Summary
Kombine ozon ve bakteriyel endotoksin maruz fareler nötrofiller de dahil olmak üzere geniş yayılmış hücre ölümü gösterir. Sitoskeletal lamellipodia'nın bozulması, karmaşık V ATP sintaz alt β birliğinin hücresel ekspresyonunun artması ve bronko-alveoler lavajda anjiyostatin, akciğer immün yanıtının baskılanması ve nötrofil alımının gecikmesi gibi hücresel adaptasyonları gözlemledik.
Abstract
Akciğerler sürekli olarak steril (parçacıklar veya reaktif toksinler) ve enfeksiyöz (bakteriyel, viral veya mantar) enflamatuar durumlar şeklinde doğrudan ve dolaylı hakaretlerle karşı karşıya kalır. Ezici bir konak yanıtı, pato-mantıksal konak immün, pıhtılaştırıcı ve doku remodeling yanıtının bir sonucu olarak akciğer nötrofil alımı ile karakterize olan solunum ve akut akciğer yaralanması ile sonuçlanabilir. Bir TLR4 agonisti olan bakteriyel lipopolisakkarit ile birlikte güçlü bir çevresel kirletici olan düşük doz (0,05 ppm) ozona yanıt olarak, murine akciğer hücresel adaptasyonlarını görselleştirmek ve ölçmek için hassas mikroskobik yöntemler, konakçı enflamatuar ve onarım mekanizmalarını anlamak için çok önemlidir. Çeşitli akciğer ve sistemik vücut bölmelerinin, yani bronko-alveolar lavaj sıvısının, akciğer vasküler perfüzyonunun, sol akciğer kriyoseksiyonlarının ve sternal kemik iliğinin perfüzyonunun kapsamlı bir floresan mikroskobik analizini açıklıyoruz. Analiz edilen bölmelerde ayrık kemokin gradyanları ile işaretlenen gecikmiş (36-72 saate kadar) immün yanıt ile korelasyonda alveoler makrofajlar, nötrofiller, akciğer parenkimal dokusunun yanı sıra kemik iliği hücrelerinin hasarını gösteriyoruz. Ek olarak, akciğer hücre dışı matris ve hücresel sitoskeletal etkileşimler (aktin, tubulin), mitokondriyal ve reaktif oksijen türleri, pıhtı önleyici plazminojen, anti-anjiyojenik peptit parçası anjiyostatin, mitokondriyal ATP sintaz kompleks V alt ünlemleri, α ve β sunuyoruz. Bu taşıyıcı belirteçler, yeterli in vitro hücre bazlı tahliller ve intravital mikroskopi gibi in vivo hayvan görüntüleme teknikleri ile desteklendiğinde, yeni immünomodülatör ajanlara akciğer yanıtını anlamaya yönelik hayati bilgiler sağlayabilir.
Introduction
Akut akciğer hasarı (ALI), pıhtılaştırıcı, fibrinolitik ve doğuştan gelen bağışıklık sistemlerinin eşzamanlı aktivasyonu ile işaretlenen akciğerlerin enfeksiyöz veya diğer zararlı uyaranlara verdiği önemli bir patolojik yanıttır1. Nötrofiller, Toll benzeri reseptör (TLR) ailesi2,3,4aracılığıyla mikrobiyal ve hücre içi hasar kalıplarını derhal algılar. Nötrofiller önceden biçimlendirilmiş sitokinleri ve sitotoksik granül içeriğini serbest bırakır ve bu da daha sonra kollateral doku hasarına neden olabilir. Ortaya çıkan alveolar hasar, adenozin trifosfat (ATP)5gibi moleküllerin salınmasıyla yol açan ikincil hücre ölümü ile gölgelenir, böylece bağışıklık düzensizliğinin kısır bir döngüsüne girer.
ALI'nin anlaşılmasında çözülmemiş bir sorun, yaralanmanın alveolar membran içinde nasıl başlatıldığı sorusuyla ilgilidir. Elektron taşıma kompleksi V, F1F0 ATP synthase, iltihaplanma sırasında hücre (endotel, lökosit, epitel dahil) plazma zarı üzerinde her yerde ifade edildiği bilinen bir mitokondriyal proteindir. Aktin ve tübulin içeren hücre sitoskeleton, sırasıyla mitokondriyal proteinlerin yanı sıra birçok hücre şekli ve fonksiyon modülasyonunu barındırır. Son zamanlarda atp sintaz endojen molekül tarafından abluka göstermiştir, anjiyostatin, nötrofil işe alımını susturur, aktivasyon ve lipopolisakkarit (LPS) indüklenmiş akciğer iltihabı6. Böylece, hem biyokimyasal (ATP sintaz) hem de immün (TLR4) mekanizmalar akciğer iltihabı sırasında alveoler bariyeri düzenleyebilir.
Çevresel bir kirletici olan ozona (O3)maruz kalmak akciğer fonksiyonlarını bozar, pulmoner enfeksiyonlara duyarlılığı arttırır ve kısa düşük O3 maruziyetleri alttaki kardiyorespiratuar koşulları 7 , 8 ,9 ,10,11,12, 13,14olanlarda mortalite riskini arttırır. Bu nedenle, fizyolojik olarak ilgili O3 konsantrasyonlarına maruz kalmak, temel inflamasyon mekanizmalarını incelemek için anlamlı bir ALI modeli sağlar7,8. Laboratuvarımız son zamanlarda düşük doz O3 indüklenmiş ALI15bir murine modeli kurmuştur. Düşük O3 konsantrasyonlarına bir doz ve zaman tepkisi yaptıktan sonra, 2 saat boyunca 0.05 ppm O3'e maruz kalmanın, LPS modeline benzer şekilde akciğer ATP sintaz kompleks V alt bir β liği (ATPβ) ve anjiyostatin ekspresyosu ile işaretlenen akut akciğer yaralanmasına neden olduğunu gözlemledik. İntravital akciğer görüntülemesi, akciğer hasarına işaret eden alveolar aktiin mikrofilamentlerinin dağınıklığını ortaya çıkardı, ve alveolar septal reaktif oksijen türlerinin (ROS) seviyelerinin (temel hücre sinyalinin kırılmasını gösteren) ve mitokondriyal membran potansiyelinin (akut hücre ölümünü gösteren) heterojen akciğer 18 FDG tutma16,nötrofil alımı ve sitokin salınımı ile ilişkili olan 0,05 ppm O315'e 2saat maruz kaldıktan sonra ablasyonu, özellikle IL-16 ve SDF-1α. Son çalışmalarımızdan eve götür mesajı, O3'ün insan maruziyeti için 8 saat (günde) üzerinde 0.063 ppm'lik izin verilen sınırların altındaki konsantrasyonlarda maruz kaldığında katlanarak yüksek toksisite ürettiğidir. Daha da önemlisi, bu alt klinik O3 maruziyetlerinin bakteriyel endotoksin17gibi TLR4 aracılı mekanizmaları modüle edip etmeyeceği konusunda net bir anlayış yoktur. Böylece, çift isabetli bir O3 ve LPS maruz kalma modelini inceledik ve immün ve bağışıklık dışı hücresel adaptasyonları gözlemledik.
Çeşitli akciğer ve sistemik vücut bölmelerinin, yani bronko-alveolar lavaj sıvısının (yani, BAL) lavajlı akciğer dokusunda kalan yerleşik parankimal ve yapışık lökositlere bakmak için alveolar boşlukları, akciğer damar perfüzyonlarını (yani LVP) örnekleyen akciğer damar perfüzyonu (yani, LVP) endotel bariyerinin tehlikeye girmesi durumunda alveolar septal interstisyumu, sol akciğer kriyoseksiyonlarını örnekleyen , dolaşımdaki lökositleri temsil eden periferik kan ve inflamasyon sırasında hematoetik hücre mobilizasyonunun proksimal ve distal bölgelerini örnekleyen sternal ve femur kemik iliği perfüzyonları.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Çalışma tasarımı Saskatchewan Üniversitesi Hayvan Araştırma Etik Kurulu tarafından onaylandı ve insancır hayvan kullanımı için Kanada Hayvan Bakımı Konseyi yönergelerine bağlı kalındı. Altı-sekiz haftalık erkek C57BL/6J fareler temin edildi. NOT: Planlanan bitiş noktasından önce şiddetli uyuşukluk, solunum sıkıntısı veya diğer şiddetli sıkıntı belirtileri gelişen hayvanları ötenazi edin.
NOT: Aşağıdakileri hazırlayın: 27-18 G iğne körelmiş (fare trakeal çapına bağlı olacaktır), künt iğneye uyacak şekilde uygun boyutta PE boru (her fare için bir PE kanül yapın), kanül, 2 keskin makas, 2 künt forseps (küçük), 1 keskin forseps (küçük), 3 1 mL şırınga, etiketli mikroyakıt tüpleri (BAL, kan, damar ve kemik iliği perfüzyon toplama için) ve etiketli şişeler (doku fiksasyonu için), doku toplama için örnek torbalar / cryovials, kasap pamuk ipliği rulosu (yeterli büyüklükte ligatürlere kesilmiş). Deneyler için kullanılan tüm kimyasallar Malzeme Tablosunda belirtilmiştir.
1. Murine akciğer hasarının indüksiyonu için ozon ve LPS maruziyetleri
- Ozon maruziyeti
- Özel bir O3 indüksiyon kutusu hazırlayın. Fare yemi, su şişesi, zenginleştirme oyuncakları ve temiz yatak takımlarını sırayla ekleyin ve farelerin barınma ortamını taklit edin.
NOT: Bu adımlar, farelerin özel indüksiyon kutusunda barındırıldığında yiyecek ve suya ücretsiz erişmelerini sağlayacak ve gereksiz stresi hafifletmeye yardımcı olacaktır. - UV lambasını elden önce stabilize etmek için O3 kalibratörünü/jeneratörünü "ON" (giriş portuna doğru yerleştirilmiş) değiştirin (pozlamalardan yaklaşık 15 dakika önce) ve hat içi O3 monitöre bağlayın.
NOT: O3 monitör, sabit oda hava sıcaklığında (72 ±3 °F) ve bağıl nemde (%50±15) çıkıştan örneklenerek ortalama 0±05 ppm okumalıdır. - O3 pozlamaları için, fareleri özel indüksiyon kutusuna hafifçe yerleştirin ve fareleri sürekli olarak 2 saat boyunca 0,05 ppm O3'e maruz bırakın.
- Özel bir O3 indüksiyon kutusu hazırlayın. Fare yemi, su şişesi, zenginleştirme oyuncakları ve temiz yatak takımlarını sırayla ekleyin ve farelerin barınma ortamını taklit edin.
- Anestezi ve intranazal LPS yönetimi
- Ketamin ve kslazin için ayrı ayrı 10 mg/mL stok hazırlayın.
- 20 parça ketamin ve 1 parça ksilazini karıştırarak bir kokteyl hazırlayın. Fare X g ağırlığındaysa, periton boşluğuna (X/200) mL ketamin/ksilazin kokteyli enjekte edin. Bir fare için, 10 mg / mL ketamin stoğunun 1000 μL'sine ve ksilazin stoğunun 50 μL'sine oluşan 1 mL kokteyl hazırlayın. Bir mikro yakıt tüpünde yukarı ve aşağı pipetleme yaparak iyice karıştırın.
NOT: Ketamin ve ksilazin stokları bir hafta önceden hazırlanabilir. - Fareleri hafif intraperitoneal (IP) ketamin (50 mg/kg)/ksilazin (1 mg/kg) karışımı altında uyuşturun (örneğin, 25 g fare için kokteylin 0,125 mL'sini enjekte edin).
- Salin içinde 1 mg / mL LPS çözeltisi hazırlayın ve çözeltinin 50 μL'yi bir pipette doldurun.
- Fareyi avuç içinde sırt/sırt tarafıyla dik tutun, kulakları aynı elle tutun. Şimdi, LPS çözeltisinin 50 μL'si18 hafifçe burun deliklerinin dışına yerleştirin (yani, her burun delicinde 25 μL veya bir burun deliğinde 50 μL; prosedür hızlı olduğu sürece önemli değildir) ve farelerin LPS çözeltisini solumasına izin verin.
- Kontrol farelerini 50 μL steril salin ile aşıla.
Dikkat: Aşılama için ölümcül olabilecek 100 μL'den fazla olmayın. Çok az hacim (yani, <50 μL) ve sadece burun birikimi riski vardır. - LPS yönetimini takiben, fareleri yavaşça, midelerine veya sırtlarını başlarını hafifçe aşağı bakacak şekilde yatak yığınına yatırın.
NOT: Bu yönelim, çözeltinin burun boşluğunda tutulmasını uzatır19. - Maruziyetten sonra 0, 2, 4, 24, 36 ve 72 saat'te, fareleri tam doz ketamin (200 mg/ kg) / ksilazine (4 mg / kg) karışımı (örneğin, X'in gram olarak fare ağırlığı veya 25 g fare için 0.50 mL olduğu kokteylin X / 50 mL) ile uyuşturun.
- Fareyi bilincini ve doğru refleksi kaybedene kadar gözlemleyin (yani, sırtüstü pozisyonda yatırıldığında geri dönmez). Şimdi, 1-2 dakika sonra gözle görülür şekilde düşmesi gereken solunum (ritmik göğüs gezileri) ve kalp atış hızını izleyerek fareyi anestezi derinliği açısından kontrol edin.
- Daha sonra, pedal reflekslerini kontrol edin, yani arka uzuv basamaklarından birini kıstırın ve bir refleks olarak uzuvların geri çekilmesini gözlemleyin. Fare yanıt verirse, gerektiğinde ek 0,1 mL enjeksiyonları veya daha fazlası ile yükleme.
NOT: Derin anestezi elde etmek için, bazı suşların veya obez farelerin genellikle daha büyük bir dağılım hacmine sahip olduğunu ve bu nedenle tam anestezi için yeterli zaman izin verilmezse (yaklaşık 10 dakika veya daha fazla olabilir) kolayca aşırı yapılabilir. Buna göre, bazı suşlar anesteziye karşı dirençli olabilir ve bu nedenle daha fazla yükleme gerektirir. Bu bilgi, farklı suşlardan ve yaştaki farelerle birçok pratik gözlem ve deneyimden sonra edinilir. O 3 ve LPS maruziyetlerinden hemen sonra (yani2 saat zaman noktasında) birkaç pilot deney de yapıldığı için, kombine O3ve LPS maruziyetinin hemen etkilerini vurgulamak için bu deneylerden bazı çok erken BAL hücre analizlerini de dahil ettik.
2. Örnek toplama
- Fareyi cerrahi tepsiye yerleştirin. Şimdi, sıvı kaybını önlemek ve fareyi% 70 etanol spreyi ile sterilize etmek için her iki göze de yağlama göz merhemini hafifçe koyun.
- Trakea ve toraksı ortaya çıkarmak için üst ve alt deri zarlarını makasla küçük kesikler yapın.
- Göğüs kemiğinin hemen altında bir kesik yapın ve kalbi açığa çıkarın.
- Kardiyak delinme
- Heparinize şırıngaya bağlı bir 25G iğneyi sağ ventriküle yerleştirin ve kalp delinmesi ile kan alın.
NOT: Kalbi kalp delinmesine maruz kalma süresi bir dakikanın altındaysa, kan genellikle minimum piston çekilmesi ile çekilir. Yaklaşık 0.4-0.5 mL topladıktan sonra, kalan kanı toplamadan önce birkaç saniye duraklamanız gerekebilir. Bu, kalbin kalan herhangi bir hacmi sağ ventrikül odasına pompalamasına izin vermek için yapılır. Kan toplamanın sonunda, kalp pompalamak için durur. - Kanı toplayın ve daha fazla işlem için mikroyapı tüplerinde saklayın.
- Heparinize şırıngaya bağlı bir 25G iğneyi sağ ventriküle yerleştirin ve kalp delinmesi ile kan alın.
- Trakeostomi
- Trakeal bölgeyi aşırı dokudan temizlemek için cımbız /künt tokmakları dikkatlice kullanın. Kanamayı önlemek için eldivenli elleri cerrahi aletlerden daha fazla kullanın. Çok fazla kan sızıyorsa, BAL örneklerini kirletme riski vardır. Tercih olmasa da gerekirse pamuklu çubuk kullanın. Kimwipes daha iyi alternatifler.
- Şimdi, akciğerleri açığa çıkarmak için göğüs kafesini kesin. Yine, sternumu ve interkostal arterleri veya yükselen aortu kesmemek için dikkatli olun; göğüs kafesi boyunca ilerlerken daha küçük kesikler yapmak)
- Nefes borusunun altına pamuklu bir bağ geçirin ve şimdilik bu şekilde bırakın.
- 28 G trakeal bir kolayın erişimine izin vermek için nefes borusunun distal 1/3rd kısmında akciğerlere doğru işaret ederek uygun bir yerde kırpın.
- Nefes borusuna 28 G PE'lik bir kolayil (minimum 3-5 mm uzunluğunda ve takma kolaylığı için kesilmiş distal uç) yerleştirin. Çatallanmadan önce nefes borusunun ucuna dikkat edin ve ardından sadece tek lob örneklemeyi önlemek için yaklaşık bir mm geri çekin.
- Kanülü yerinde tutmak için pamuk bağını sıkıca bağlayın. Canülleri çökertme.
- Bronko-alveolar lavaj (BAL)
- 0,5 mL PBS'yi 1 mL şırınna doldurun.
- Şimdi yavaş yavaş 1 mL şırınna yardımıyla 0,5 mL PBS'yi kanolaya enjekte edin.
- PBS enjekte ettikten sonra, emişe direnmediği sürece şırınnayı epire edin.
NOT: BAL sıvısını çıkarırken direnç varsa, bu alveolar veya bronş dokusunun çökmesini gösterir. Bu durumda, kanolün doku duvarlarını ayırmak için bir miniscule tarafından kanolü geri çekin. - Aspire sıvıyı etiketli bir mikroyakıt tüpünde toplayın ve buza yerleştirin.
- Aynı şişede toplamada benzer şekilde iki lavaj daha gerçekleştirin (yani, toplam 0,5 X 3 = 1,5 mL lavaj).
- Toplanan BAL sıvısının hacmini ölçün. Lavaj iyileşmesi % 90'a yakın olmalıdır.
- Akciğer vasküler perfüzyon (LVP)
- Sağ ventrikülden perfüzyon yaparken akciğerlerde perfüzyonun herhangi bir şekilde yedeklenmemesi için, torasik ve karın yarıları arasındaki bir yerde alçalan torasik aortu kesin.
- Kesilen aort ucunun yakınındaki boşluğu kansız olarak lekele.
- Daha sonra, akciğerleri sağ ventrikülden enjekte edilen 0,5 mL oda sıcaklığında heparinize salin ile perfuse edin.
- Vasküler perfüzyonu, azalan torasik aortun kesik ucundaki boşluktan, buza yerleştirilmiş bir mikrofuge tüpünde toplayın ve hacmini ölçün.
- Sağ bronş proksimalini trakeadan dallanmalarına kadar (pamuk ipliği ile) ligat edin.
- In situ sol akciğer fiksasyonu
- 1 mL'lik bir şırınnayı trakeal kanamaya bağlayın, bu da önceki trakeal kesiden geçecek kadar uzundur.
- Şırınnada 0,6 mL işaretine kadar havayı geri çekin.
- Daha sonra, kalan şırınnayı (sonuna kadar) oda sıcaklığında% 2 paraformaldehit ile doldurun. Pistonun kanülden herhangi bir hava emmeden çıkmaya hazır olduğundan emin olun.
- Şimdi, şırınnayı 20 cm yüksekliğe kadar ölçülen dik bir kaba bir viski bandı ile yapıştırın.
- Yavaş yavaş, sabitleyicinin nefes borusuna doğru akmasını sağlamak için pistonu dışarı çekin. Kanonda birkaç hava kabarcığı olması durumunda, pistonu şırıncığın üzerine hafifçe yerleştirin ve sıvı birkaç saniye sonra akmaya başlayacaktır.
- Sol akciğerin 20 cm'lik bir su sütunu oluşturan 20 cm yükseklikten 5 dakikaboyunca toplam kapasitesine in situ şişmesine izin verin.
- Bu işlem sırasında, sağ akciğer loblarını paraformaldehit ile temas etmesini önleyin, çünkü bu durum aşağı akış testlerini etkileyecektir.
- Sağ akciğer loblarıyla temas edebilecek herhangi bir paraformaldehiti emmek için katlanmış laboratuvar dokuları yerleştirin.
DİkKAT: Paraformaldehit oldukça zehirlidir. Bu nedenle, vücudun maruz kalan herhangi bir yerine soluma veya temas etmeyin. Kullanım yaparken çok dikkatli olun. - Paraformaldehit aşılaması sırasında, karnı sterilize edin.
- Herhangi bir ipliği çıkardığınızdan emin olarak sağ akciğer loblarını trakeadan kesin ve lobları hemen etiketli bir cryovial içine koyun ve akciğer homojenliğinin aşağı akış moleküler / biyokimyasal sitokin analizi / RT-PCR / batı blot analizi için sıvı nitrojene bırakın.
- Herhangi bir bağ dokusu veya plevral membran için sol akciğeri dikkatlice kesin ve 4 °C'de 24 saat boyunca% 2 paraformaldehit içine batırın.
- Sabit akciğeri standart gömme protokolüne göre parafin içine gömün.
Dikkat: Akciğer örneklerini aşırı ısıtmayın. - Karın kısmını kesin ve pelvik (kalça) kemikten derisini sönümleyin.
- Sol ve sağ uyluk kemiği kemiklerini pelvik kısımdan, buzda tutulan tuzlu su dolu bir petri kabında ayırın.
- Sternal ve femur kemik iliği aspirat koleksiyonu
- Laboratuvar dokularını kullanarak kemiklerin dokusunu ve kaslarını temizleyin.
- Ventral göğüs kafesi ve sternumu buzda tutulan tuzlu su dolu petri kabına toplayın.
- Sternal ve femur kemiklerinin distal ve proksimal uçlarını kesin.
- Kemikleri 1 mL şırıngaya iyi yerleştirilmiş iğneler (24 ila 28 G) kullanarak 0,5 mL salin ile 4 kez perfuse edin ve her kemikten fraksiyonları filtrelerle donatılmış ve buza yerleştirilmiş etiketli tüplere toplayın.
NOT: İğne göstergesi hayvan boyutu arasında değişir. Kızardıktan sonra, uyluk kemiği şeffaf gösterilmelidir. - Numuneler toplandıktan sonra, fareyi plastik bir torbaya koyun ve kurumsal hayvan tesisinin yönergelerine uygun şekilde uygun şekilde bertaraf edilmek üzere bir hayvan karkası dondurucusunda koyun.
3. Örnek işleme
- Toplam (TLC) ve diferansiyel (DLC) lökosit sayımları
- Santrifüj periferik kan, BAL, akciğer vasküler perfüzyon ve kemik iliği (sternal ve femur) örnekleri 10 dakika boyunca 500 g.
- Süpernatantları toplayın, flaşla dondurun ve bir sonraki analize kadar -80 ° C'de saklayın.
- Hücreleri en az 200 μL PBS içinde yeniden inşa edin.
- Hemositometrede BAL, kan, akciğer vasküler perfüzat ve kemik iliği hücrelerini sayarak TLC yapın.
- Hücre içi esteraz aktivitesi nedeniyle canlı (yeşil) hücreleri ve plazma zar bütünlüğünün kaybı nedeniyle zarar görmüş BAL hücrelerini (kırmızı) ölçmek için bal'ın 9 μL'lik bir aliquotunu 1 μL'lik bir kalsein yeşili ve kırmızı ethidium homodimer-1 karışımı ile lekelenin.
- Lyse RBC'lere% 2 asetik asit ekleyin, kan TLC için 1:10 oranında ve akciğer vaskülerperfüzat TLC için 1:2 oranında.
DİkKAT: Konsantrasyon mL başına 1x106 hücreden fazlaysa (kemik iliği örnekleri için çok önemlidir) PBS'de seyrelterek hücre konsantrasyonlarını ayarlayın. - DLC'ler için aşağıda açıklandığı gibi slaytlarda ve lekelerde sitospinler hazırlamak için hücreleri santrifüjleyin.
NOT: Genellikle, bir slaytta iki sitospin hazırlanabilir. Ve 10-15 dakika hava kuruduktan sonra, lekeleme adımı ile devam edin. - Toplanan BAL'ı grup başına üç pilot fareden her biri iki sitospin ve aktif oksidatif fosforilasyonlu (azaltılmış mitotracker) aktin/ tübülin ve mitokondri lekesine bölün. NK1.1/Gr1/CX3CR1 ve ATPβ/Ki-67/CD61/Angiostatin lekeli slaytlar için bal'ı üç fareden daha kullanarak her biri iki sitospin'e bölün. BAL'ı üç fareden daha atpα/Ly6G ve CX3CR1/Siglec-F için leke yapmak üzere iki sayaca bölün.
- Bronkoalveoler lavaj (BAL) ve Akciğer Vasküler Perfüzyon (LVP) toplam protein nicelemesi
- İki pulmoner bölmedeki (yani alveolar septal (interstisyel) ve akciğer vasküler perfüzyon (vasküler) bölmelerdeki vasküler bariyerin O3 ve LPS kaynaklı pertürbasyonlarını veya bağıl onkotik basıncı ölçmek için toplanan sıvılardaki toplam protein içeriğini ölçün.
- Çözülen süpernatant fraksiyonları, standart bir deterjana dayanıklı kolorimetrik test kullanarak toplam protein konsantrasyonları için analiz edin.
- Bronkoalveoler lavaj (BAL) ve akciğer vasküler perfüzyon (LVP) kemokin analizi
- Daha sonra, BAL ve akciğer vasküler perfüzyon (LVP) süpernatantlarındaki kemokinleri 33 yönlü manyetik boncuk bazlı bir immünoassay kullanarak analiz edin. Bu, kombine maruziyetlerden sonra kurulan hava yolu/intersitium vs vasküler kemokin gradyanlarının yönü hakkında bilgi verecektir.
- Analyze the following panel of chemokines : CXCL13 (B-lymphocyte chemoattractant), CCL27 (IL-11 R-alpha-locus chemokine (ILC)), CXCL5 (epithelial-derived neutrophil-activating peptide 78 (ENA-78)), CCL-11 (eotaxin-1), eotaxin-2 (CCL-24), CX3CL1 (fractalkine), GM-CSF (CSF-2), CCL1, IFNγ (interferon gamma), IL-10 (interleukin-10), IL-16 (interleukin-16), IL-1β (interleukin-1 beta), IL-2 (interleukin-2), IL-4 (interleukin-4), IL-6 (interleukin-6), CXCL-10 (interferon gamma-induced protein 10 (IP-10)), CXCL11 (Interferon-gamma-inducible protein 9 (IP-9)), KC (keratinocyte chemoattractant), MCP-1 (monocyte chemoattractant protein-1), MCP-3 (monocyte chemoattractant protein-3), MCP-5 (monocyte chemoattractant protein-5), MDC (macrophage-derived chemokine (CCL22)), MIP-1α (macrophage inflammatory protein-1 alpha), MIP-1β (macrophage inflammatory protein-1 beta), MIP-2 (macrophage inflammatory protein-2), MIP-3α (macrophage inflammatory protein-3 alpha), MIP-3β (macrophage inflammatory protein-3 beta), RANTES (aktivasyonda düzenlenir, normal T hücresi eksprese edilmiş ve salgılanmış (CCL5)), CXCL-16, CXCL-12/SDF-1alpha (stromal hücre türevi faktör 1), TARC (timus ve aktivasyon düzenlenmiş kemokin (TARC)), TECK (Timus Eksprese Edilmiş Kemokin (CCL25)) ve TNFα (tümör nekroz faktörü alfa).
4. Sitospin lekeleme ve akciğer histolojisi
- Sitospin biyokimyasal boyama
- İşlem sırasında inkübasyon için kimyasalları içermek için sitospinleri hidrofobik bir kalemle çevrele.
- Sitospinleri PBS'de 5 dakika boyunca yeniden sulayın.
- Sitospin örneklerini 10 dakika boyunca% 2 paraformaldehitte sabitleyin, her biri 5 dakika PBS ile üç kez yıkayın.
- Buz gibi % 70 aseton ile 7 dakika permeabilize edin ve tekrar PBS ile her biri 5 dakika üç kez yıkayın.
- Actin ve tubulin veya azaltılmış Mitotracker için leke (yeşil renkte gösterilen 2 μg/50 μL Alexa 488 konjuge phalloidin karışımı ile kuluçkaya yatır ve 2 μg/μL Alexa 555 konjuge fare anti-α tubulin veya azaltılmış Mitotracker, kırmızı ile gösterilir) 15 dakika boyunca.
NOT: Tübulin boyama protokolünü doğrulamak için ayrı bir sitospin içinde fare IgG1 izotip kontrol antikoru kullanın. 4.1.1 ile 4.1.8 arasında açıklanan adımları uygulayın, ancak izotip kontrolleri için. - Karışımı slayttan hafifçe devirerek lekeleri çıkarın. Slaytları DAPI (4′, 6-diamidino-2-fenylindole) ile 5-10 dakika boyunca nuclei lekeleyin.
- Sitospinleri PBS ile her biri 5 dakika boyunca 3 kez yıkayın, solmaya karşı montaj ortamı ile kapakçık yapın ve görüntülemeden önce oda sıcaklığında gece boyunca karanlıkta saklayın.
- Bilimsel bir kamera ile donatılmış geniş alanlı dik mikroskop altında görüntüler elde edin. Slaytları görüntülerken farklı floresan kanallar için tutarlı kamera pozlama sürelerinin ayarlandığından emin olun.
- Sitospin immün floresan boyama:
- İşlem sırasında inkübasyon için kimyasalları içermek için sitospinleri hidrofobik bir kalemle çevrele. Sitospinleri PBS'de 5 dakika boyunca yeniden sulayın.
- Sitospin örneklerini 10 dakika boyunca% 2 paraformaldehitte inkübe ederek sabitleyin, her biri 5 dakika PBS ile üç kez yıkayın.
- 2 dakika boyunca% 0.1 soğuk triton X-100 ile permeabilize edin, pbs ile her biri 5 dakika boyunca üç kez yıkayın.
- Daha sonra, Fc blok antikor stoğunun 1:50 seyreltilmesi ile sitospin inkübe ederek 15 dakika boyunca Fc bloğu (birincil fare antikorunun özellikle fare Fc antikorları ile çapraz tepki vermemesini sağlamak için).
- Fc bloğunu çıkarmak ve 30 dakika boyunca 3 birincil ilgi antikoru (çeşitli kombinasyonlar için Tablo 1'e bakın) karışımıyla sitospin için% 1 BSA'ya değiştirmek ve kuluçkaya yatırmak için slaytlara bahşiş verin.
NOT: Son çalışmamızda tartışıldığı gibi karşılık gelen ikincil antikorlara paralel olarak izotip kontrol antikorlarını (4.2.1 ila 4.2.9 adımlarını gerçekleştirerek ve antikorları izotip kontrolleriyle değiştirerek bir karışım fare IgG1 ve sıçanIgG2bkappa primer antikorları ile kuluçkaya yatırmayı unutmayın) çalıştırın. - PBS ile her biri 5 dakika boyunca 3 kez yıkayın. Sitospinleri uygun şekilde tasarlanmış ikincil antikorların bir karışımıyla kuluçkaya yatırın (ayrıntılar için lütfen Tablo 1'e bakın).
- Karışımı slayttan hafifçe devirerek lekeleri çıkarın, çekirdekleri lekelendirmek için 5-10 dakika boyunca DAPI (4′, 6-diamidino-2-fenylindole) ile kuluçkaya yatırın. PBS ile her biri 5 dakika boyunca 3 kez yıkayın.
- Solmaya karşı montaj ortamına sahip kapakçık ve görüntülemeden önce gece boyunca oda sıcaklığında karanlıkta saklayın.
- Bilimsel bir kamera ile donatılmış geniş alanlı dik mikroskop altında görüntüler elde edin. Slaytları görüntülerken tüm florofor kanalları için tutarlı kamera pozlama sürelerinin ayarlandığından emin olun.
- Hematoksilin ve eozin (H&E) histolojisi
- Tüm gruplar için akciğer kriyo bölümlerinde değiştirilmiş H&E boyama3 gerçekleştirin.
- Görüntü analizi
- Fiji ImageJ açık yazılımındaki (https://imagej.net/Fiji/Downloads) görüntü verilerini (.tiff) işleyin ve analiz edin.
- Analiz sekmesi ve Ölçümleri Ayarlaaltında kaydedilecek gerekli parametreleri (Alan, Çevre, Tümleşik Yoğunluk, Şekil tanımlayıcıları, Feret çapı, Döngüsellik, Ekran etiketi) kontrol edin.
- Yatırım getirisi yöneticisinikullanarak, "serbest seçimler" aracını kullanarak birleştirilmiş görüntü panelinde yaklaşık 50-200 hücreyi manuel olarak özetleyin. Ctrl+T komutuyla ilgi alanlarını (ROI) kaydedin ve her hücre için kaydedilen ROI'leri tüm florofor kanallarına kopyalayın.
- Ardından, tüm floresan kanalların önceden ayarlanmış parametrelerini ölçmek için Ctrl+M tuşlarına basın (örn. 405 nm (mavide DAPI veya ATPβ), 488 nm (actin veya NK1.1 veya ki-67 yeşil), 568 nm (tubulin veya Gr1 veya CD61 kırmızı) ve 633 nm (macenta'da CX3CR1 veya angiostatin)).
- Sonuçları, çözümleminizi temsil eden uygun bir adla .csv dosyası olarak kaydedin. sonuçları .csv dosyasından bir elektronik tabloya kopyalayın ve lekeli molekülün floresan yoğunluğunu (SONUÇLAR dosyasından Ham Entegre Yoğunluk sütunu olan) boyama tasarımına göre DAPI veya CD61 FI'ye bölün. Bu oranlar "DAPI veya CD61 normalleştirilmiş FI oranları" olarak terimlendirilir.
- Daha sonra, kombine O3 ve LPS maruziyeti sonrasında hücre boyutundaki herhangi bir değişikliği değerlendirmek için bu normalleştirilmiş oranları, döngüselliği, hücre çevresini ve Feret çapını çizin.
- Toplanan verilerin normalliğini kontrol etmek ve boş hipotezi test etmek için uygun istatistiksel yazılımı kullanın (lütfen aşağıdaki istatistiksel analiz bölümüne bakın).
- İstatistiksel Analiz
- Sonuçları SEM ± ortalama olarak ifade edin. Grup başına en az üç fare kullanıldı.
- Kemokin veri analizi için, Benjamini ve Hoshberg düzeltmesine göre yanlış keşif oranı için tek yönlü ANOVA p değerlerini ayarlayın.
- Görüntü parametrelerini, hücreselliği, Feret çapı, çevreyi, DAPI veya CD61 normalleştirilmiş floresan yoğunluk oranlarını Mann-Whitney U testi (iki grubu karşılaştırmak için) veya Kruskal Wallis testi (birden fazla grubu karşılaştırmak için) ile analiz edin, çünkü bu veriler normalde dağıtılmamıştır.
- Görüntüleme deneylerinin geri kalanı için, sonuçları Sidak'ın çoklu karşılaştırmalarının ardından tek yönlü bir varyans analizi kullanarak analiz edin. p-değerleri <0.05 önemli kabul edildi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Kombine O3 ve LPS maruziyeti 72 saatte sistemik inflamasyona ve kemik iliği mobilizasyona yol açar: Farklı bölmelerdeki hücre sayıları periferik kanda önemli değişiklikler ve kombine O3 ve LPS maruziyetlerinde uyluk kemiği iliği toplam hücre sayılarında önemli değişiklikler olduğunu ortaya koydu. Kombine O3 ve LPS maruziyetleri toplam BAL (Şekil 1A) veya LVP ( Şekil1B) hücre sayılarında herhangi bir değişikliğe neden olmasa da, maruziyet sonrası 24 (Şekil 1F, Ek Şekil 1 ),36 ve 72 saat'te baskın hücre tipi olarak sunulan polimorfonukleer hücreler. Polimorfonuclear hücrelerde 24 h BAL sitospin görüntüsünde Siglec-f ve CX3CR1 lekelerinin olmamasına dikkat edin (Şekil 1F). BAL sitospinlerinin üçlü DAPI/CD11b/Gr1 boyanmasında, 0 h'de makrofaj olan büyük CD11b ve Gr1 pozitif mononükleer hücrelerin varlığı gösterildi, bu hücreler 4 h'de dakik Gr1staining gösteren ancak CD11b boyamadan yoksun daha küçük polimorfonuklear hücrelere dönüşür (Ek 1F'dekigirişte gösterildiği gibi). BAL hücrelerinin çoğunluğu polimorforükleerdir ve hem CD11b hem de Gr1 için pozitiftir, 24 saat maruziyet sonrası(Ek Şekil 1).
Fareler 24 saat (3.3 kat vs 0 h) sistemik lökositoz gösterdi, p<0.05, Şekil 1C) tarafından takip edilen lökopeni 72 saattir ve periferik kanda 24 h (p<0.01) ile karşılaştırıldığında 13 kat daha düşük sayımlar ve toplam O 3 ve LPS maruziyeti(Şekil 1C)sonra 4 h'ye (p<0.05) kıyasla8.6 kat daha düşük olarak işaretlenmiştir. Sternal kemik iliği hücreleri de 0 h ile karşılaştırıldığında veya kombine O3 ve LPS maruziyeti sonrasında değişmedi (Şekil 1D). Uyluk kemiği iliği sayımları, 0 h (p<0.01, Şekil 1E)ve diğer zaman noktalarına (p<0.01, Şekil1E) kıyasla 72 saatte 28.8 kat geç bir artış gösterdi. LVP ve sternal ve femur kemik iliği hücrelerinin görselleştirilmesi de hücre tiplerinde ağırlıklı olarak polimorforükleer hücrelere değişikliklergöstermiştir (Ek Şekil 1). Sternal kemik iliği hücreleri hücre dışı nükleer maddede kanıtlanan hasar belirtileri gösterdi. Uyluk kemiği iliği, hücre sayılarıyla çakışan daha yüksek sayıda CD11b ve Gr1 pozitif hücre(Ek Şekil 1)gösterdi.
BAL toplam protein içeriği, kombine O 3 ve LPS maruziyeti sonrasında36 saat ile en yüksek düzeydeydi: LVP ve BAL bölmelerindeki toplam proteinlerin nicelemesi, ozon kaynaklı akciğer ödemini, yani kombine maruziyete bağlı vasküler ve epitel bariyer bozukluğuna bağlı plazma protein eksüdasyonunu ilişkilendirmek için gerçekleştirildi. BAL toplam proteini 4 saat(Şekil 2A)ile karşılaştırıldığında 36 saat (p<0.05) ile karşılaştırıldığında 4.5 kat daha yüksekti. Bununla birlikte, LVP proteini maruz kaldıktan sonra değişmedi (Şekil 2B).
Kombine O3 ve LPS maruziyeti BAL'da değil akciğer damar bölmesinde güçlü kemokin gradyanlarına neden oluyor: Hem BAL hem de LVP süpernatantlarında kemokin multipleks tahlilleri yapıldı. Bu iki bölme arasındaki göreli farklılıkların belirli bir bölmede tercihli saklamayı temsil ettiğini lütfen unutmayın. Eozinofil kemoattraktant eotaxin-2, LVP bölmesinde 4 saatte 0 h'ye kıyasla 4.3 kat daha yüksekti (p<0.05, Şekil 3A). BAL bölmesinde, eotaxin-2 0 h ile karşılaştırıldığında 4 saatte 3.2 kat daha düşüktü (p<0.01, Şekil 3B). BAL eotaxin-2 seviyeleri 0 h'ye kıyasla 12,6 kat azalma ile 72 h'ye kadar sürekli olarak azalmaya devam etti (p<0,01, Şekil 3B). Lenfosit kemoattraktant IL-2, LVP bölmesinde 4 saatte 0 h'ye kıyasla 10<1 kat daha yüksekti (p<0.05, Şekil 3C). BAL bölmesinde IL-2, 0 h ile karşılaştırıldığında 36 saat'te 5.0 kat daha düşüktü (p<0.05, Şekil 3D). BAL eotaxin-2 seviyeleri, 0 h'ye kıyasla 72 h'de sürekli olarak 5,9 kat azalmaya devam etti (p<0,05, Şekil 3D).
İlginçtir ki, bal'da değil, LVP'de 4 saat içinde birçok kemokin değiştirildi. Bu kemokinlerin çoğu, daha sonraki zaman noktalarına kıyasla LVP seviyelerinde 4 saatte mütevazı, ancak önemli bir artış gösterdi. Maruziyetlerden sonra 0 h ile karşılaştırıldığında eotaxin-1 seviyeleri yüksek olmasa da, kombine maruziyet sonrası 24 (2.7 kat, p<0.05) ve 72 h (5.0 kat, s<0.01, Şekil 4A)ile karşılaştırıldığında 4 h'de seviyeler önemli ölçüde yüksekti. LVP TNFα seviyeleri 36 h ile karşılaştırıldığında 4 saatte 3.4 kat daha yüksekti (p<0.05, Şekil 4B). Benzer şekilde, LVP IFNφ 72 h ile karşılaştırıldığında 4 saatte 2.9 kat daha yüksekti (p<0.05, Şekil 4C). CX3CL1 seviyeleri, kombine maruziyetlerden sonra 24 (1,7 kat, p<0,05), 36 (1,6 kat, s<0,05) ve 72 h (2,2 kat, s<0,01) ile karşılaştırıldığında 4 saat yüksekti (Şekil 4D). CCL27 seviyeleri, kombine maruziyetlerden sonra 24 (2.7 kat, p<0.05), 36 (3.9 kat, p<0.01) ve 72 h (2.9 kat, p<0.05) ile karşılaştırıldığında da 4 h'de daha yüksek seviyeler gösterdi (Şekil 4E).
Bazı kemokinler kombine maruziyetlerden sonra LVP'de 4 saatte güçlü bir varlığa sahipti ve maruz kalmadan önce ve sonra BAL'da değişmedi, pulmoner kılcal damarlardan güçlü bir kemokin yanıtı olduğunu gösteriyor. Saat 4'te, IL-16 LVP seviyeleri 0 h (p<0.01), 3.2 kat ve 24 h (p<0.01) ile karşılaştırıldığında 3.4 kat olarak belirlendi. Kombine pozlamalardan sonra 36 saat (p<0.01) ve 4.6 kat ile karşılaştırıldığında 72 h (p<0.01) ile karşılaştırıldığında 4.5 kat (Şekil 4F). Saat 4'te nötrofil kemokin, CXCL5 LVP seviyeleri 0 h (p<0.01), 4.7 kat ve 24 h (p<0.01) ile karşılaştırıldığında 2.0 kat oldu 36 saat (p<0.01) ve 2.7 kat ile karşılaştırıldığında 72 h (p<0.01) kombine maruziyetlerden sonra (Şekil 4G). Saat 4'te, CXCL10 LVP seviyeleri 0 h (p<0.01), 2.1 kat ve 24 h (p<0.05) ile karşılaştırıldığında 2.3 kat olarak belirlendi. 36 saat (p<0.01) ve 2.7 kat ile karşılaştırıldığında 72 h (p<0.01) kombine maruziyetlerden sonra (Şekil 4H). Saat 36'da, nötrofil kemokin, SDF1α LVP düzeyleri 0 h (p<0.01) ile karşılaştırıldığında 4.2 kat, 24 h (p<0.05) ile karşılaştırıldığında 2.9 kat, kombine maruziyetlerden sonra 72 h (p<0.01) ile karşılaştırıldığında 6.8 kat(Şekil 4I)oldu. 4 saat'te MIP3β LVP seviyeleri 0 h'ye (p<0.05) kıyasla 2.3 kat, kombine maruziyetlerden sonra 72 h'ye (p<0.05) kıyasla 2.3 kat oldu (Şekil 4J).
Kombine O3 ve LPS maruziyeti nekrozlara neden olur, hücresel sitoskeletal, plazma zarı ve mitokondriyal bütünlüğü bozar: Bölmeli lökosit sayısı ve protein içeriği LVP kemokin gradyanları ile ilişkili olmadığı için, bu bölmelerden elde edilen hücreleri görselleştirmek daha önemli hale geldi. Taban çizgisinin (0 h) BAL hücrelerinin ex vivo aksin/tübulin lekelemesinde kortikal aksin, stres liflerinin yanı sıra lamellipodia (yeşil, Şekil 5 sol üst panelde gösterilmiştir) ve mikrotübül ağı (kırmızı, Şekil 5 sol üst panelde gösterilmiştir) aktif mitotradri varlığını gösteren azaltılmış mitotracker lekeleme ile çakıştı (kırmızı, Şekil 5 sol alt panelde gösterilmiştir). BAL hücrelerinin %95'inden fazlası temel olarak mononükleer idi. 4 saat içinde BAL hücrelerinde hücre dışı nükleer madde, lamellipodia'dan yoksun dakik sitoplazmik aktin boyama ve azaltılmış kortikal aktin boyama (yeşil, Şekil 5 sağ üst panelde gösterilmiştir), azaltılmış mitotracker boyamasına karşılık gelmeyen fanlı mikrotübül ağı (kırmızı, Şekil 5 sağ üst panelde gösterilmiştir) gösterilmiştir (kırmızı, Şekil 5 sol sağ panelde gösterilmiştir). DAPI normalleştirilmiş akrin floresan yoğunluğu analizi, maruziyetten sonra 4 saat'te aksin lekelemesinde azalma olduğunu gösteren oranda 3.7 kat azalma olduğunu göstermiştir (p<0.01, Şekil 6A). Benzer şekilde, DAPI normalleştirilmiş tübulin floresan yoğunluğu da maruziyetten sonra 1,5 kat azaldı (p<0.01, Şekil 6B), tübulin lekelemesinde bir azalma olduğunu gösterir. Lamellipodia kaybı, BAL hücresel sitoskeletonunun daireselliğindeki artışla, yani 2 saat (s<0.01, Şekil 6C) ve 4 h (p<0.05, Şekil 6C)maruziyet sonrası 0 h ile karşılaştırıldığında ve sitoskeletal döngüsellikte 24 (p<0.05) ve 36 h'de (p<0.01) bir azalma, maruz kaldıktan sonra, 0 h ile karşılaştırıldığında (Şekil 6C).
24 saate kadar, kombine maruziyetten bal hücreleri aktif esteraz aktivitesinin varlığını gösteren kalsein için çift pozitifti (yeşil, Şekil 7)ve bazı hücrelerin ölü (kırmızı) olmasına rağmen, çoğunluğun kısmen tehlikeye girdiğini gösteren ethidyum homodimer (kırmızı, Şekil 7). 36 saat içinde BAL hücreleri büyük ölçüde uygulanabilirdi (yeşil), tehlikeye atılan hücrelerin diğer sistemik bölmelerden alınan lökositlerle değiştirildiğini gösterir (Şekil 7).
BAL hücrelerinin spesifik ATPα ve Ly6G boyanmalarında, hem alveolar makrofajlardaki proteinlerin hem de maruziyet sonrası nötrofillerin ayrı hücre içi lokalizasyonu(Filmler 1 ve 2)ortaya çıktı (Şekil 7). Kombine maruziyet, ATPα'nın DAPI normalleştirilmiş floresan yoğunluk oranında azalmaya (Şekil 7, 8A) ve hücre içi Ly6G protein içeriğinde artışa yol açtı (Şekil 7, Şekil 8B, Filmler 1 ve 2). ATPα lekelemede azalma, maruziyet sonrası 24 saat, alt tübulin ile ilişkili ve bir dereceye kadar azaltılmış mitotracker lekeleme. Ayrıca maruziyetten sonra trombosit olabilen bir nükleer ATPα pozitif hücre cisimleri gözlemledik. Ancak, bulgularımızı doğrulamadık. Saat 2'de, 0 h ile karşılaştırıldığında daha küçük mononükleer BAL hücreleri (p<0.01 Şekil 8C, p<0.01 Şekil 8D)gözlemledik, ancak 4 saat'te mononükleer hücreler 0 h ile karşılaştırıldığında daha büyüktü (p<0.01 Şekil 8C, p<0.01 Şekil 8D). 24 (p<0.01 Şekil 8C, p<0.01 Şekil 8D) ve 36 h (p<0.01 Şekil 8C, p<0.01 Şekil 8D)olarak BAL hücreleri, 0 h ile karşılaştırıldığında polimorfonuclear hücrelere doğru kayma nedeniyle giderek küçüldü.
BAL hücrelerinin immünofonotipsiyonu, NK1.1, ATP β ve Ki-67'nin geçici ifadelerini ve kombine O 3 ve LPS maruziyetlerinden sonra Gr1,CX3CR1 ve anjiyostatin pozitif BAL hücrelerinin sürekli ifadelerini ortaya koydu: BAL sitospinlerinin ilk kümesinin immünoforezan lekesi DAPI lekelemede normalleştirildi. Hücresel NK1.1 pozitif hücrelerinde 24 saatte bir artış oldu (p<0.05 vs 0 h, Şekil 9, 10A). 36 saat'te BAL hücreleri daha düşük hücresel NK1.1 floresan yoğunluğuna sahipti (p<0.01 vs 0 ve 24 h, Şekil 9, 10A). Hücresel Gr1 floresan yoğunluğu 24 saat (p<0.01 vs 0 h, Şekil 9,10B)ve 36 h (p<0.01 vs 0 h, Şekil 9,10B)daha yüksekti. Benzer şekilde, hücresel CX3CR1 floresan yoğunluğu 24 saat (p<0.01 vs 0 h, Şekil 9, 10C)ve 36 h (p<0.01 vs 0 h, Şekil 9,10C)daha yüksekti.
Hücresel CD61'e normalleştirildiğinde, ifadede de her yerde bulunan hücresel ATPβ floresan yoğunluğunda 24 saat (p<0.01 vs 0 h, Şekil 9, 10D)ve hücresel ATPβ floresan yoğunluğunda 36 saat (p<0.01 vs 0 ve 24 h, Şekil 9,10D)bir azalma olduğunu ortaya koydu. Özellikle, ATPβ ağırlıklı olarak 24 saat'te nükleer lokalizasyon gösterdi ve periferik lokalizasyon 36 saat(Şekil 9). Hücresel çoğalma göstergesi olan BAL Ki-67'nin hücresel floresan yoğunluğu 0 ve 36 saate kıyasla 24 saat (p<0.01 vs 36 h, Şekil 9, 10E)daha yüksekti. Seviyeler 36 saat (p<0.01, Şekil 9,10E)temel seviyelerin altındaydı, büyük olasılıkla 36 h'de daha yüksek polimorfo-nükleer CD61 ve Ki-67 ekspresyonu nedeniyle (Şekil 9). Son olarak, BAL anjiyostatinin hücresel floresan yoğunluğu, akciğer inflamatuar yanıtı sırasında bu metalloproteinaz bölünmüş plazminojen parçasında spesifik bir artış olduğunu gösteren hem 24 hem de 36 h'de (p<0.01 vs 0 h, Şekil 9,10F)sürekli olarak yüksekti.
Kombine maruziyetler geniş yayılmış akciğer hasarı üretir: Akciğer histolojisi, kombine maruziyetlerin H&E lekeli kriyoseksiyonlarda görüldüğü gibi akciğerlerde uzun süreli hasar ürettiğini ortaya koydu (Şekil 11). Bronşiyolar ve alveolar septal hasar beklenmesine rağmen, maruziyetten sonra 36 saat boyunca daha büyük damarların endotel hasarını gözlemlemek için süprizing oldu(Şekil 11). Hasarlı alveolar septal ve peri-bronşiyolar bölgelerde yapışkan intravasküler lökositler, lökosit agregaları (nötrofiller dahil) yamaları vardı (Şekil 11).
Şekil 1: Bölmeli lökosit sayısı: A) Broncho-alveolar lavaj (BAL) toplam lökosit sayısı 0 (yani taban çizgisi), 4, 24, 36 ve 72 saat olarak birleştirildikten sonra 0.05 ppb ozon (O3)ve 50 μg intranazal LPS farelere maruz kalma. B) Akciğer vasküler perfüzyon (LVP) toplam lökosit konsantrasyonu 0 (yani taban çizgisi), 4, 24, 36 ve 72 saat kombine 0.05 ppb ozon (O3)ve 50 μg intranazal LPS farelere maruz kaldıktan sonra. C) Periferik kan (PB) toplam lökosit konsantrasyonu 0 (yani taban çizgisi), 4, 24, 36 ve 72 saat kombine 0.05 ppb ozon (O3)ve 50 μg intranazal LPS farelere maruz kaldıktan sonra. D) Sternal kemik iliği (BM) toplam lökosit konsantrasyonu 0 (yani taban çizgisi), 4, 24, 36 ve 72 saat kombine 0.05 ppb ozon (O3)ve 50 μg intranazal LPS farelere maruz kaldıktan sonra. E) Femur kemik iliği (BM) toplam lökosit konsantrasyonu 0 (yani taban çizgisi), 4, 24, 36 ve 72 saat kombine 0.05 ppb ozon (O3)ve 50 μg intranazal LPS farelere maruz kaldıktan sonra. A-E grafikleri için 0 h mavi, 4 h kırmızı, 24 h yeşil, 36 h mor ve 72 h turuncu veri noktalarında temsil edilir; * s<0.05 ve ** s<0.01. F) Dapi (mavi), CX3CR1 (yeşil) ve Siglec-F (kırmızı) ile çekirdekler için boyandığında mononükleer ve polimorfonuklear hücreleri gösteren 24 saat pozlamadan temsili BAL sitospin slaytı. CX3CR1 ve Siglec-F birleştirmesinin turuncu-sarı olarak gösterildiğini unutmayın. Mononükleer hücrelerin çoğu, alveoler makrofajların bir özelliği olan Siglec-F için pozitiftir. Ölçek çubuğu = 50 μm. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Toplam Protein nicelemesi: A) Bronkoalveoler lavaj (BAL) toplam protein içeriği ve B) Akciğer vasküler perfüzyon (LVP) toplam protein konsantrasyonuPierce 660 nm protein testi (Termosintifik, IL, ABD) tarafından tahmin edildi. A-B grafikleri için 0 h mavi, 4 h kırmızı, 24 h yeşil, 36 h mor ve 72 h turuncu veri noktalarında temsil edilir; * s<0.05. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: Akciğer Eotaxin-2 ve IL-2 kemokin gradyanları: 33 kemokin dışında, akciğer vasküler perfüzyon (LVP) ve bronkoalveoler lavaj (BAL) ve sıvıda 0,05 ppb ozon (O3)ve 50 μg intranazal LPS farelere maruz kaldıktan sonra önemli ölçüde değiştirilmiş iki kemokin A) LVP eotaxin-2, B) BAL eotaxin-2, C) LVP IL-2 ve D) BAL IL-2. Veriler tek yönlü anova ile analiz edildi ve birden fazla değişkenin yanlış keşif oranı için p değeri Benjamini ve Hoshberg düzeltmesine göre ayarlandı. A-D grafikleri için 0 h mavi, 4 h kırmızı, 24 h yeşil, 36 h mor ve 72 h turuncu veri noktalarında temsil edilir. Bonferroni'nin düzeltilmesinden sonra çift yönlü karşılaştırmalar analiz edildi. * p<0.05'i, ** p<0.01'i temsil eder. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: Akciğer vasküler perfüzyon kemokin konsantrasyonları: On kemokin konsantrasyonu değiştirildi, ancak sadece akciğer vasküler perfüzyon (LVP) bölmesinde. A) Eotaxin-1, B) TNFα, C) IFNφ, D) CX3CL1, E) CCL27, F) IL-16, G) CXCL5, H) CXCL10, I) SDF1α ve J) MIP3β. A-J grafikleri için 0 h mavi, 4 h kırmızı, 24 h yeşil, 36 h mor ve 72 h turuncu veri noktalarında temsil edilir. Bonferroni'nin düzeltilmesinden sonra çift yönlü karşılaştırmalar analiz edildi. * p<0.05'i, ** p<0.01'i temsil eder. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 5: Bronkoalveolar lavaj (BAL) sitospin aktin/tübulin ve azaltılmış mitotracker boyama: A) 0 h ve B)'den gelen inaktin/tubulin lekeli BAL sitospinlerinin temsili görüntüleri 0,05 ppb ozon (O3)ve 50 μg intranazal LPS farelere maruz kaldıktan sonra 4 saat. DAPI'nın mavi, actin'in yeşil ve tübulin kırmızı renkte gösterildiğini unutmayın. Farelere 0,05 ppb ozon (O3)ve 50 μg intranazal LPS maruziyetinin toplamından sonra A) 0 h ve B) 4 h'den bal sitospinleri lekeli mitotracker lekeli temsili görüntüler. DAPI'nın mavi renkte ve azaltılmış mitotracker'ın kırmızı renkte gösterildiğini unutmayın. Ölçek çubuğu = 50 μm. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 6: Bronkoalveolar lavaj (BAL) sitoskeletal protein ve döngüsellik analizi: Aktin ve tübulin için lekelenmiş BAL sitospinleri DAPI normalleştirilmiş parametreleri için analiz edildi, yani, A) Actin'den DAPI floresan yoğunluğuna (FI) oranı 0 ve 4 saat, B) Tubulin ila DAPI floresan yoğunluk (FI) oranı 0 ve 4 h ve C) BAL hücre hücreselliği 0 (n=75 hücre), 2 (n=105 hücre), 4 (n=66 hücre), 24 (n=31 hücre), 36 (n=154 hücre) h. O3 ve LPS maruziyetlerinden hemen sonra birkaç pilot deney de yapıldığı için, yani 2 saat zaman noktasında, O3'ünhemen etkilerini vurgulamak için 2 saat zaman noktasından bazı çok erken BAL hücresellik analizi de dahil ettik. A-C grafikleri için 0 h mavi, 2 h kırmızı, 4 h yeşil, 24 h mor ve 36 h turuncu veri noktalarında temsil edilir. * p<0.05'i, ** p<0.01'i temsil eder. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 7: Bronkoalveoler lavaj (BAL) hücre içi ve plazma membran durumu: BAL hücreleri, O 3 ve LPS maruziyetlerinden sonra A) 0, B) 24 ve C) 36 h'deki temsili üst görüntü panellerinde gösterildiği gibi hayati lekeler, kalsein (yeşil) ve ethidyum homodimerler/ ETHHD (kırmızı) için boyandı. Ölçek çubuğu = 200 μm. BAL sitospinleri DAPI (mavi), ATPα (yeşil) ve Ly6G (kırmızı) için immünositildi. Temsili görüntüler, O3 ve LPS pozlamalarından sonra A) 0 ve B) 24 saat'teki alt görüntü panellerinde gösterilir. Ölçek çubuğu = 50 μm. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 8: Bronkoalveoler lavaj (BAL) mitokondriyal protein ATPα, lizozomal protein Ly6G ve hücre büyüklüğü analizi: bağışıklık sistemi baskılanmış BAL hücreleri, DAPI'nın A) ATPα ila DAPI floresan yoğunluk (FI) oranı ve B) Ly6G'nin DAPI FI oranına hesaplaması için normalleştirildi, O3 ve LPS maruziyetlerinden sonra 0 ve 24 h. İmmünostained BAL hücreleri de A) en uzun yani gelincik çapı ve B) çevresi için, O 3 ve LPS maruziyetlerinden sonra 0, 2, 4, 24 ve36 h'de analiz edildi. A-D grafikleri için mavide 0 h (n=119 hücre), kırmızıda 2 h (n=105 hücre), yeşilde 4 h (n=66 hücre), morda 24 h (n=309 hücre) ve turuncu veri noktalarında 36 h (n=154 hücre) temsil edilir. * p<0.05'i, ** p<0.01'i temsil eder. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 9: Bronkoalveoler lavaj (BAL) hücre içi fenotipleme: BAL hücreleri, O3 ve LPS maruziyetlerinden sonra DAPI (mavi), NK1.1 (yeşil), Gr1 (kırmızı) ve CX3CR1 (macenta)'daki temsili üst görüntü panellerinde gösterildiği gibi immünostain edildi. Ölçek çubuğu = 50 μm. BAL sitospinleri ATPβ (mavi), Ki-67 (yeşil), CD61 (kırmızı) ve anjiyostatin (macenta) için immünostain edildi. Temsili görüntüler A) 0, B) 24 ve C) O 3 ve LPS pozlamalarından sonra 36 saat alt görüntü panellerinde gösterilir. Ölçek çubuğu = 50 μm. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 10: Bronkoalveoler lavaj (BAL) mitokondriyal protein ATPβ, lizozomal protein Gr1, hücre içi CX3CR1 ve anjiyostatin analizi: BAĞıŞıKLıK SISTEMINEZ BAL hücreleri, DAPI'nın A) NK1.1 ila DAPI floresan yoğunluk (FI) oranı, B) Gr1'den DAPI FI oranına ve C) CX3CR1'den DAPI FI oranına, O 3 ve LPS maruziyetlerinden sonra 0, 24 ve36 s'de hesaplaması için normalleştirildi. A) ATPβ ila DAPI floresan yoğunluk (FI) oranı B) Ki-67 ila DAPI FI oranı ve B) Anjiyostatin (ANG) ile DAPI FI oranı arasında, O3 ve LPS maruziyetlerinden sonra 0, 24 ve 36 saatte hesaplanarak CD61 için immünostainlenmiş BAL hücreleri normalleştirildi. A-F grafikleri için 0 h (n=21 hücreler) mavi, 24 h (n=796 hücre) kırmızı ve 36 h (n=2692 hücreler) yeşil veri noktalarında temsil edilir. * p<0.05'i, ** p<0.01'i temsil eder. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 11: Akciğer hematoksilin ve eozin (H&E) histolojisi. Ozon (O3)ve LPS indüklenen akciğer kriyoseksiyon H&E histolojisi 0, 24 ve 36 h'de kombine O3 ve LPS maruziyetlerinden sonra. Alveoler epitel hasarı bölgeleri katı siyah oklar ve endotel hasarı siyah ok kafaları ile işaretlenir. Sarı yıldız işaretleri (*), alveolar septal bölgelerdeki lökosit yamalarını temsil eder. A = alveolar boşluk, B = bronş, V = vaskülat, ölçek çubuğu = sol el görüntü panelleri için 100 μm ve sağ taraftaki görüntü panelleri için 50 μm. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
| S.No. | Birincil Antikor | İnvitrojen sekonder antikor |
| 1 | Fare anti-NK1.1 IgG2a kappa (klon PK136), Invitrogen Katalog No. 16-5941-82 | Alexa 488 konjuge keçi anti-fare IgG (H +L), Katalog No. A11002 |
| 2 | Sıçan anti-Ly6G/Ly6C (Gr1) IgG2b kappa (klon RB6-8C5), Invitrogen Katalog No. 53-5931-82 | Alexa 568 konjuge keçi anti-sıçan IgG (H + L), Katalog No. A11077 |
| 3 | Tavşan anti-CX3CR1 IgG (RRID 467880), 14-6093-81 numaralı Invitrojen Kataloğu | Alexa 633 konjuge keçi anti-tavşan IgG (H +L), Katalog No. A21070 |
| 4 | Fare anti-ATP5A1 IgG2b (klon 7H10BD4F9), Invitrogen Katalog No. 459240 | Alexa 488 konjuge keçi anti-fare IgG (H +L), Katalog No. A11002 |
| 5 | Sıçan anti-Ly6G IgG2a kappa (klon 1A8), Invitrogen Katalog No. 16-9668-82 | Alexa 568 konjuge keçi anti-sıçan IgG (H + L), Katalog No. A11077 |
| 6 | Fare anti-ATP5β IgG2b (klon 3D5AB1), Termofisher Katalog No. A-21351 | Alexa 350 konjuge keçi anti-fare IgG (H + L), Katalog No. A11045 |
| 7 | Sıçan anti-Ki-67 (klon SolA15) IgG2a kappa, Invitrogen Katalog No. 14-5698-82 | Alexa 568 konjuge keçi anti-sıçan IgG (H + L), Katalog No. A11077 |
| 8 | Ermeni hamster anti-CD61 (klon 2C9. G2) IgG1 kappa, BD Katalog No. 553343 | Alexa 568 konjuge keçi anti-hamster IgG (H + L), Katalog No. A21112 |
| 9 | Tavşan anti-anjiyostatin (fare aa 98-116) IgG, Abcam Katalog No. ab2904 | Alexa 633 konjuge keçi anti-tavşan IgG (H +L), Katalog No. A21070 |
Tablo 1: Örneklerden hazırlanan sitospinleri lekelemede kullanılan primer ve ikincil antikor kombinasyonları.
| Okuma | BAL | LVP | Pb | SBM | FBM |
| Tlc | * | * | + 24 saat; - 36, 72 saat | + 72 saat | |
| Nötrofil | + 24, 36, 72 saat | + 24 saat | * | + 4, 24, 36, 72 saat | + 4, 24, 36, 72 saat |
| protein | + 36 saatte | * | n.d. | n.d. | n.d. |
| Kemokin profili | - Eotaxin-2 için, IL-2 4, 24, 36, 72 saat | + Eotaxin-1/2, IL-2, TNFα, IFNφ, CX3CL1, CCL27, IL-16, CXCL5, CXCL10, MIP3β için 4 saat; + 36 saat SDF1α için | n.d. | n.d. | n.d. |
| Hücre boyutu | + 4 saatte; - 24, 36 saat | n.d. | n.d. | n.d. | n.d. |
| ATPα | - saat 24'te | n.d. | n.d. | n.d. | n.d. |
| NK1.1/Ki-67 | + 24 saat | n.d. | n.d. | n.d. | n.d. |
| ATPβ/Gr1/CX3CR1/ANG | + 24, 36 saat | n.d. | n.d. | n.d. | n.d. |
Tablo 2: Çalışmanın ana bulgularının farklı bölmelerde kapsamlı bir özeti. * değişiklik olmadığını, + bir artışa ve - ölçülen parametrelerde bir azalmaya neden olduğunu gösterir. BAL bronko-alveolar lavaj sıvısını, LVP akciğer vasküler perfüzyonu, PB periferik kanı, SBM sternum kemik iliğini ve FBM femur kemik iliği bölmesini gösterir.
Ek Şekil 1: Gr1 ve CD11b immünostaining: Dapi (mavi), Gr1 (yeşil) ve CD11b (kırmızı) floresan immünospin sitospin slaytlar akciğer vasküler perfüzyon (LVP), sternal kemik iliği (BM) ve femur kemik iliği (BM) bölmelerinden temsili görüntüler 0, 4 ve 24 saat kombine O3 ve LPS maruz kalmalarından sonra. Ölçek çubuğu = 50 μm. Bu Dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.
Tamamlayıcı Film 1 0 h zaman noktasından (yani taban çizgisi) bal makrofajlarının üç boyutlu işlenmiş hacmi, çekirdeği (mavi ile gösterilir) gösterir ve ATPα (yeşil renkle gösterilir) ve Ly6G (kırmızı ile gösterilir) için immünostained. Bu Filmi indirmek için lütfen tıklayınız.
Tamamlayıcı Film 2: O3 ve LPS maruziyetlerinin toplamından sonra 24 saat zaman noktasından bal makrofajlarının üç boyutlu işlenmiş hacmi, çekirdek (mavi ile gösterilir) ve ATPα (yeşil renkle gösterilir) ve Ly6G (kırmızı ile gösterilir) için immünostained gösterir. Nükleer ATPα pozitif cisimlerin yanı sıra parçalanmış bir hücrenin varlığına dikkat edin. Bu Filmi indirmek için lütfen tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Mevcut çalışmada sunulan yöntemler, akciğer iltihabı sırasında birden fazla hücresel olayı incelemek için çoklu bölme analizinin yararlılığını vurgulamaktadır. Bulguları Özetledik Tablo 2. Biz ve birçok laboratuvar, akciğer nötrofillerinin hızlı bir şekilde işe alınmasıyla işaretlenen intranazal LPS aşılamasına verilen murine yanıtı kapsamlı bir şekilde inceledik, bu da 6-24 saat arasında zirve yaptı ve ardından çözünürlük devreye girer. Ve son zamanlarda, alt klinik O3'ün (2 saat için 0,05 ppm'de) tek başına C57BL/6NJ alt suşu15'teönemli akciğer hasarına neden olabileceğini gösterdik Akciğer damar bölmesinde nötrofillerin bölünmesiyle işaretlenirken, BAL'da hasarlı makrofajlar ve döküntüler gözlendi, böylece O3'ünenflamatuar potansiyelini gösteriyor. Bu modelde, O3 indüklenen alveoler epitel hasarı ve alveolar makrofajlar tarafından ortaya çıkan fagositoz sonucu alveolar bölmede nötrofillerin olmadığını gözlemledik. O3 modelinde hücre dışı DNA ve döküntü gözlemlemekle kalmadık, BAL makrofajları yüksek IL-16 seviyeleriyle ilişkili dismorfikti, bu da genellikle ölen nötrofiller tarafından salınan bir alarmindi. Bu nedenle, bu alt klinik O 3 seviyelerinin, supra-fizyolojik O3 seviyelerinde belirtildiği gibi, aksi takdirde sağlam C57BL / 6J alt suşunda bağışıklık yanıtını etkileyip etkileyemeyeceği önemlidir21. Pulmonerde O3 ve intranazal bakteriyel endotoksin indüklenen nötrofil alımının yanı sıra sistemik bölmelerde bal'da hasarlı nötrofillerin varlığı, akciğer vasküler perfüzat, sternal ve femur kemik iliği bölmelerinin 4 saatten başlayarak 24, 36 ve 72 saatte yüksek kaldığını gözlemledik. Hücresel hasar kortikal akrin ve lamellipodia kaybı ve BAL lökositlerinde hücre boyutunda artış olarak temsil edildi; BAL bölmesinde analiz edilen nötrofiller, mikrotübül, ATP sintaz kompleks V alt birliği α (ATPα) ve aktif mitokondriyal lekeye pozitif reaktiviteyi önemli ölçüde azalttı. Akciğerler, hücresel ATP sintaz kompleks V alt birliğini β n (ATPβ) yanı sıra ATPβ ligand, anjiyostatin(Tablo 2)ekspresyonunun ekspresyonunun yanı sıra bu kombine maruziyete uyum sağlar.
enflamasyonu incelemenin önemli bir yönü, kemokin gradyanları ile birlikte hücresel nekrozu anlamaktır. Periferik kan ve uyluk kemiği iliği bölmesi dışında toplam lökosit sayısının farklı olmadığını belirtmek ilginçti. Bu gözlemler hücresel sitoskeletal örüntüleri, boyutunu ve immünofonotipsiyi araştırmamıza neden oldu. BAL hücrelerinde hücresel hasara işaret eden lamellipodia ve aktif mitokondri kaybı gözlemledik. Kortikal aktiin organizasyonu, hücresel sinyalizasyonun ve ortaya çıkan bariyer özelliklerinin önemli bir özelliğidir. Sitoskeletal düzensizlik, nekrozun değerlendirilmesi kadar açık olmadığında hücre hasarının iyi bir göstergesidir. 36 saat boyunca bile BAL hücreleri, ethidyum homodimer lekeleme ile belirtilen plazma zarını tehlikeye atmıştı. Kombine maruziyetlerden hemen sonra, BAL'daki nötrofiller Gr1 pozitifliği gösterdi, ancak CD11b için esasen negatif bir lekeleme gösterdi, bu da önde gelen kenara doğru lokalize olur ve alveolar septal taramada yardımcı olur22. Böylece, kombine maruziyetler CD11b proteinden yoksun atipik nötrofillerin birikmesine yol açar. LPS, CD11b'nin küçültülmesine neden olmaz. Bu nedenle, bu özellik muhtemelen nötrofillere O3 indüklenmiş hasarının bir sonucudur.
BAL hücreleri, 0 h'ye kıyasla 24 saat(Tablo2) daha yüksek NK1.1, Ki-67 ve ATPβ boyama ile benzersiz bir protein imzasına sahipti. BAL hücreleri, Gr1, CX3CR1 ve anjiyostatin ekspresyonunun 0 h ile karşılaştırıldığında 24 ve 36 h'de daha yüksek ifadesine sahipti (Tablo 2). Bu bulgular BAL'da maruziyet sonrası 24 ve 36 saatlerde giderek daha fazla Gr1 pozitif nötrofil varlığı ile doğrulanmıştır(Tablo 2). NK1.1, CX3CR1 ve Gr1 pozitif hücrelerinin varlığı, 24 saat, BAL'da hem mononükleer hem de polimorforükleer hücrelerin işe alımını gösterir. Hem Ki-67 hem de anjiyostatinin belirteç olarak dahil edilmesi, BAL'da sırasıyla proliferatif vs anti-anjiyojenik milieu hakkında bizi bilgilendirdi. Bu nedenle, kombine O3 ve LPS maruziyetleri, nötrofilik infiltrasyon nedeniyle muhtemelen makrofajların çoğalmasına ve ardından anti-anjiyojenik milieu'ya yol açar. ATPβ lekelemedeki geçici artış, BAL lökositlerinin 24 saatte daha fazla sağkalıma doğru önemli bir adaptasyona işaret edebilir. ATPβ'nin anjiyostatin'e bağlanabileceği ve uzun süreli sağkalım6,23 ,aslında 36saat maruziyet sonrası alt Ki-67 indeksine yansıdığı belirtilmelidir.
BAL proteini diğer zaman noktalarında değil, 36 saatte en yüksek olmasına rağmen, akciğer vasküler perfüzyon maruz kalmadan önce veya sonra protein konsantrasyonunda herhangi bir değişiklik göstermedi. Vasküler bölmenin etkilenmemiş olması mümkündür, ancak bu büyük olasılıkla O 3 indüklenmiş serbest radikaller ve ortaya çıkan yüzey aktif proteinler (SP-A, SP-B) bozulması ve vasküler sızıntı 24 ,25 ,26tarafından metiyonin, histidin ve sistein gibi elektron bakımından zengin amino asitlerinoksidasyonunedeniyle karışıktır. BAL IgM, BAL yüzey aktif proteinleri, BAL albümin veya boya ekstravazasyonu (Evans mavisi veya floresan izo-tiyosiyanat (FITC) dektranı kullanılarak) epitel ve endotel bütünlüğünü değerlendirmek için alternatif yöntemlerdir.
İlginçtir ki, akciğer vasküler perfüzyon düzeyleri eotaxin-2 ve IL-2 4 saat zaman noktasında akut olarak yükseltildi. BAL eotaxin-2 ve IL-2 düzeyleri maruziyet sonrası önemli ölçüde azaldı, bu da alveolar alanda bozulma veya akciğer vaskülatında tuzak olduğunu gösterdi. Akciğer vasküler perfüzyonda analiz edilen daha fazla kemokin, eozinofil kemokinin (eotaxin-1), TNFα'nın daha yüksek seviyelerini ortaya koydu. IFNφ, lenf nodu türetilmiş mononükleer hücre kemokinleri (CX3CL1, CXCL10, CCL27, MIP3β), epitel türevli nötrofil kemokin (CXCL5) ve nötrofillerin ikincil nekrozuna maruz kaldıktan sonra salınan alarmin (IL-16)27, ancak maruz kaldıktan sonra sadece 4 saat. 36 saat sonra, kemik iliği türetilmiş pan-lökosit kemokin, SDF1α28, akciğer vasküler perfüzyonda daha yüksekti. Kemik iliği türevi SDF1α konsantrasyonları sitoloji bulguları ile ilişkilidir ve böylece CD11b ve Gr1 pozitif hücreleri maruziyet sonrası 24 ve 36 saat bol miktarda bulunur. Böylece kemokin ve sitolojik profiller kemik iliği bölmelerinden önemli lökosit mobilizasyonunu yansıtır (Tablo 2).
Hayvan modelimiz ve araştırma bulgularımız, kentsel ortamlarda yaşayan canlıların muhtemelen bu tür klinik altı O3 ve enfeksiyöz ajanlara maruz kaldığı gerçek dünya durumlarını akılda tutarak hayati öneme sahiptir8. Murine modelimiz, COVID-19 enfeksiyonlarında olduğu gibi, invaziv hücre ölümü ve enfeksiyonlarının pulmoner ve ekstra pulmoner mekanizmalarını incelemek için seviye-2 muhafaza laboratuvarlarında çoğaltılabilen kolayca erişilebilir bir prototip olarak hizmet vermektedir29. Gelecekteki çalışmalar, uzun süreli hücresel adaptasyonları araştırmak için onarım veya geç faz takibinin yanı sıra kronik maruziyetleri görselleştirmeye yönelik olmalıdır. Bu nedenle, canlı organ15 ve hayvan16,30,31görüntüleme tekniklerini içeren kapsamlı akciğer iltihabı çalışmaları için, mevcut son nokta çalışma tasarımı, kombine düşük doz O3 (hücre ölümü) ve LPS'ye (immün stimülasyon) konak yanıtı hakkında hayati içgörüler sağlayabilir ve böylece akut akciğer yaralanması mekanizmalarını deşifre edebilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların çıkar çatışması veya açıklama yapmalarına gerek yoktur.
Acknowledgments
Yapılan araştırma, Başkan'ın NSERC hibesinin yanı sıra Sylvia Fedoruk Kanada Nükleer İnovasyon Merkezi'nden başlangıç fonları ile finanse ediliyor. Sylvia Fedoruk Kanada Nükleer İnovasyon Merkezi Innovation Saskatchewan tarafından finanse ediliyor. Floresan görüntüleme, NSERC tarafından finanse edilen WCVM Görüntüleme Merkezi'nde gerçekleştirildi. Jessica Brocos (MSc Student) ve Manpreet Kaur (MSc Student), Sylvia Fedoruk Kanada Nükleer İnovasyon Merkezi'nin başlangıç fonları tarafından finanse edildi.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 33-plex Bioplex chemokine panel | Biorad | 12002231 | |
| 63X oil (NA 1.4-0.6) Microscope objectives | Leica | HCX PL APO CS (11506188) | |
| Alexa 350 conjugated goat anti-mouse IgG (H+L) | Invitrogen | A11045 | |
| Alexa 488 conjugated goat anti-mouse IgG (H+L) | Invitrogen | A11002 | |
| Alexa 488 conjugated phalloidin | Invitrogen | A12370 | |
| Alexa 555 conjugated mouse anti-α tubulin clone DM1A | Millipore | 05-829X-555 | |
| Alexa 568 conjugated goat anti-hamster IgG (H+L) | Invitrogen | A21112 | |
| Alexa 568 conjugated goat anti-rat IgG (H+L) | Invitrogen | A11077 | |
| Alexa 633 conjugated goat anti-rabbit IgG (H+L) | Invitrogen | A21070 | |
| Armenian hamster anti-CD61 (clone 2C9.G2) IgG1 kappa | BD Pharmingen | 553343 | |
| C57BL/6 J Mice | Jackson Laboratories | 64 | |
| Confocal laser scanning microscope | Leica | Leica TCS SP5 | |
| DAPI (4′,6-diamidino-2-phenylindole) | Invitrogen | D1306 | aliquot in 2 µl stocks and store at -20°C |
| Inverted fluorescent wide field microscope | Olympus | Olympus IX83 | |
| Ketamine (Narketan) | Vetoquinol | 100 mg/ml | Dilute 10 times to make a 10 mg/ml stock |
| Live (calcein)/Dead (Ethidium homodimer-1) cytotoxicity kit | Invitrogen | L3224 | |
| Mouse anti-ATP5A1 IgG2b (clone 7H10BD4F9) | Invitrogen | 459240 | |
| Mouse anti-ATP5β IgG2b (clone 3D5AB1) | Invitrogen | A-21351 | |
| Mouse anti-NK1.1 IgG2a kappa (clone PK136) | Invitrogen | 16-5941-82 | |
| Pierce 660 nm protein assay | Thermoscientific | 22660 | |
| Rabbit anti-angiostatin (mouse aa 98-116) IgG | Abcam | ab2904 | |
| Rabbit anti-CX3CR1 IgG (RRID 467880) | Invitrogen | 14-6093-81 | |
| Rat anti-Ki-67 (clone SolA15) IgG2a kappa | Invitrogen | 14-5698-82 | |
| Rat anti-Ly6G IgG2a kappa (clone 1A8) | Invitrogen | 16-9668-82 | |
| Rat anti-Ly6G/Ly6C (Gr1) IgG2b kappa (clone RB6-8C5) | Invitrogen | 53-5931-82 | |
| Rat anti-mouse CD16/CD32 Fc block (clone 2.4G2) | BD Pharmingen | 553142 | |
| Reduced mitotracker orange | Invitrogen | M7511 | |
| Xylazine (Rompun) | Bayer | 20 mg/ml | Dilute 2 times to make a 10 mg/ml stock |
References
- Bhattacharya, J., Matthay, M. A. Regulation and repair of the alveolar-capillary barrier in acute lung injury. Annual Review of Physiology. 75, 593-615 (2013).
- Aulakh, G. K.
- Aulakh, G. K., Suri, S. S., Singh, B. Angiostatin inhibits acute lung injury in a mouse model. American Journal of Physiology - Lung Cellular and Molecular Physiology. 306 (1), 58-68 (2014).
- Schneberger, D., Aulakh, G., Channabasappa, S., Singh, B. Toll-like receptor 9 partially regulates lung inflammation induced following exposure to chicken barn air. Journal of Occupational Medicine and Toxicology. 11 (1), 1-10 (2016).
- Shah, D., Romero, F., Stafstrom, W., Duong, M., Summer, R. Extracellular ATP mediates the late phase of neutrophil recruitment to the lung in murine models of acute lung injury. American Journal of Physiology - Lung Cellular and Molecular Physiology. 306 (2), 152-161 (2014).
- Aulakh, G. K., Balachandran, Y., Liu, L., Singh, B. Angiostatin inhibits activation and migration of neutrophils. Cell Tissue Research. , (2013).
- Cakmak, S., et al. Associations between long-term PM2.5 and ozone exposure and mortality in the Canadian Census Health and Environment Cohort (CANCHEC), by spatial synoptic classification zone. Environment International. 111, 200-211 (2018).
- Dauchet, L., et al. Short-term exposure to air pollution: Associations with lung function and inflammatory markers in non-smoking, healthy adults. Environment International. 121, Pt 1 610-619 (2018).
- Delfino, R. J., Murphy-Moulton, A. M., Burnett, R. T., Brook, J. R., Becklake, M. R. Effects of air pollution on emergency room visits for respiratory illnesses in Montreal, Quebec. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 155 (2), 568-576 (1997).
- Peterson, M. L., Harder, S., Rummo, N., House, D. Effect of ozone on leukocyte function in exposed human subjects. Environmental Research. 15 (3), 485-493 (1978).
- Rush, B., et al. Association between chronic exposure to air pollution and mortality in the acute respiratory distress syndrome. Environmental Pollution. 224, 352-356 (2017).
- Rush, B., Wiskar, K., Fruhstorfer, C., Celi, L. A., Walley, K. R. The Impact of Chronic Ozone and Particulate Air Pollution on Mortality in Patients With Sepsis Across the United States. Journal of Intensive Care Medicine. , (2018).
- Stieb, D. M., Burnett, R. T., Beveridge, R. C., Brook, J. R. Association between ozone and asthma emergency department visits in Saint John, New Brunswick, Canada. Environmental Health Perspectives. 104 (12), 1354-1360 (1996).
- Thomson, E. M., Pilon, S., Guenette, J., Williams, A., Holloway, A. C. Ozone modifies the metabolic and endocrine response to glucose: Reproduction of effects with the stress hormone corticosterone. Toxicology and Applied Pharmacology. 342, 31-38 (2018).
- Aulakh, G. K., Brocos Duda, J. A., Guerrero Soler, C. M., Snead, E., Singh, J. Characterization of low-dose ozone-induced murine acute lung injury. Physiological Reports. 8 (11), 14463 (2020).
- Aulakh, G. K., et al. Quantification of regional murine ozone-induced lung inflammation using [18F]F-FDG microPET/CT imaging. Scientific Reports. 10 (1), 15699 (2020).
- Charavaryamath, C., Keet, T., Aulakh, G. K., Townsend, H. G., Singh, B. Lung responses to secondary endotoxin challenge in rats exposed to pig barn air. Journal of Occupational Medicine and Toxicology. 3, London, England. 24 (2008).
- Szarka, R. J., Wang, N., Gordon, L., Nation, P. N., Smith, R. H. A murine model of pulmonary damage induced by lipopolysaccharide via intranasal instillation. Journal of Immunological Methods. 202 (1), 49-57 (1997).
- Southam, D. S., Dolovich, M., O'Byrne, P. M., Inman, M. D. Distribution of intranasal instillations in mice: effects of volume, time, body position, and anesthesia. American Journal of Physiology - Lung Cellular and Molecular Physiology. 282 (4), 833-839 (2002).
- Aulakh, G. K. Lack of CD34 produces defects in platelets, microparticles, and lung inflammation. Cell Tissue Research. , (2020).
- Gilmour, M. I., Hmieleski, R. R., Stafford, E. A., Jakab, G. J. Suppression and recovery of the alveolar macrophage phagocytic system during continuous exposure to 0.5 ppm ozone. Experimental Lung Research. 17 (3), 547-558 (1991).
- Yipp, B. G., et al. The Lung is a Host Defense Niche for Immediate Neutrophil-Mediated Vascular Protection. Science Immunology. 2 (10), (2017).
- Lee, T. Y., et al. Angiostatin regulates the expression of antiangiogenic and proapoptotic pathways via targeted inhibition of mitochondrial proteins. Blood. 114 (9), 1987-1998 (2009).
- Hawkins, C. L., Davies, M. J. Detection, identification, and quantification of oxidative protein modifications. Journal of Biological Chemistry. 294 (51), 19683-19708 (2019).
- Hemming, J. M., et al. Environmental Pollutant Ozone Causes Damage to Lung Surfactant Protein B (SP-B). Biochemistry. 54 (33), 5185-5197 (2015).
- Oosting, R. S., et al. Exposure of surfactant protein A to ozone in vitro and in vivo impairs its interactions with alveolar cells. American Journal of Physiology. 262 (1), Pt 1 63-68 (1992).
- Roth, S., et al. Secondary necrotic neutrophils release interleukin-16C and macrophage migration inhibitory factor from stores in the cytosol. Cell Death & Discovery. 1, 15056 (2015).
- Kawaguchi, N., Zhang, T. T., Nakanishi, T. Involvement of CXCR4 in Normal and Abnormal Development. Cells. 8 (2), (2019).
- Gupta, A., et al.
- Aulakh, G. K., Kuebler, W. M., Singh, B., Chapman, D. 2017 IEEE Nuclear Science Symposium and Medical Imaging Conference (NSS/MIC). , 1-2 (2017).
- Aulakh, G. K., et al. Multiple image x-radiography for functional lung imaging. Physics in Medicine & Biology. 63 (1), 015009 (2018).
