
NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ (NSG) mice The Jackson Laboratory 005557 maintained by OSUCCC Target Validation Shared Resource
Penicillin Streptomycin 100x ThermoFisher 15140163 cell culture media additive
sterile gauze Fisher Scientific NC9379092 for applying pressue to mouse's tail if bleeding occurs
syringe (5 mL) Fisher Scientific 14-955-458 used to inflate mouse lung tissue
tail-vein restrainer Braintree Scientific, Inc. TV-150 STD used to restrain mouse for tail-vein injections
Trypan blue (0.4 %) ThermoFisher 15250061 used in cell culture to assess viability
Trypsin-EDTA 0.25 % ThermoFisher 25200-114 used in cell culture to detach tumor cells from plate

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Erratum

Formal Correction: Erratum: Pathological Analysis of Lung Metastasis Following Lateral Tail-Vein Injection of Tumor Cells
Posted by JoVE Editors on 12/02/2020. Citeable Link.

An erratum was issued for: Pathological Analysis of Lung Metastasis Following Lateral Tail-Vein Injection of Tumor Cells. The author list was updated.

The author list was updated from:

Katie A. Thies1, Sue E. Knoblaugh2, and Steven T. Sizemore1
1Department of Radiation Oncology, Arthur G. James Comprehensive Cancer Center and Richard L. Solove Research Institute, The Ohio State University Medical Center
2Department of Veterinary Biosciences, Comparative Pathology and Digital Imaging Shared Resource, The Ohio State University

to:

Katie A. Thies1, Sarah Steck1, Sue E. Knoblaugh2, and Steven T. Sizemore1
1Department of Radiation Oncology, Arthur G. James Comprehensive Cancer Center and Richard L. Solove Research Institute, The Ohio State University Medical Center
2Department of Veterinary Biosciences, Comparative Pathology and Digital Imaging Shared Resource, The Ohio State University

Análisis patológico de metástasis pulmonares después de la inyección lateral de células tumorales en la vena de la cola
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Thies, K. A., Steck, S., Knoblaugh, S. E., Sizemore, S. T. Pathological Analysis of Lung Metastasis Following Lateral Tail-Vein Injection of Tumor Cells. J. Vis. Exp. (159), e61270, doi:10.3791/61270 (2020).

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