Waiting
로그인 처리 중...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Cancer Research
Click here for the English version

Cancer Research

Patologisk analys av lungmetastasering efter lateral svansveninjektion av tumörceller

Published: May 20, 2020 doi: 10.3791/61270
Automatic Translation
1, 1, 2, 1
1Department of Radiation Oncology, Arthur G. James Comprehensive Cancer Center and Richard L. Solove Research Institute, The Ohio State University Medical Center, 2Department of Veterinary Biosciences, Comparative Pathology and Digital Imaging Shared Resource, The Ohio State University

ERRATUM NOTICE

Summary

Intravenös injektion av cancerceller används ofta i metastaseringsforskning, men den metastaserande tumörbördan kan vara svår att analysera. Häri visar vi en tail-vein injektion modell av metastasering och inkluderar en ny metod för att analysera den resulterande ögonbevarande lung tumör bördan.

Abstract

Metastasering, den främsta orsaken till sjuklighet och dödlighet för de flesta cancerpatienter, kan vara utmanande att modellera prekliniskt hos möss. Få spontana metastaseringsmodeller finns tillgängliga. Således är den experimentella metastaseringsmodellen som involverar svansvenininjektion av lämpliga cellinjer en stöttepelare i metastaseringsforskning. När cancerceller injiceras i den laterala svansvenen är lungan deras föredragna plats för kolonisering. En potentiell begränsning av denna teknik är den exakta kvantifieringen av den ögonbevarande lungtumörbördan. Medan vissa utredare räknar makrometastaser av en fördefinierad storlek och/eller inkluderar mikrometastaser efter vävnadssektion, bestämmer andra området för ögonbevarande lesioner i förhållande till normalt vävnadsområde. Båda dessa kvantifieringsmetoder kan vara mycket svåra när den metastaserande bördan är hög. Häri visar vi en intravenös injektion modell av lung metastasering följt av en avancerad metod för att kvantifiera ögonbevarande tumör börda med hjälp av bild analys programvara. Denna process möjliggör undersökning av flera slutpunktsparametrar, inklusive genomsnittlig metastaseringsstorlek, totalt antal metastaser och totalt metastaseringsområde, för att ge en omfattande analys. Dessutom har denna metod granskats av en veterinärpatolog som certifierats av American College of Veterinary Pathologists (SEK) för att säkerställa noggrannhet.

Introduction

Trots att det är en mycket komplex och ineffektiv process1, är metastasering en betydande bidragande orsak till sjuklighet och dödlighet hos cancerpatienter2. Faktum är att de flesta cancerrelaterade dödsfall tillskrivs metastaserad spridning av sjukdom3,4. För att tumörceller framgångsrikt ska kunna metastasera måste de lossna från den primära platsen, invadera genom angränsande stroma, intravasate in i blodcirkulationen eller lymfatiska, resa till kapillärbädden på en sekundär plats, extravasate in i den sekundära vävnaden och föröka sig eller växa till att bilda ögonbevarande lesioner5. Användningen av musmodeller har varit avgörande för att främja förståelsen av de molekylära mekanismer som ansvarar för metastaserad sådd och tillväxt6,7. Häri fokuserar vi på bröstcancermetastasering, för vilka både genetiskt modifierade musmodeller och transplantationsmetoder ofta används – var och en med sin egen uppsättning fördelar och begränsningar.

Genetiskt konstruerade brösttumörmodeller använder sig av bröstkörtelspecifika promotorer, inklusive MMTV-LTR (musäggstumörvirus lång terminal upprepning) och WAP (Whey Acidic Protein), för att driva uttryck av transgener i bröst epitelium8. Onkogener inklusive polyom mellersta T antigen (PyMT), ErbB2/Neu, c-Myc, Wnt-1 och simian virus 40 (SV40) har uttryckts på detta sätt9,10,11,12,13, och medan dessa genetiska modeller är användbara för att studera primära tumör initiering och progression, är det få lätt metastasize till avlägsna organ. Dessutom är dessa genetiska musmodeller ofta mer tids- och kostnadsöverkomliga än spontana eller experimentella metastaseringsmodeller. Med tanke på begränsningen av de flesta genetiskt konstruerade brösttumörmodeller för att studera metastasering har transplantationstekniker blivit attraktiva metoder för att studera denna komplexa process. Detta inkluderar ortopisk, svansven, intrakarkiac och intrakraniell injektion av lämpliga cellinjer.

Även om flera bröstcancer cellinjer lätt metastasize efter orthotopic injektion i bröst fett pad14,15, konsistensen och reproducerbarheten av ögonbevarande tumör börda kan vara en utmaning, och varaktigheten av sådana studier kan vara i storleksordningen flera månader. För utvärdering av lungmetastasering är i synnerhet intravenös injektion i svansvenen ofta en mer reproducerbar och tidseffektiv metod med metastaserad spridning som vanligtvis förekommer inom loppet av några veckor. Eftersom den intravenösa injektionsmodellen kringgår de första stegen i den metastaserade kaskaden måste dock man vara försiktig med att tolka resultaten av dessa studier. I denna demonstration visar vi tail-vein injektion av bröst tumör celler tillsammans med en exakt och omfattande metod för analys.

Även om forskarsamhället har gjort betydande framsteg när det gäller att förstå den komplexa processen med bröstcancermetastasering, uppskattas det att över 150 000 kvinnor för närvarande har metastaserad bröstcancer16. Av dem med stadium IV bröstcancer har >36% av patienterna lungmetastasering17; Det platsspecifika mönstret och incidensen av metastaser kan dock variera beroende på molekylär subtyp18,19,20,21. Patienter med bröstcancerassocierade lungmetastaser har en medianöverlevnad på endast 21 månader vilket belyser behovet av att identifiera effektiva behandlingar och nya biomarkörer för denna sjukdom17. Användningen av experimentella metastasering modeller, inklusive intravenös injektion av tumörceller, kommer att fortsätta att öka vår kunskap om denna viktiga kliniska utmaning. I kombination med digital bildbehandling patologi och metoden för metastaserad lung tumör börda analys beskrivs i detta protokoll, tail-vein injektioner är ett värdefullt verktyg för bröstcancer metastasering forskning.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Djuranvändning följde ULAR-förordningar (University Laboratory Animal Resources) enligt OSU Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) -godkänt protokoll 2007A0120-R4 (PI: Dr. Gina Sizemore).

1. Svansveninjektion av bröstcancerceller

  1. Beredning av celler och spruta för injektion
    1. Plätera ett lämpligt antal celler baserat på antalet möss och cellkoncentrationer som ska användas.
      OBS: Antalet celler som injiceras och tiden till utvecklingen av metastaser beror på vilken cellinje som används och måste optimeras. I denna demonstration injiceras 1 x 106 MDA-MB-231 celler intravenöst i NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ (NSG) möss och makroskopiska lungskador observeras senast 24 dagar efter injektion. För MVT1 murine mammary tumör cellinjen17 injiceras 3 x 106 celler i immun-kompetenta FVB/N möss med många lungmetastaser observerade av 14 dagar22,23.
    2. Aspirera media och skölj cellplattor med 1x PBS. Prova celler i minimal volym, lägg till lämplig volym media och räkna celler med hjälp av en hematocytometer eller en annan föredragen metod. Trypan blå (0,4%) eller andra levande/ döda cellfärger kan användas för att bestämma livskraftiga cellantal.
    3. Pelletceller genom att snurra vid 180 x g i 5 min.
    4. Återanvänd lämpligt antal celler i steril 1x PBS så att en volym på 100 μL injiceras per mus. Håll cellfjädringen på is för att bibehålla livskraften.
    5. Före injektionen ska cellerna återanvändas noggrant med en pipett på 200 μL eller 1 mL för att undvika klump. Dra upp 100 μL i en 28 G insulinspruta (se Materialtabell).
    6. Eliminera eventuella luftbubblor genom att hålla sprutan vertikal, knacka på sprutan och långsamt justera kolven. Injektion av luftbubblor i venen kommer sannolikt att orsaka en luft / gas emboli som kan vara dödlig.
  2. Lateral svansveninjektion
    OBS: För experimentella metastaseringsanalyser för bröstcancer utförs injektioner på > 6 veckor gamla honmöss.
    1. Hantera musen i svansen och skjut in djuret i ett slitsat rör/fasthållningsanordning av lämplig storlek (se tabellen över material för fasthållningsanordning som används).
    2. Sätt i fasthållningsanordningens pluggdel och placera musen på sidan så att dess laterala svansven är lätt att se. Musen har en ventral artär i linje med könsorganen, en ryggven och två laterala kaudala vener.
    3. Rengör ytan på musens svans med en aseptisk våtservett. Ta tag i svansen mellan pekfingret och tummen med icke-dominerande hand och applicera lätt spänning.
    4. Börja vid den distala delen av svansen, sätt in nålen parallellt med venen med avfasningen slutar.
    5. Om det är tillåtet , recap försiktigt nålen och böj till en 20-30° vinkel. En enhands inflygnings- eller nålappningsanordning rekommenderas starkt.
      OBS: Det är inte nödvändigt att aspirera eftersom detta kan orsaka att venen kollapsar. En liten blixt av blod kan dock ses när den först placeras. Nålen kommer att föra smidigt in i venen med korrekt placering.
    6. Dispensera långsamt hela volymen i venen. Det bör inte finnas motstånd när kolven trycks.
    7. Om något motstånd känns, ta omedelbart bort sprutnålen. Om det behövs, sätt in nålen (helst inte mer än 3 försök) som rör sig mot svansens proximala ände eller motsatt lateral ven.
    8. En liten volym blod kommer sannolikt att förskjutas efter injektion. Applicera försiktigt tryck med steril gasväv och torka av med aseptisk torka.
    9. Kassera omedelbart sprutan i lämplig behållare för vassa föremål.
    10. Sätt tillbaka musen i en ren, ventilerad bur och övervaka för tecken på nöd.
    11. Övervaka möss 2-3x/vecka för tecken på metastaseringsbildning (ansträngd andning, böjd hållning, viktminskning) och allmän ångest. Tiden till utveckling av metastasering beror på celllinje och musbelastning.
    12. Vid användning av en in vivo levande avbildningsenhet, avbilda möss omedelbart efter svansveninjektion för att bekräfta framgångsrik injektion av celler och erhålla tid "noll" data (specifika detaljer om in vivo bioluminescensavbildning ingår inte häri, men beskrivs av Yang et al.24).

2. Lungvävnad fixering och analys av metastaserad lungtumör börda

  1. Lungvävnadsinflation för att upprätthålla lungornas strukturella format för histopatologi
    1. Efter godkända dödshjälpsförfaranden (t.ex. koldioxid vid 30- 70% deplacement av kammarens volym/min) följs, säkra muskroppen till en dissekeringsbräda med stift. Spraya eller applicera 70% etanol för att hålla musens päls ur vägen under dissekering.
      OBS: Koldioxid kvävning kan orsaka pulmonell hemorhhage som en förväntad bakgrund lesion, särskilt vid långsammare flödeshastigheter.
    2. Öppna bröstkorgen med ett mittlinjesnitt, förläng snittet kranialt/kaudellt genom bukhinnan och skär bort membranet genom att ta tag i xyfosoidprocessen.
    3. Använd en separat uppsättning saxar för att inte dämpa bladen, skär revbenen längs varje sida av bröstbenet och ta försiktigt bort revbenskorgen och lämna utrymme för lungorna att expandera.
    4. Isolera luftstrupen genom att avlägsna submandibular salivary körtlar och infrahyoid muskulatur. Att placera stift på vardera sidan av luftstrupen kan förhindra oönskad rörelse under nålinsättning.
    5. Fyll en 26 G spruta med 2-3 ml 10% neutralt buffrat formalin och sätt in i luftstrupen.
    6. Injicera långsamt formalin och se upp för lungorna att expandera (kräver vanligtvis ~ 1,5 ml formalin).
    7. När formalin börjar läcka ut ur lungorna (undvik överinflation), nyp av luftstrupen med ett par tångar, ta bort sprutnålen och lossa hela andningsapparaten. Placera lungor, hjärta etc. direkt i formalin eftersom ytterligare trimning av vävnad kan göras efter fixering.
    8. Fullständig bearbetning, inbäddning, sektionering av vävnad och hematoxylin och eosin (H&E) färgning med standardmetoder.
  2. Analys av metastaserad lungtumörbörda
    1. Skanna H&E-färgade lungsektioner på en högupplöst bildskanner vid 40x förstoring (bild 3).
    2. Importera bilder till bildanalysprogramvara (t.ex. Visiopharm Image Analysis) för kvantifiering av lungmetastaser.
      Obs: Vi rekommenderar att nya användare antingen får utbildning på plats eller online för att använda bildanalysprogramvaran. Många webbinarier finns också tillgängliga via den kommersiella webbsidan.
    3. Välj Visiopharm 10118 H&E Lung Metastasis App i programvarans appbibliotek.
      OBS: Syftet med denna app är att märka och kvantifiera lungmetastasering på H&E-färgade diabilder. Som en del av 10118 H&E Lung Metastasis App segmenterar det första bildbehandlingssteget lungvävnaden med vävnadsdetekteringsappen. Det andra bildbehandlingssteget använder Metastasis Detect App som identifierar metastaserna inuti lungvävnaden. Metastaser identifieras via form tillsammans med regioner som antingen är för felsökta, för röda eller för glesa för att identifieras som metastaser.
    4. Justera parametrarna som definierar form och sparseness så att de passar representativa bilder bäst. Segmenterade områden av tumörmetastaser och normal lungvävnad kan visas med olika färgetiketter för varje vävnadstyp.
      OBS: Om appen inte kan separera metastaser korrekt från normal lungvävnad kan en anpassad app som använder Visiopharm Decision Forest-programmet behöva skrivas som den gjordes för experimenten (se figur 2 och figur 3). Information om hur du skriver en anpassad algoritm följer nedan. Fortsätt annars till steg 2.2.9.
    5. Öppna Decision Forest-programmet, som fungerar genom att träna flera klasser [dvs. lungvävnad (icke-neoplastisk), metastaser, röda blodkroppar, epitel och/eller vitt utrymme] på önskad bild. I figur 2 är tumörmetastaser blå, normal vävnad är grön och bronkiolar epitel är gul. Röda blodkroppar är också i rött och luftrum i rosa.
    6. Följ den tillfrågade serien med ja eller nej-frågor för att på lämpligt sätt träna varje klass för en bild. Algoritmens noggrannhet avgör antalet ja/nej-frågor. För analysen skrevs den anpassade algoritmen/appen med noggrannhet inställd på 50 (intervall 0-100).
    7. Justera funktioner för varje klass genom att använda filter för att skärpa, oskärpa, sortera efter form osv. Funktioner ändrar hur klassen ser bilden för att ta fram vissa färger eller intensiteter.
      OBS: För den anpassade algoritmen är metastaser som mäter 8500 μm2 och högre märkta och mäts som metastaser. Detta tar hänsyn till storleksavvikelse och metastaser som är för små för att identifieras. Små missbildade områden och små ögonbevarande områden under 8500 μm2 ingick i den normala vävnad kvantifiering.
    8. Spara de ändrade inställningarna från antingen appen eller den anpassade algoritmen och tillämpa sedan algoritmen/appen på en hel uppsättning eller en serie H&E-färgade vävnader.
    9. Exportera slutligen alla utdatavariabler, som innehåller de som anges i tabell 1. Arealen i mikron i kvadrat (μm2) kan kvantifieras för varje vävnadstyp och procentsatserna härleds från provexemplarets totala nettovävnadsareal (dvs. total vävnad minus luftutrymme).
    10. När du skapar en anpassad algoritm, granska vävnadspålägg i samråd med en veterinärpatolog som certifierats av American College of Veterinary Pathologists för att säkerställa exakta mätningar och skilja mellan vävnadstyper.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Om du använder omärkta celler för injektion med svansven kan det vara svårt att bekräfta lungkolonisering förrän (1) tidpunkten för obduktionen om makrometastaser kan observeras eller (2) efter histologisk analys om mikroskopiska metastaser finns. Med omfattande metastaserad lungtumörbörda kommer möss att ha ansträngd andning. Som med alla tumörstudier bör möss övervakas noggrant under hela studiens varaktighet. Användningen av märkta celler är ett enkelt sätt att bekräfta framgångsrik svansveninjektion; därav användningen av luciferasmärkta MDA-MB-231-celler i demonstrationen. In vivo-avbildning är dock inte alltid möjligt eller nödvändigt beroende på experimentell design och andra faktorer. Figur 1A visar bioluminescenssignal i bröstutrymmet mindre än 2 timmar efter svansveninjektion av luciferasmärkta MDA-MB-231-celler som bekräftelse på korrekt injektion. För detta experiment ökar antalet fotoner i bröstregionen med tiden och en stark bioluminescenssignal finns vid dag 24 efter injektionen (figur 1B och C; notera förändringen i skalstången). Vid tidpunkten för obduktionen observerades många makroskopiska lungskador hos dessa möss (figur 1D).

Efter korrekt vävnadsbehandling och färgning kan H&E-färgade lungsektioner skannas eller avbildas. Metastaserad lungtumörbelastning kvantifiering kan effektivt uppnås med hjälp av bildanalys programvara och en anpassad algoritm. Med hjälp av den anpassade algoritmen segmenteras hela lungvävnaden av olika vävnadsfunktioner (figur 2A och B). Genom att segmentera lungvävnaden på detta sätt kan programvaran kvantifiera de olika parametrar som anges i tabell 1. Denna analys har utförts på lungvävnad från möss injicerade med MDA-MB-231 celler följt av behandling med ett läkemedel som är utformat för att blockera metastaserad kolonisering eller en fordonskontroll (DMSO). Rådata från denna analys visas i tabell 2. Dessutom visar figur 3A representativa H&E-bilder av MDA-MB-231 lungmetastaser från antingen DMSO eller läkemedelsbehandlade möss. Medan en skillnad i metastaserad tumörbörda mellan dessa behandlingsgrupper lätt kan ha förbisetts eftersom det totala antalet lungnudlar inte är annorlunda, indikerar en omfattande analys av alla parametrar en signifikant skillnad i procent netto lungmetastaseringsområdet (figur 3B, C). Detta understryker behovet av ett omfattande och grundligt tillvägagångssätt för att analysera metastaserad lungtumör börda såsom den metod som beskrivs häri.

För de data som presenteras i figur 3 utfördes alla statistiska analyser med GraphPad Prism 7. Data ansågs normalt distribueras vid godkänt något av följande standard normalitetstester: D'Agostino-Pearson omnibus, Shapiro-Wilk och Kolmogorov-Smirnov. Jämförelsen mellan fordonet och drogbehandlade grupper (figur 3) gjordes genom oparade tvåsidiga Students t-test. Statistisk signifikans fastställdes till P ≤ 0,05.

Figure 1
Figur 1: In vivo bioluminescens bekräftelse av framgångsrik svansvenin injektion.
(A) Representativ bioluminescenssignal hos möss 1 timme efter svansveninjektion av luciferasmärkta MDA-MB-231-celler. B) Representativ bioluminescenssignal i samma uppsättning möss som (A) 24 dagar efter svansveninjektion av luciferasmärkta MDA-MB-231-celler. [Observera förändringen i skalstrecket mellan (A) och (B)]. (C) Kvantifiering av fotonantal över tid hos MDA-MB-231 svansvein injicerade möss. Felstaplar representerar medelvärdet ± SEM. (n = 8 möss) (D) Representativ icke-tumörbärande lungvävnad (höger) och MDA-MB-231 makrometaser i lungorna (vänster) vid tidpunkten för obduktionen. Skalningsstaplar = 50 mm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 2
Bild 2: Vävnadssegmentering med Visiopharm-programvara.
(A) Representativa snips av osegmenterade och segmenterade vävnadspålägg med hjälp av den anpassade programvarualgoritmen. (B) Förklaring för alla vävnadskategorier segmenterade med hjälp av programvara. Klicka här för att se en större version av den här figuren.

Figure 3
Figur 3: Representativ metastaserad lungtumör börda analys av H&E-färgade vävnader.
(A) Representativ H&E-färgning av lungvävnad från oinsprutade möss och kontroll (DMSO) och läkemedelsbehandlade möss efter svansveninjektion av MDA-MB-231-celler. Representativa tumör metastaser indikeras med pilar. Skalstänger = 500 μm för 4x förstoring och 200 μm för 10x förstoring. (B) Graf över procent netto lungmetastaseringsområde för kontroll och läkemedelsbehandlade möss. Felstaplar representerar medelvärdet ± SD. (*) P = 0,022 enligt Studentens t-test. (C) Tabell som sammanfattar analysen av metastaserad lungtumörbörda (n = 9 DMSO; n = 9 läkemedelsbehandlade). Efter att ha kontrollerat normal distribution av data bestämdes alla P-värden i tabellen av oparade, dubbelsidiga Students t-test. Klicka här för att se en större version av den här figuren.

Parameter Beskrivning
Total vävnadsareal (μm2) Område i kvadratmikroner inklusive alla tumörmetastaser, normal lunga och områden av röda blodkroppar.
Antal metastasering Totalt antal metastaser i lungvävnaden.
Procentsats för metastaseringsområde (μm2) Totalt metastaseringsområde dividerat med nettovävnadsområde x 100.
Total vävnad + vitrymdsområde (μm2) Område i kvadratiska mikron inklusive all vävnad och vitt utrymme.
Nettovävnadsområde (μm2) Vävnadsområde i kvadratiska mikron (mets och normal lunga) utan vitt utrymme och röda blodkroppar.
Totalt metastaseringsområde (μm2) Total metastaseringsareal i kvadratmikruter som segmenteras av Beslutsskogen algorithim.
Genomsnittlig metastaseringsområde (μm2) Genomsnittlig (genomsnittlig) yta i kvadratiska mikron av metastaser i varje bild.
Median metastaseringsområde (μm2) Median metastasering område i kvadratiska mikron. Lika många metastaser faller under detta värde och lika många metastaser är större än medianvärdet.

Tabell 1: Parametrar som mäts med programvara. Lista över parametrar tillsammans med en beskrivning av varje mätning som beräknas med hjälp av den anpassade algoritmen.

Rutschbana Antal metastasering Procentsats för metastaseringsområde (μm2) Total vävnad + vitrymdsområde (μm2) Totalt tomt utrymme (μm2) Nettovävnadsområde (μm2) Totalt metastaseringsområde (μm2) Röda blodkroppar område (μm2) Genomsnittlig metastaseringsområde (μm2) Median metastaseringsområde (μm2)
171 Lung slide 1 435 8.90 185698000 83201800 92031400 8189250 10464800 18825.86 14748.73
171 Lungrutschbana 2 323 8.37 185698000 83201800 92054740 7708990 10441460 23866.84 14748.73
172 Lung slide 1 151 2.73 181546000 89509904 81571296 2225220 10464800 14736.56 12486.37
172 Lungrutschbana 2 142 2.60 170708000 81735504 80558196 2093040 8414300 14739.72 12119.62
173 Lung slide 1 634 11.60 234104992 102153000 115606692 13406800 16345300 21146.37 15472.22
173 Lungrutschbana 2 667 12.70 223180992 86778600 122374592 15542700 14027800 23302.40 16531.00
174 Lung slide 1 40 0.55 192452992 80340896 87591096 485121 24521000 12128.03 10484.05
174 Lung slide 2 34 0.51 183918000 71287904 91242796 464830 21387300 13671.47 11181.81
175 Lung slide 1 780 23.93 179544992 44799200 126995782 30388600 7750010 38959.74 19307.76
175 Lung slide 2 1001 12.58 169191536 43425608 120610754 15169100 5155174 15153.95 19703.08
188 Lung slide 1 569 13.20 162290000 54210000 98486310 12997300 9593690 22842.36 14463.91
188 Lung slide 2 271 5.15 157146000 54250800 91996500 4738100 10898700 17483.76 12657.83
189 Lung slide 1 74 1.70 185292992 95700800 77779392 1318820 11812800 17821.89 14551.08
189 Lung slide 2 74 1.76 182272992 95700800 74759392 1318820 11812800 17821.89 14551.08
816 Lung slide 1 246 5.65 185876000 87568896 81916204 4631050 16390900 18825.41 14371.99
816 Lung slide 2 565 6.05 183220000 76954304 90305396 5462670 15960300 9668.44 14244.82
876 Lungrutschbana 1 468 10.36 208308000 99300096 100947064 10454500 8060840 22338.68 16011.37
876 Lung slide 2 528 11.74 199750896 81642568 110450391 12963400 7657937 24551.89 16699.13
877 Lung slide 1 732 17.98 219340992 99918600 107869992 19397100 11552400 26498.77 18137.52
877 Lung slide 2 605 14.64 207925504 88539712 108168329 15839700 11217463 26181.32 18014.64
878 Lung slide 1 377 10.05 178534000 85610896 81931104 8232340 10992000 21836.45 16671.03
878 Lung slide 2 376 9.88 170544000 75337904 86108406 8511710 9097690 22637.53 16754.38
879 Lung slide 1 205 5.22 167556000 89999000 68123630 3553860 9433370 17335.90 13845.69
879 Lung slide 2 213 4.64 167931008 80789400 78489588 3638720 8652020 17083.19 14058.12
881 Lung slide 1 1122 38.81 218880000 79713504 130893816 50802300 8272680 45278.34 22044.99
881 Lung slide 2 628 21.67 184200992 74502600 99122692 21475200 10575700 34196.18 19857.40
882 Lungrutschbana 1 678 24.05 194476992 83941904 98484788 23684500 12050300 34932.89 20748.06
882 Lung slide 2 645 21.93 185537040 75790040 101412430 22241700 8334570 34483.26 20325.11
883 Lung slide 1 429 10.79 179400992 84955696 84699866 9138800 9745430 21302.56 15080.23
883 Lung slide 2 342 85.30 175220992 76210896 90472386 77170200 8537710 225643.86 17078.26
884 Lung slide 1 359 6.42 206751008 87752600 103825008 6669710 15173400 18578.58 14333.41
884 Lung slide 2 480 9.12 200990000 77052496 111060804 10125700 12876700 21095.21 15679.88
885 Lung slide 1 332 7.79 191398000 92896304 84752596 6605490 13749100 19896.05 14500.11
885 Lung Slide 2 537 81.02 187475008 85938000 89378408 72411104 12158600 134843.77 15360.29
886 Lung slide 1 305 7.93 158435008 80433296 76541662 6068720 1460050 19897.44 14500.11
886 Lung slide 2 898 8.84 155460000 70808600 83457470 7380490 1193930 8218.81 14744.92

Tabell 2: Representativ resultattabell. Resultattabell för varje parameter i algoritmen från en kohort av möss svans-ven injiceras med MDA-MB-231 celler.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Eftersom forskare fortsätter att använda intravenös injektion av tumörceller som en experimentell modell för metastasering saknas standardpraxis för att analysera den resulterande metastaserande tumörbördan. I vissa fall kan betydande skillnader i metastaserande tumör börda vid manipulering av vissa cellinjer och/eller användning av kemiska föreningar observeras makroskopiskt. I andra fall kan dock subtila skillnader i metastaserad sådd och tillväxt förbises eller misstolkas utan grundlig patologisk analys. Denna studie avancerar tidigare publicerade tail-vein injektion protokoll genom att inkludera en omfattande metod för metastaserad lung tumör börda analys. Viktigt är att denna metod för digital patologi analys också kan tillämpas på kvantifiering av lung metastaserad tumör börda efter orthotopic injektion av tumör celler som kan spontan metastasering samt andra experimentella metastasering modeller (dvs intracardiac, etc.) och patient-härledda xenograft (PDX) modeller. Användningen av digital bildbehandling och mjukvarualgoritm utveckling av veterinära patologer säkerställer reproducerbarhet, noggrannhet och noggrannhet av detta tillvägagångssätt för att analysera metastaserad lung tumör börda25.

Genomtänkt beslut av cellinjer, cellkoncentration och slutpunkter baserade på antingen tidigare publicerade studier eller noggrann experimentell optimering är absolut nödvändigt. Med tanke på att metastaserad sådd och kolonisering är mycket beroende av interaktioner med olika immuncellpopulationer26,27, är användningen av immunkompetenta möss idealisk, om än inte alltid genomförbar. Av samma anledning bör tolkningen av experimentella metastaseringsstudier med athymiska möss eller NSG-möss, som saknar viktiga immuncellkomponenter, göras med försiktighet. Det finns flera musdrytumör cellinjer, inklusive MVT1 celler som används i denna studie, som har härletts från FVB/N mus stam22,28,29. Andra syngeneska modeller finns också. När det gäller cellkoncentration kan injektion av ett stort antal celler kraftigt påskynda och förbättra metastaserad lungtumörbörda. Men om lungorna är överväldigade kan det vara svårt att skilja enskilda metastaserade foci och emboli är mer benägna att uppstå. Dessutom kräver injektionsproceduren för svansvener gott om övning och träning innan du säkert och/eller rutinmässigt utför injektioner. Många institutioner kommer att erbjuda teknisk utbildning och kan tillhandahålla möss för övningsändamål. Korrekt placering av nålen och en smidig injektion bör indikera framgång; För tränings-/övningsändamål kan dock Evans Blue-färgämne användas för att bestämma framgångsrik injektion (1% i steril PBS). Musens extremiteter blir blå kort efter injektionen, men djuret bör avlivas efteråt.

Dessutom kan vikten av standard obducens- och vävnadsprovtagningstekniker för att kontrollera och förhindra glidartefakter som kan försämra bildskanning och analys av bildanalysprogramvaran inte betonas tillräckligt. Inflation av lungorna vid tidpunkten för obduktionen är ett kritiskt steg för att upprätthålla vävnadens integritet och förbättrar efterföljande H&E-färgning samt slutlig analys. För att överensstämmelse med upplösning och reproducerbarhet rekommenderas att alla bilder i en studieuppsättning skannas med samma mål. I denna studie skannades alla bilder vid 40x för att säkerställa noggrannhet av algoritminställningar och korrekt identifiering av tumör metastaser när de tillämpas på analyserade fält. För varje bild skannades och analyserades samma lunglober konsekvent för varje mus. Det rekommenderas också starkt att en patolog granskar vävnadsmarkeringar för noggrannhet i den tillämpade algoritmen och att samma algoritm tillämpas på varje bild i en studie.

Det presenterade protokollet kan ändras enligt experimentell design, användarpreferenser och önskade utfallsmätningar. En sådan modifiering inkluderar användningen av en anestesiinduktionskammare snarare än konventionell fasthållningsanordning för ett medvetet djur. När det gäller djurhälsa och välbefinnande är inget av tillvägagångssätten överlägset det andra och var och en har sin egen uppsättning fördelar såväl som begränsningar30. För svarta eller bruna möss kan en ljuskälla eller värmeanordning också behövas för att visualisera svansvenerna. Infraröda lampor eller ett varmt vattenbad kan användas för att vidga venerna. Temperaturen bör dock övervakas noggrant. Dessutom finns det upplysta fasthållningsanordningar tillgängliga samt andra kommersiella versioner av fasthållningsanordningar för gnagare. Vissa utredare föredrar Luer-Lok sprutor för injektioner. Vi har svårare att eliminera luftbubblor med Luer-Lok-sprutor, men det är en fråga om preferens. Cellernas livskraft är en viktig faktor för injektionsförfarandet för svansven, och därför är exakta cellantal samt upprätthållande av celler på is före injektion nödvändiga steg. Om man jämför lungsådd och kolonisering av manipulerade cellinjer är det viktigt att bestämma eventuella skillnader i cellstorlek och livskraft före injektion eftersom dessa kan komplicera tolkningen av resultaten. Celldöd och/eller skada kan uppstå vid användning av en smalspårig nål. Det rekommenderas dock inte att en nål större än 25 G används eftersom det kan orsaka smärta och obehag för djuret.

Som ett sätt att validera att lungskador bildas av injicerade tumörceller kan immunstaining göras på vävnadssektioner. Om man använder mänskliga cellinjer kan människospecifika antikroppar användas för att urskilja ögonbevarande lesioner. Alternativt, om du använder märkta cellinjer (t.ex. GFP), kan motsvarande antikroppar användas. Många bröstcancer cellinjer är också positiva för epitel markörer (dvs. cytokeratiner, E-cadherin, och EpCAM), men förkunskaper om uttryck är viktigt. Lungepitetelfodret luftvägarna kommer dock också att vara positiva för dessa markörer och därför måste strukturen också beaktas. det kan finnas fall där primära lung tumör utveckling måste uteslutas. För att göra det, immunohistochemical färgning för sköldkörteln transkription faktor-1 (TTF1) kan användas som en markör för primära lungadenocarcinom. TTF1 färgning bör utvärderas av en certifierad patolog.

Häri skrevs en anpassad algoritm med hjälp av en Decision Forest-klassificeringsalgoritm eftersom den etablerade lungmetastaseringsalgoritmen inte kunde finjusteras för korrekt detektering av metastaser som varierade i storlek. Denna anpassade algoritm möjliggör komplexa mätningar, möjliggör korrekt segmentering av metastaser efter storlek och stöder en storleksavbrott så att små feltolkade områden och normala strukturer inte misstolkas och därför kan inkluderas i den slutliga data uppsättningen. Vi förväntar oss att denna algoritm kommer att vara tillämplig på de flesta in vivo lung metastasering studier, men användare kan behöva justera inställningar i programvaran för att passa sina individuella studiebehov. Denna algoritm fungerar dock som en plattform för utredare som vill analysera lungmetastatisk börda på ett liknande sätt. Det finns många olika alternativ för bildanalysplattformar där åtkomst eller tillgänglighet, kostnad och utbildning samt erfarenhetsnivå kan diktera den bästa plattformen för att använda36. Utbudet av alternativ inkluderar gratis plattformar som QuPath och dyrare, men sofistikerade plattformar, till exempel Visiopharm. Det rekommenderas att man rådgör med en bildanalys patologi kärna och patolog när man bestämmer vilken plattform som kan vara tillgänglig och bäst utnyttjas för ett visst forskningsprojekt.

Spontana mus mammary tumör modeller (t.ex. MMTV-PyMT) eller orthotopic bröst fett pad injektionsmetoder representerar den mest fysiologiskt relevanta modellen för att studera lung metastasering. En allvarlig nackdel med svans-ven injektion modell är att det inte rekapitulerar den fulla ögonbevarande kaskaden och är därför begränsad till studier av tumör cell extravasation och sekundära organ kolonisering. Denna experimentella metastaseringsmodell är dock relevant för bröstcancerforskning eftersom lungmetastaser som bildas efter svansveninjektion har genomiska profiler som liknar metastaserade lesioner som utvecklas efter ortopisk implantation av samma celler31. För att upprätta en lungmetastaseringsmodell injiceras ofta ett stort antal celler intravenöst vilket kanske inte exakt representerar metastaseringsprocessen när det gäller sådd, immunreaktion och viloplats. Baserat på cirkulationsvägen är lungmetastaser vanligast med svansveninjektion32. Med de flesta bröstcancer cellinjer, publicerade rapporter indikerar en relativt låg incidens av ben, lever, eller hjärnan metastaser efter tail-vein injektion7. Alternativa experimentella metastaseringsmetoder såsom intrakarkiac, intratibial, portalven och intrakarotidinjektioner är lämpligare för att undersöka metastaser till andra platser33,34,35,36,37. Återigen, spontana bröst tumör modeller eller orthotopic fett pad injektionsmetoder som rekapitulerar alla steg i den ögonbevarande kaskad föredras. Problem med konsekvent metastaserad tumörbörda, studietiden och antalet djur som krävs för sådana studier är en nackdel. Metoden för digital patologi analys presenteras här i kan dock tillämpas på lung metastaser bildas genom någon spontan eller experimentell metastasering modell.

Analysmetoden ger också vissa begränsningar som subjektivitet i algoritmskapande. Även om hela bildframställning möjliggör digital analys på en hel vävnadssektion och på alla lunglober i en enda mus, är den begränsad till en tvådimensionell analys av en 3D-vävnad. Stereologi håller på att bli en vanlig praxis som erhåller 3D-information för bildanalys och kan ta hänsyn till faktorer som vävnadskrympning som uppstår under vävnadsbehandling38. Stereologi har dock sina egna begränsningar som vävnad, resurs och tidsbegränsningar.

Med tanke på antalet cancerpatienter som drabbas av metastaserad spridning av sin sjukdom kommer metoden för injektion av svansven för att studera metastasering att fortsätta att vara ett användbart verktyg när det gäller att förstå den komplicerade biologin för metastaserad spridning och för att bestämma den prekliniska effekten av nya terapier. In vivo-musmodeller av metastasering, särskilt de som använder immunkompetenta djur, blir ännu viktigare för cancerforskning med tanke på det utbredda intresset för immunterapi29. Experimentella metastaseringsmodeller är också kritiska när det gäller att undersöka metastaseringshämmande gener (dvs. de som undertrycker cancercellernas metastaserande potential utan att påverka primär tumörtillväxt), och därför fortsätter att vara ett värdefullt forskningsverktyg.

Digital avbildning och bildanalys har snabbt blivit en stöttepelare inom diagnostisk och experimentell musmodellering39. Att använda den typ av metod som beskrivs häri för att analysera lungmetasta tumör börda kommer att möjliggöra hög genomströmning analyser på ett mer omfattande och korrekt sätt. Dessutom ger digital bildpatologi en väg för mer samverkande forskningsprojekt som involverar patologer som specialiserar sig på områden som musmodeller av bröstcancermetastaser. Eftersom multiplex vävnad imaging metoder och 3D imaging teknik (som nämnts ovan) fortsätter att utvecklas, digital bild patologi, sofistikerad programvara för bildanalys, och expertis av patologer kommer säkert att vara nödvändigt för att främja metastasering forskning.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna har inget att avslöja.

Acknowledgments

Representativa data finansierades genom National Cancer Institute (K22CA218549 till S.T.S). Förutom deras hjälp med att utveckla den omfattande analysmetoden som rapporteras häri tackar vi Ohio State University Comprehensive Cancer Center Comparative Pathology and Mouse Phenotyping Shared Resource (Director – Krista La Perle, DVM, PhD) för histologi och immunohistokemitjänster och Pathology Imaging Core för algoritmutveckling och analys.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
alcohol prep pads Fisher Scientific 22-363-750 for cleaning tail prior to injection
dissection scissors Fisher Scientific 08-951-5 for mouse dissection and lung tissue inflation
DMEM with L-Glutamine, 4.5g/L Glucose and Sodium Pyruvate Fisher Scientific MT10013CV cell culture media base for MDA-MB-231 and MVT1 cell lines
Dulbecco's Phosphate-Buffered Salt Solution 1x Fisher Scientific MT21030CV used for resuspending tumor cells for injection
ethanol (70 % solution) OSU used to minimize mouse's fur during dissection; use caution - flammable
Evan's blue dye Millipore Sigma E2129 used at 1 % in sterile PBS for practice with tail-vein injection method; use caution - dangerous reagent
Fetal Bovine Serum Millipore Sigma F4135 cell culture media additive; used at 10% in DMEM
forceps Fisher Scientific 10-270 for dissection and lung tissue inflation
FVB/NJ mice The Jackson Laboratory 001800 syngeneic mouse strain for MVT1 cells
hemacytometer (Bright-Line) Millipore Sigma Z359629 for use in cell culture to obtain cell counts
insulin syringe (28 G) Fisher Scientific 14-829-1B for tail-vein injections (BD 329424)
MDA-MB-231 cells ATCC human breast cancer cell line
MVT1 cells mouse mammary tumor cells
needles (26 G) Fisher Scientific 14-826-15 used to inflate the mouse's lungs
neutral buffered formalin (10%) Fisher Scientific 245685 used as a tissue fixative and to inflate lung tissue; use caution - dangerous reagent
NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ (NSG) mice The Jackson Laboratory 005557 maintained by OSUCCC Target Validation Shared Resource
Penicillin Streptomycin 100x ThermoFisher 15140163 cell culture media additive
sterile gauze Fisher Scientific NC9379092 for applying pressue to mouse's tail if bleeding occurs
syringe (5 mL) Fisher Scientific 14-955-458 used to inflate mouse lung tissue
tail-vein restrainer Braintree Scientific, Inc. TV-150 STD used to restrain mouse for tail-vein injections
Trypan blue (0.4 %) ThermoFisher 15250061 used in cell culture to assess viability
Trypsin-EDTA 0.25 % ThermoFisher 25200-114 used in cell culture to detach tumor cells from plate

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Chambers, A. F., Groom, A. C., MacDonald, I. C. Dissemination and growth of cancer cells in metastatic sites. Nature Reviews: Cancer. 2 (8), 563-572 (2002).
  2. Steeg, P. S. Targeting metastasis. Nature Reviews: Cancer. 16 (4), 201-218 (2016).
  3. Gupta, G. P., Massague, J. Cancer metastasis: building a framework. Cell. 127 (4), 679-695 (2006).
  4. Steeg, P. S. Tumor metastasis: mechanistic insights and clinical challenges. Nature Medicine. 12 (8), 895-904 (2006).
  5. Chaffer, C. L., Weinberg, R. A. A perspective on cancer cell metastasis. Science. 331 (6024), 1559-1564 (2011).
  6. Eckhardt, B. L., Francis, P. A., Parker, B. S., Anderson, R. L. Strategies for the discovery and development of therapies for metastatic breast cancer. Nature Reviews Drug Discovery. 11 (6), 479-497 (2012).
  7. Gomez-Cuadrado, L., Tracey, N., Ma, R., Qian, B., Brunton, V. G. Mouse models of metastasis: progress and prospects. Disease Models & Mechanisms. 10 (9), 1061-1074 (2017).
  8. Fantozzi, A., Christofori, G. Mouse models of breast cancer metastasis. Breast Cancer Research. 8 (4), 212 (2006).
  9. Schoenenberger, C. A., et al. Targeted c-myc gene expression in mammary glands of transgenic mice induces mammary tumours with constitutive milk protein gene transcription. EMBO Journal. 7 (1), 169-175 (1988).
  10. Nusse, R., Varmus, H. E. Many tumors induced by the mouse mammary tumor virus contain a provirus integrated in the same region of the host genome. Cell. 31 (1), 99-109 (1982).
  11. Muller, W. J., Sinn, E., Pattengale, P. K., Wallace, R., Leder, P. Single-step induction of mammary adenocarcinoma in transgenic mice bearing the activated c-neu oncogene. Cell. 54 (1), 105-115 (1988).
  12. Lin, E. Y., et al. Progression to malignancy in the polyoma middle T oncoprotein mouse breast cancer model provides a reliable model for human diseases. American Journal of Pathology. 163 (5), 2113-2126 (2003).
  13. Green, J. E., et al. The C3(1)/SV40 T-antigen transgenic mouse model of mammary cancer: ductal epithelial cell targeting with multistage progression to carcinoma. Oncogene. 19 (1), 1020-1027 (2000).
  14. Iorns, E., et al. A new mouse model for the study of human breast cancer metastasis. PloS One. 7 (10), 47995 (2012).
  15. Kim, I. S., Baek, S. H. Mouse models for breast cancer metastasis. Biochemical and Biophysical Research Communications. 394 (3), 443-447 (2010).
  16. Mariotto, A. B., Etzioni, R., Hurlbert, M., Penberthy, L., Mayer, M. Estimation of the Number of Women Living with Metastatic Breast Cancer in the United States. Cancer Epidemiology, Biomarkers and Prevention. 26 (6), 809-815 (2017).
  17. Xiao, W., et al. Risk factors and survival outcomes in patients with breast cancer and lung metastasis: a population-based study. Cancer Medicine. 7 (3), 922-930 (2018).
  18. Smid, M., et al. Subtypes of breast cancer show preferential site of relapse. Cancer Research. 68 (9), 3108-3114 (2008).
  19. Kennecke, H., et al. Metastatic behavior of breast cancer subtypes. Journal of Clinical Oncology. 28 (20), 3271-3277 (2010).
  20. Soni, A., et al. Breast cancer subtypes predispose the site of distant metastases. American Journal of Clinical Pathology. 143 (4), 471-478 (2015).
  21. Leone, B. A., et al. Prognostic impact of metastatic pattern in stage IV breast cancer at initial diagnosis. Breast Cancer Research and Treatment. 161 (3), 537-548 (2017).
  22. Pei, X. F., et al. Explant-cell culture of primary mammary tumors from MMTV-c-Myc transgenic mice. In Vitro Cellular and Developmental Biology: Animal. 40 (1-2), 14-21 (2004).
  23. Mathsyaraja, H., et al. CSF1-ETS2-induced microRNA in myeloid cells promote metastatic tumor growth. Oncogene. 34 (28), 3651-3661 (2015).
  24. Yang, S., Zhang, J. J., Huang, X. Y. Mouse models for tumor metastasis. Methods in Molecular Biology. 928, 221-228 (2012).
  25. La Perle, K. M. D. Comparative Pathologists: Ultimate Control Freaks Seeking Validation. Veterinary Pathology. 56 (1), 19-23 (2019).
  26. Blomberg, O. S., Spagnuolo, L., de Visser, K. E. Immune regulation of metastasis: mechanistic insights and therapeutic opportunities. Disease Models & Mechanisms. 11 (10), (2018).
  27. Gonzalez, H., Hagerling, C., Werb, Z. Roles of the immune system in cancer: from tumor initiation to metastatic progression. Genes and Development. 32 (19-20), 1267-1284 (2018).
  28. Borowsky, A. D., et al. Syngeneic mouse mammary carcinoma cell lines: two closely related cell lines with divergent metastatic behavior. Clinical and Experimental Metastasis. 22 (1), 47-59 (2005).
  29. Yang, Y., et al. Immunocompetent mouse allograft models for development of therapies to target breast cancer metastasis. Oncotarget. 8 (19), 30621-30643 (2017).
  30. Resch, M., Neels, T., Tichy, A., Palme, R., Rulicke, T. Impact assessment of tail-vein injection in mice using a modified anaesthesia induction chamber versus a common restrainer without anaesthesia. Laboratory Animals. 53 (2), 190-201 (2019).
  31. Rashid, O. M., et al. Is tail vein injection a relevant breast cancer lung metastasis model. Journal of Thoracic Disease. 5 (4), 385-392 (2013).
  32. Goodale, D., Phay, C., Postenka, C. O., Keeney, M., Allan, A. L. Characterization of tumor cell dissemination patterns in preclinical models of cancer metastasis using flow cytometry and laser scanning cytometry. Cytometry Part A. 75 (4), 344-355 (2009).
  33. Goddard, E. T., Fischer, J., Schedin, P. A Portal Vein Injection Model to Study Liver Metastasis of Breast Cancer. Journal of Visualized Experiments. (118), (2016).
  34. Wright, L. E., et al. Murine models of breast cancer bone metastasis. BoneKEy Reports. 5, 804 (2016).
  35. Simmons, J. K., et al. Animal Models of Bone Metastasis. Veterinary Pathology. 52 (5), 827-841 (2015).
  36. Liu, Z., et al. Improving orthotopic mouse models of patient-derived breast cancer brain metastases by a modified intracarotid injection method. Scientific Reports. 9 (1), 622 (2019).
  37. Kodack, D. P., Askoxylakis, V., Ferraro, G. B., Fukumura, D., Jain, R. K. Emerging strategies for treating brain metastases from breast cancer. Cancer Cell. 27 (2), 163-175 (2015).
  38. Brown, D. L. Practical Stereology Applications for the Pathologist. Veterinary Pathology. 54 (3), 358-368 (2017).
  39. Aeffner, F., et al. Digital Microscopy, Image Analysis, and Virtual Slide Repository. Institute for Laboratory Animal Research Journal. 59 (1), 66-79 (2018).

Tags

Cancerforskning nummer 159 svansveninjektion bröstcancer lungmetastasering H&E-färgade sektioner kvantitativ digital patologi bildanalys

Erratum

Formal Correction: Erratum: Pathological Analysis of Lung Metastasis Following Lateral Tail-Vein Injection of Tumor Cells
Posted by JoVE Editors on 12/02/2020. Citeable Link.

An erratum was issued for: Pathological Analysis of Lung Metastasis Following Lateral Tail-Vein Injection of Tumor Cells. The author list was updated.

The author list was updated from:

Katie A. Thies1, Sue E. Knoblaugh2, and Steven T. Sizemore1
1Department of Radiation Oncology, Arthur G. James Comprehensive Cancer Center and Richard L. Solove Research Institute, The Ohio State University Medical Center
2Department of Veterinary Biosciences, Comparative Pathology and Digital Imaging Shared Resource, The Ohio State University

to:

Katie A. Thies1, Sarah Steck1, Sue E. Knoblaugh2, and Steven T. Sizemore1
1Department of Radiation Oncology, Arthur G. James Comprehensive Cancer Center and Richard L. Solove Research Institute, The Ohio State University Medical Center
2Department of Veterinary Biosciences, Comparative Pathology and Digital Imaging Shared Resource, The Ohio State University

Patologisk analys av lungmetastasering efter lateral svansveninjektion av tumörceller
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Thies, K. A., Steck, S., Knoblaugh,… More

Thies, K. A., Steck, S., Knoblaugh, S. E., Sizemore, S. T. Pathological Analysis of Lung Metastasis Following Lateral Tail-Vein Injection of Tumor Cells. J. Vis. Exp. (159), e61270, doi:10.3791/61270 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter